低度黑莓果酒發(fā)酵菌株篩選與工藝優(yōu)化

韋夢(mèng)婷 王英 劉小莉

摘要：檢測(cè)釀酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1的耐糖、耐乙醇和耐SO2特性，再接種到黑莓汁中觀察實(shí)際發(fā)酵效果，綜合對(duì)比丹麥生物科技公司的商業(yè)發(fā)酵劑酵母RHYTHM.nsac，篩選出1株性能更優(yōu)良的菌株FM-S-115。以加糖量、酵母添加量和發(fā)酵溫度3個(gè)因素優(yōu)化發(fā)酵條件，考察主要營(yíng)養(yǎng)成分和感官品質(zhì)的變化，得出最適發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，F(xiàn)M-S-115為最適發(fā)酵菌種，加糖量8%、接種量7.0%，20 ℃是最適發(fā)酵溫度，該條件下發(fā)酵的果酒口感協(xié)調(diào)、色澤鮮艷、乙醇度適宜。

關(guān)鍵詞：低度黑莓果酒;釀酒酵母;發(fā)酵工藝

黑莓為薔薇科懸鉤子屬灌木，果實(shí)飽滿(mǎn)，豐富多汁，色澤宜人，香味濃郁，富含多種色素、有機(jī)酸和維生素以及多種礦物質(zhì)元素[1]。江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所于20世紀(jì)80年代從美國(guó)引入黑莓，通過(guò)數(shù)十年來(lái)的選育與試種，已基本掌握其生長(zhǎng)、結(jié)果習(xí)性，目前在江蘇省南京市溧水區(qū)有較大的種植面積[2]。黑莓皮薄汁多，采摘之后不易保藏，加工成果酒是其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要方向。

黑莓果酒是隨著黑莓的種植逐漸興起的新型食品，在原料的基礎(chǔ)之上，不僅富含多酚類(lèi)物質(zhì)，而且有著比其他果酒更有效的體外抗氧化的功效[3]。此外，黑莓中豐富的花青素也可預(yù)防心血管病，有效改善血管健康狀況，減少動(dòng)脈粥樣硬化，預(yù)防冠心病和中風(fēng)并降低患病風(fēng)險(xiǎn)[4]。低度果酒是乙醇含量比普通果酒低（體積分?jǐn)?shù)為1.0%～8.0%），而營(yíng)養(yǎng)成分基本不變的一類(lèi)新型果酒[5]，不僅符合中國(guó)居民膳食指南推薦的健康飲食習(xí)慣，也可供更多種類(lèi)人群食用，如青少年、老人等，是酒類(lèi)研究的熱點(diǎn)方向。本試驗(yàn)以釀酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1為發(fā)酵菌種，首先檢測(cè)該3株菌株的耐糖、耐乙醇和耐SO2的特性，再發(fā)酵黑莓汁，測(cè)量發(fā)酵前后殘?zhí)橇?、總酚含量、花色苷含量、單寧含量、乙醇度和顏?個(gè)理化指標(biāo)的變化，與科漢森（中國(guó)）有限公司的商業(yè)發(fā)酵劑釀酒酵母RHYTHM.nsac對(duì)比，以篩選出品質(zhì)能與RHYTHM.nsac相當(dāng)或者更優(yōu)的菌株。使用該菌株發(fā)酵黑莓汁，以加糖量、酵母添加量和發(fā)酵溫度3個(gè)因素優(yōu)化發(fā)酵工藝，測(cè)量果酒感官品質(zhì)，選擇感官品質(zhì)最好的為最適發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料 黑莓凍果（-18 ℃貯藏）（南京雙吉農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）;釀酒酵母FM-S-115、FY4和Lmb-1，保存于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室;商業(yè)發(fā)酵劑RHYTHM.nsac[科漢森（中國(guó)）有限公司]。

1.1.2 主要試劑 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;白砂糖（食品級(jí)，蘇果超市有限公司）;果膠酶（食品級(jí)，寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）;偏重亞硫酸鉀（食品級(jí)，上海杰兔工貿(mào)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600PC紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）;SW-CJ-1C雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;LHS-80HC-Ⅰ生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;YS6060臺(tái)式分光測(cè)色儀（深圳三恩時(shí)科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 本試驗(yàn)于2019年5—7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室完成。

1.3.2 黑莓果酒的制作工藝 冷凍黑莓果→解凍→打漿→調(diào)配（加白砂糖、果膠酶和焦亞硫酸鉀）→接種→發(fā)酵→原酒。

1.3.3 最佳釀酒酵母的篩選 通過(guò)測(cè)定酵母的耐糖、耐乙醇和耐SO2性能來(lái)篩選菌株。以PDB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別改變糖含量為2.0%、10.0%、140%、16.0%、18.0%和22.0%，改變乙醇含量為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%和12.0%，改變SO2濃度為300、400、500、600、700 mg/L，每組試驗(yàn)1個(gè)變量，其他條件保持一致，將預(yù)先活化好的菌液（菌體濃度為1.01×108～1.11×108 CFU/mL）以3%的接種量接入培養(yǎng)液中，28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)16 h，3組平行試驗(yàn)，測(cè)定菌體稀釋5倍下菌液的D600 nm。

檢測(cè)實(shí)際發(fā)酵中4株酵母性能。將4株菌以5%的接種量接種到黑莓汁中，觀察其發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的殘?zhí)橇俊⒖偡雍?、花色苷含量、單寧含量、色差和整體感官品質(zhì)。將FM-S-115、FY4與Lmb-1和商業(yè)發(fā)酵劑RHYTHM.nsac 為參照，選出最合適的發(fā)酵菌種。

1.3.4 低度黑莓果酒發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn) 以加糖量、酵母添加量和發(fā)酵溫度3個(gè)因素優(yōu)化發(fā)酵工藝。加糖量直接決定果酒的乙醇度，純黑莓汁的糖含量為110 g/L，選擇加糖量為0.0、4.0%和80% 3個(gè)梯度;酵母添加量選擇3.0%、5.0%、70%、9.0% 4個(gè)梯度;發(fā)酵溫度選擇20、25、30 ℃ 3個(gè)梯度。每組試驗(yàn)1個(gè)變量，其他條件須一致。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，殘?zhí)橇? g/L以下即為發(fā)酵結(jié)束，測(cè)量各指標(biāo)的變化。

1.3.5 低度黑莓果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)確定加糖量、酵母添加量和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素3個(gè)水平，借助正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ軟件，確定最適合低度黑莓果酒釀造的條件。正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.6 各指標(biāo)的檢測(cè)方法 殘?zhí)橇繙y(cè)定使用苯酚硫酸法，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。

總酚含量測(cè)定用Folin-酚試劑法，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。

花色苷含量測(cè)定使用pH值示差法，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

單寧含量測(cè)定采用甲基纖維素沉淀法。（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。以表兒茶素水溶液計(jì)，分別測(cè)濃度為0、10、25、50、75、100、150、200 mg/L的表兒茶素水溶液在280 nm下的吸光度，以表兒茶素水溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=0.009 81x+0.028 8，r2=0996 1。（2）樣品的單寧含量測(cè)定。2支試管，各取樣 200 μL，分別加入2 400 μL蒸餾水（對(duì)照組）和004%甲基纖維素（處理組），搖勻靜置3 min，各加1 600 μL飽和硫酸銨溶液，定容至8 mL。搖勻靜置10 min，離心10 min，轉(zhuǎn)速1 000 r/min，取上清液，測(cè)2支試管的D280 nm。

D280 nm（單寧）=D280 nm（對(duì)照組）-D280 nm（處理組）。（1）

乙醇度的測(cè)定采用蒸餾法，具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]。

色差的檢測(cè)方法。采用CIELab顏色參數(shù)[9]測(cè)定果酒的顏色。參考該方法使用色差儀測(cè)出參數(shù)L*（亮度）、a*（紅綠）和b*（黃藍(lán)）。總色差（ΔE*）是用來(lái)描述2組顏色整體對(duì)比差異的參數(shù)。

感官評(píng)定。根據(jù) GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析法[10]，分別從色澤、澄清度、香氣、滋味及典型性對(duì)黑莓果酒進(jìn)行感官評(píng)定（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 4株酵母的耐糖性能測(cè)定

果酒釀造，須適量添加果膠酶、葡萄糖和SO2，以助充分發(fā)酵和抑菌，釀酒酵母須對(duì)這3種物質(zhì)具有一定的耐性。由圖1看出，在10.0%～14.0%的添加量?jī)?nèi)，所有菌株生長(zhǎng)良好;大于14.0%時(shí)，生長(zhǎng)量開(kāi)始下降，與劉暢等試驗(yàn)得出在糖含量10.0%之后就開(kāi)始下降[11]相比，本試驗(yàn)的4株菌株耐糖性更高。雖總體趨勢(shì)相似，菌株之間各有不同，F(xiàn)M-S-115和RHYTHM.nsac的生長(zhǎng)量始終高于FY4和Lmb-1，且前者最適生長(zhǎng)濃度更高。

2.2 4株酵母的耐乙醇性能測(cè)定

由圖2可知，乙醇對(duì)酵母有抑制作用。在濃度為0.0～6.0%內(nèi)，所有菌株均能保持較高的生長(zhǎng)密度;6.0%～8.0%時(shí)開(kāi)始下降，F(xiàn)Y4和Lmb-1菌體密度下降速度緩慢，F(xiàn)M-S-115和RHYTHM. nsac下降迅速;乙醇濃度大于8.0%時(shí)，所有菌株的生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制;12.0%時(shí)，除了Lmb-1的D600 nm值還能保持在0.5左右，其他菌株均接近于0，基本停止生長(zhǎng)，可見(jiàn)Lmb-1相比其他幾株菌更耐乙醇，在釀造高度酒上具有很大優(yōu)勢(shì)。與李錚等的試驗(yàn)結(jié)果得出的乙醇耐受性達(dá)到16.0%[12]相比，本試驗(yàn)4株酵母耐受性較低，還有待馴化提高。然而在釀造低度果酒上，4株菌均能夠成為優(yōu)勢(shì)菌，完成發(fā)酵進(jìn)程。

2.3 4株酵母的耐SO2性能測(cè)定

由圖3可知，在300 mg/L以?xún)?nèi)，4株菌均有較高的耐受性;大于300 mg/L時(shí)，菌體密度下降明顯，但D600 nm值仍保持相對(duì)較高，在0.9左右?？梢?jiàn)，相比于吳啟鳳等研究得出僅有1株菌能在300 mg/L濃度下存活的結(jié)果[13]來(lái)說(shuō)，試驗(yàn)中4株菌均有較高的耐SO2性。雖FY4和Lmb-1的耐性略低于其他2株菌，在釀酒所需濃度內(nèi)，4株菌均能滿(mǎn)足發(fā)酵要求。

2.4 4株酵母的黑莓果酒發(fā)酵性能測(cè)定

在有氧的條件下，酵母通過(guò)呼吸作用將黑莓汁中的白砂糖轉(zhuǎn)化為乙醇和其他副產(chǎn)物，有些為有益副產(chǎn)物，賦予果酒獨(dú)特的芳香風(fēng)味，少量為有害產(chǎn)物，抑制酵母生長(zhǎng)，所以菌種不同，發(fā)酵產(chǎn)酒的風(fēng)味和口感各異[14]。由表3可知，4株菌中FM-S-115和RHYTHM.nsac感官品質(zhì)最好，作為1株較為成熟的發(fā)酵菌株，RHYTHM.nsac各活性物質(zhì)均損失較少，F(xiàn)M-S-115與之相比，各指標(biāo)大致相同，且FM-S-115發(fā)酵結(jié)束所需時(shí)間更短，發(fā)酵速度更快，這一點(diǎn)在實(shí)際生產(chǎn)中意義重大。

綜合耐糖、耐乙醇和耐SO2性能和菌株發(fā)酵黑莓果酒品質(zhì)分析的結(jié)果，菌株FM-S-115 的耐糖、耐乙醇和耐SO2性最好，發(fā)酵過(guò)程對(duì)黑莓中的活性物質(zhì)損失最小且乙醇度較高。和性能成熟的商業(yè)發(fā)酵劑RHYTHM. nsac相比，F(xiàn)M-S-115各方面性能與其接近，且發(fā)酵時(shí)間更短，因此選擇FM-S-115為低度黑莓果酒的最佳發(fā)酵菌種。

2.5 低度黑莓果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

2.5.1 加糖量對(duì)果酒發(fā)酵的影響 由表4可以看出，加糖量越高， 發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，乙醇度和總色差的變化明顯，未加糖處理組的初始總糖含量為118613 g/L，發(fā)酵時(shí)間短，結(jié)束時(shí)乙醇含量低，黑莓的酸味略重，酒香上略有欠缺;4.0%加糖量處理組的初始總糖含量為 222.613 g/L，發(fā)酵結(jié)束活性物質(zhì)花色苷、單寧損失較多，且感官品質(zhì)略差;8.0%的加糖量處理組的初始糖含量為286.347 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙醇度達(dá)到7.5%，含量適中，但總色差變化較明顯，色澤損失較多。整體感觀上，8.0%的加糖量的感觀評(píng)分最高，果酒澄清透明，有光澤，香氣純正、優(yōu)雅，酒體豐滿(mǎn)、醇厚協(xié)調(diào)，黑莓的酸味和酒體的香味融合較好，且乙醇度相對(duì)較低，符合市場(chǎng)需求，因此8.0%是最合適的加糖量。

2.5.2 酵母添加量對(duì)果酒發(fā)酵的影響 由表5可知，酵母添加量對(duì)各個(gè)指標(biāo)均有不同程度的影響。酵母添加量為3.0%和5.0%時(shí)，發(fā)酵時(shí)間略長(zhǎng);接種量為7.0%時(shí)，發(fā)酵時(shí)間最短，總酚、花色苷和單寧保留量最多，且感官評(píng)分最高;隨著接種量的繼續(xù)增大，感官評(píng)分開(kāi)始下降，可能原因是接種量過(guò)大導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一部分被用于酵母的增殖，而用于無(wú)氧呼吸發(fā)酵的減少，乙醇含量降低[15]，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量消耗和有害代謝產(chǎn)物積累，使發(fā)酵環(huán)境變差，從而導(dǎo)致菌體過(guò)早衰老自溶[16]。因此，試驗(yàn)中選擇7.0%為最適酵母添加量。

2.5.3 溫度對(duì)果酒發(fā)酵的影響 由表6可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母活性提高，發(fā)酵時(shí)間縮短，感官評(píng)分逐漸降低，在20 ℃時(shí)口感最好。溫度過(guò)低，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，易發(fā)酵不徹底;溫度過(guò)高會(huì)使酵母活動(dòng)加劇，導(dǎo)致酵母過(guò)早老化死亡，同時(shí)伴隨一些高級(jí)醇等副產(chǎn)物的產(chǎn)生，影響果酒的風(fēng)味和品質(zhì)[17]，因此選擇20 ℃為最適發(fā)酵溫度。

2.6 低度黑莓果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)

本研究選擇加糖量、酵母添加量、發(fā)酵溫度3個(gè)變量因素作為低度黑莓果酒品質(zhì)的影響因素。以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，按照表1進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，3個(gè)因素對(duì)黑莓果酒的感官評(píng)分的影響大小依次為發(fā)酵溫度、加糖量和酵母添加量，最佳組合為A2B2C2，即發(fā)酵溫度為20 ℃，加糖量8%，接種量為7%。由表8可知，發(fā)酵溫度、加糖量、酵母添加量對(duì)黑莓果酒感官評(píng)分影響都顯著（P<0.05）。