高通量基因序列在免疫抑制合并肺炎患者肺泡灌洗液感染病原中的應(yīng)用

周佳琦　馬肖龍

[摘要] 目的 探討高通量基因序列（NGS）聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者肺泡灌洗液感染病原中的應(yīng)用效果及ROC曲線分析。 方法 選擇2017年1月至2019年12月在我院治療的免疫抑制合并重癥肺炎患者50例為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組（25例）和觀察組（25例），對(duì)照組予經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗菌藥物治療，觀察組在對(duì)照組的基礎(chǔ)上予肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析方法檢測(cè)患者病原學(xué)并指導(dǎo)抗生素的使用。比較兩組生化指標(biāo)及不良反應(yīng)發(fā)生情況，繪制ROC曲線，分析肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析方法在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導(dǎo)效能。 結(jié)果 兩組治療后酸堿度（pH）水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。觀察組治療后白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞水平低于對(duì)照組，動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）、血氧飽和度（SaO2）水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察組患者不良反應(yīng)總發(fā)生率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導(dǎo)效能均高于單一NGS和質(zhì)譜分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析用于免疫抑制合并重癥肺炎患者的治療，能獲得良好的治療效果，降低并發(fā)癥發(fā)生率，可指導(dǎo)臨床治療，值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 肺泡灌洗液感染病原;高通量基因序列;質(zhì)譜分析;免疫抑制合并重癥肺炎;ROC曲線

[中圖分類號(hào)] R563.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）06-0038-04

Application of next generation sequencing in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with pneumonia

ZHOU Jiaqi? ?MA Xiaolong

Department of Respiratory Medicine， the First Hospital of Jiaxing in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314000， China

[Abstract] Objective To explore the application effect and ROC curve analysis of next generation sequencing （NGS） combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with severe pneumonia. Methods Fifty patients with immunosuppression combined with severe pneumonia from January 2017 to December 2019 treated in our hospital were selected as research subjects and randomly divided into the control group（n=25） and the observation group （n=25）. Empirical broad-spectrum antibacterial drug therapy was given to the control group， and NGS combined with mass spectrometry of alveolar lavage fluid infection pathogen was given to the observation group on the basis of the control group to detect the pathogen and guide the use of antibiotics. The ROC curve was drew， the therapeutic guidance effectiveness of NGS combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with severe pneumonia was analyzed， and the curative effect and the adverse reaction were compared in the two groups. Results It was found that there was no statistically significant difference in pH after treatment between the two groups（P>0.05）. The white blood cell count （WBC） and neutrophils after treatment in the observation group were statistically significant lower than those in the control group， the partial arterial oxygen pressure（PaO2） and the blood oxygen saturation（SaO2） after treatment in the observation group were statistically significant higher than those in the control group （P<0.05）. The incidence rates during the treatment in the observation group was statistically significant lower than that in the control group（P<0.05）. ROC curve result showed that the guidance effectiveness of NGS combined with mass spectrometry in patients with immunosuppression combined with severe pneumonia was statistically significant higher than that of single NGS and mass spectrometry （P<0.05）. Conclusion The application of NGS combined with mass spectrometry in alveolar lavage fluid infection pathogen of patients with immunosuppression combined with pneumonia has good curative effect， and can reduce the incidence of complications and guide the clinic treatment， which is worthy of popularization and application.

[Key words] Alveolar lavage fluid infection pathogen; Next generation sequencing; Mass spectrometry; Immunosuppression combined with pneumonia; ROC curve

肺炎的嚴(yán)重程度取決于局部炎癥程度、肺部炎癥的播散及全身炎癥反應(yīng)程度，肺炎患者如出現(xiàn)較為嚴(yán)重的低氧血癥或呼吸衰竭需要通氣支持，或出現(xiàn)低血壓、休克等循環(huán)衰竭表現(xiàn)，或出現(xiàn)其他器官功能障礙，均可判定為重癥肺炎[1]。對(duì)于免疫抑制合并重癥肺炎患者，由于其自身免疫調(diào)節(jié)異常，容易造成廣泛組織損傷，再加上患者治療時(shí)需要長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑，導(dǎo)致其細(xì)胞體液免疫受到抑制，造成機(jī)體抵抗力降低，容易增加感染發(fā)生率[2-3]。近年來，隨著腫瘤放化療技術(shù)、器官移植技術(shù)的發(fā)展及糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，免疫抑制患者呈增加及積累趨勢(shì)[4-5]。高通量基因序列（Next generation sequencing，NGS）技術(shù)具有檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋面廣及產(chǎn)出巨大等特點(diǎn)，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[6]。NGS分析和診斷能夠快速、精準(zhǔn)地診療急危重癥感染，而肽和蛋白的質(zhì)譜序列測(cè)定則具有快速、用量少及易操作等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。因此，本研究以免疫抑制合并重癥肺炎患者為研究對(duì)象，探討NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎中的應(yīng)用效果及ROC曲線分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年12月在我院治療的免疫抑制合并重癥肺炎患者50例為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組。對(duì)照組25例，男15例，女10例;年齡26～72歲，平均（53.25±2.26）歲;IgA腎病8例，膜性腎病10例，難治性腎病綜合征3例，狼瘡性腎炎4例。觀察組25例，男13例，女12例;年齡27～73歲，平均（54.41±2.34）歲;IgA腎病6例，膜性腎病11例，難治性腎病綜合征5例，狼瘡性腎炎3例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];②符合腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均伴有不同程度的免疫抑制，包括血液系統(tǒng)腫瘤、實(shí)體惡性腫瘤、腫瘤化療、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染、免疫抑制劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并精神異常、血液系統(tǒng)疾病或器質(zhì)性疾病;②合并認(rèn)知功能異常、自身免疫系統(tǒng)疾病或全身炎癥反應(yīng);③合并全身難以控制的感染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 方法

對(duì)照組：①早期經(jīng)驗(yàn)性給予廣譜抗菌藥物治療，再根據(jù)病原學(xué)檢查、藥敏試驗(yàn)及療效進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)整;②及時(shí)調(diào)整免疫抑制劑用量;③營(yíng)養(yǎng)支持，補(bǔ)充必要能量及維生素，糾正低蛋白血癥[10-11]。觀察組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上采用肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析方法檢測(cè)患者病原學(xué)，并指導(dǎo)抗生素的使用，具體方法如下：患者入組后，于局麻下將纖維支氣管鏡（北京科斯佳有限責(zé)任公司）插入右肺中葉或左肺舌段支氣管內(nèi)，將其項(xiàng)端契入支氣管分支開口，通過氣管活檢將100～250 mL 37℃生理鹽水緩慢注入，采用少量多次的原則注入，注入后給予適當(dāng)?shù)呢?fù)壓吸出，將吸出液收集在硅油處理后的容器中，快速送檢。采用肺泡灌洗液感染病原NGS（武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所）聯(lián)合質(zhì)譜分析方法檢測(cè)患者病原學(xué)，同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇敏感抗生素進(jìn)行治療，定期檢測(cè)患者的血、尿及痰細(xì)菌培養(yǎng)，完成巨細(xì)胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、IgG、IgM等檢查，根據(jù)患者病情定期復(fù)查血常規(guī)、血?dú)饧把娊赓|(zhì)，根據(jù)檢查結(jié)果調(diào)整藥物治療方案。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①生化指標(biāo)水平。兩組治療前、治療后14 d次日取空腹靜脈血5 mL，離心后采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)（White blood cell count，WBC）、中性粒細(xì)胞水平;采用血?dú)夥治鰞x測(cè)定患者動(dòng)脈血氧分壓（Partial arterial oxygen pressure，PaO2）、血氧飽和度（Blood oxygen saturation，SaO2）及酸堿度（pH）水平[12]。②不良反應(yīng)發(fā)生情況。記錄兩組患者治療過程中惡心嘔吐、腹瀉、血壓波動(dòng)、肝腎異常、向心性肥胖的發(fā)生情況。③治療指導(dǎo)效能。繪制ROC曲線，分析NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導(dǎo)效能[13-14]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生化指標(biāo)比較

兩組治療前生化指標(biāo)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;兩組治療后pH水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組治療后WBC、中性粒細(xì)胞水平低于對(duì)照組，PaO2及SaO2水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較

觀察組患者不良反應(yīng)總發(fā)生率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的治療指導(dǎo)效能

ROC曲線結(jié)果顯示，NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的指導(dǎo)效能[敏感度（91.35%）、特異度（90.18%）]均高于單一NGS[敏感度（72.91%）、特異度（69.71%）]和質(zhì)譜分析[敏感度（79.81%）、特異度（76.45%）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

指導(dǎo)效能

3 討論

重癥肺炎臨床發(fā)生率較高，是在伴有心肺基礎(chǔ)疾病或附加危險(xiǎn)因素基礎(chǔ)上感染的肺炎，其常見的特殊病原微生物包括SARS病毒、軍團(tuán)菌等，均會(huì)增加肺炎的嚴(yán)重程度及死亡風(fēng)險(xiǎn)[15]。臨床研究結(jié)果顯示[16]，重癥肺炎在年齡>65歲，存在基礎(chǔ)疾病，如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、糖尿病及慢性肝病等，或伴有意識(shí)異常、脾切除術(shù)后等患者中發(fā)生率較高，臨床多表現(xiàn)為呼吸衰竭、意識(shí)障礙等。近年來，基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者治療中得到應(yīng)用，且效果理想[17-18]。本研究中，兩組患者治療后pH水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;觀察組治療后WBC水平低于對(duì)照組，PaO2及SaO2水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析能指導(dǎo)免疫抑制合并重癥肺炎患者的臨床治療，有助于改善患者血?dú)饧把Ｒ?guī)檢測(cè)水平，利于患者恢復(fù)?；诜闻莨嘞匆焊腥静≡璑GS聯(lián)合質(zhì)譜分析能結(jié)合兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，包括檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確率高、成本低及覆蓋面廣等，對(duì)于感染性疾病的早期診斷、控制疾病傳播、治療進(jìn)展及預(yù)后評(píng)估具有一定的優(yōu)勢(shì)。我國(guó)質(zhì)譜分析與NGS技術(shù)在臨床與實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用相對(duì)較廣，而二者聯(lián)合使用能實(shí)現(xiàn)諸多疾病的診斷與治療[19]。本研究中，觀察組治療過程中的不良反應(yīng)總發(fā)生率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析檢測(cè)能發(fā)揮兩種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)，準(zhǔn)確地指導(dǎo)患者臨床用藥，利于患者恢復(fù)[20]。本研究中，ROC曲線結(jié)果顯示，NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析在免疫抑制合并重癥肺炎患者中的指導(dǎo)效能（敏感度、特異度）均高于單一NGS和質(zhì)譜分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，免疫抑制合并重癥肺炎患者治療時(shí)應(yīng)加強(qiáng)其肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析測(cè)定，以評(píng)估患者預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療，使得患者的治療更具科學(xué)性。

綜上所述，基于肺泡灌洗液感染病原NGS聯(lián)合質(zhì)譜分析用于免疫抑制合并重癥肺炎患者的治療，能獲得良好的治療效果、降低不良反應(yīng)總發(fā)生率，可指導(dǎo)臨床治療，值得推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王衛(wèi).長(zhǎng)期使用免疫抑制劑合并重癥肺炎患者應(yīng)用連續(xù)性腎臟替代治療臨床效果觀察[J].實(shí)用藥物與臨床，2018，21（7）：786-790.

[2] 王丹，劉春峰，張國(guó)安，等.重癥肺炎合并先天性心臟病患兒萬古霉素血藥濃度分布特點(diǎn)分析及臨床療效觀察[J].中國(guó)小兒急救醫(yī)學(xué)，2018，25（10）：737-740.

[3] 虞竹溪，張北源，許瑩，等.免疫功能抑制患者發(fā)生血流感染的臨床特征分析[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2018， 30（11）：1087-1090.

[4] 趙丹，寧睿，王春艷，等.不同預(yù)后的重癥肺炎患者住院期間血清和肺泡灌洗液TLR4水平、外周血免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)比較[J].山東醫(yī)藥，2017，57（15）：96-98.

[5] Andrea ND，Laura LH，Julia K，et al.Safety of induced sputum collection in children hospitalized with severe or very severe pneumonia[J].Clinical Infectious Diseases，2017， 64（Suppl 3）：S301-S308.

[6] 李蓉，吳秀慧，李志波，等.重癥肺炎合并心力衰竭患兒血清NT-proBNP、cTnI和H-FABP的表達(dá)水平及其與心功能的關(guān)系[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2019， 17（10）：1510-1512.

[7] 劉孝榮，馬東禮，姜含芳，等.高通量測(cè)序方法在重癥肺炎病原體檢測(cè)的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2017，40（8）：609-613.

[8] Jing H，Jiquan G，Hongtao L，et al.Efficacy and safety of adjunctive corticosteroids therapy for patients with severe community-acquired pneumonia：A systematic review and meta-analysis[J].Medicine，2019，98（13）：e14 636.

[9] 李學(xué)青，王麗娜，張俐，等.肺泡灌洗液二代基因測(cè)序?qū)和匕Y肺炎病原學(xué)診斷應(yīng)用觀察[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2019，34（6）：513-516.

[10] Yuanlin S，Chen Y，Yongming Y，et al.Xuebijing injection versus placebo for critically ill patients with severe community-acquired pneumonia：A randomized controlled trial[J].Critical Care Medicine，2019，47（9）：1.

[11] 和建武，向麗，程西安，等.早期CRRT干預(yù)對(duì)重癥肺炎合并急性腎損傷患者免疫功能的影響[J].國(guó)際呼吸雜志，2019，39（9）：676-679.

[12] 高延秋，張根生，李雙鳳，等.血管外肺水指數(shù)聯(lián)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1對(duì)重癥肺炎ARDS合并感染性休克患者預(yù)后的評(píng)估[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2018，27（12）：1381-1387.

[13] 王新平.血清肺表面活性蛋白D、可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)性受體-1檢測(cè)對(duì)老年重癥肺炎合并呼吸衰竭患者病情判斷和預(yù)后評(píng)估[J].中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2019，47（8）：923-926.

[14] Fatima B，Aimee B，Simon P.Travis post-marketing experience of vedolizumab in inflammatory bowel disease：Analysis of pneumonia and other respiratory tract infections[J].Gastroenterology，2017，152（5）：S580.

[15] 濮雪華，揭紅英，繆小莉，等.支氣管肺泡灌洗對(duì)重癥肺炎合并呼吸衰竭患者正五聚體蛋白-3水平的影響[J].中華老年多器官疾病雜志，2019，18（8）：588-592.

[16] Claudia D，F(xiàn)elix B，Mario M，et al.Long-term sequelae of acute respiratory distress syndrome caused by severe community-acquired pneumonia：Delirium-associated cognitive impairment and post-traumatic stress disorder[J].Journal of International Medical Research，2018，46（6）：030 006 051 876 204.

[17] 王俊，周婷.纖支鏡肺泡灌洗聯(lián)合振動(dòng)排痰治療對(duì)ICU治療的重癥肺炎患者血?dú)庵笜?biāo)及肺功能的影響[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2019，26（8）：1325-1328.

[18] Antoine R，Hamish W，Cedric J，et al.Local modulation of antigen-presenting cell development after resolution of pneumonia induces long-term susceptibility to secondary infections[J].Immunity，2017，47（1）：135-147.

[19] 徐俊馬，趙杰，賈曉民，等.早期連續(xù)性腎臟替代治療在重癥肺炎集束化治療中的應(yīng)用[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2018，30（3）：246-250.

[20] 李志剛，鄭太祖，張銀軍，等.貞芪扶正顆粒在搶救重癥肺炎呼吸衰竭患者中的作用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2019，38（4）：420-422.

（收稿日期：2020-03-18）