小肽激素調(diào)控植物生殖發(fā)育的研究進(jìn)展＊

孫翔，程麗軍，劉志文，李超

華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241

小肽，通常指5～60個(gè)氨基酸組成的肽段，但在植物中也把長度少于100個(gè)氨基酸的肽段歸為小肽[1]。自1991年科學(xué)家在番茄中發(fā)現(xiàn)長為18個(gè)氨基酸的系統(tǒng)素參與病蟲害引起的植物抗蟲反應(yīng)以來[2]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了幾十個(gè)家族的植物小肽參與基因表達(dá)調(diào)控，而且它們也參與發(fā)育和抗病等生物學(xué)過程。小肽主要作為信號分子起作用，由此又被稱為“小肽激素”。與傳統(tǒng)植物激素一樣，小肽激素起作用的濃度很低，有些小肽甚至可以在飛摩爾濃度(fmol, 1 fmol/L=10-15mol/L)下起作用。

根據(jù)其N端序列不同，植物小肽可分為分泌型小肽和非分泌型小肽。非分泌型小肽主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，而分泌型小肽在胞內(nèi)合成后運(yùn)送到胞外，甚至通過木質(zhì)部和韌皮部運(yùn)輸?shù)狡渌M織器官，介導(dǎo)細(xì)胞間通信[3]。分泌型小肽可分為富含半胱氨酸小肽(cysteine-rich peptides,CRPs)和翻譯后修飾小肽。多種CRPs被發(fā)現(xiàn)參與到植物生殖發(fā)育的各個(gè)過程，其中包括花粉分泌的PSK小肽調(diào)控花粉萌發(fā)[4]，柱頭分泌的STIG小肽參與煙草花粉與柱頭識別過程[5]，助細(xì)胞分泌的LURE小肽、XIUQIU和ZmEA1調(diào)控花粉管導(dǎo)向生長[6-8]，等等。植物的雌雄互作過程復(fù)雜，參與因子很多(圖1)。本文主要對幾種在植物花粉和柱頭識別過程中起作用的小肽家族的研究進(jìn)展展開介紹和討論。

圖1 植物生殖發(fā)育過程中的小肽激素

1 RALF家族

快速堿化因子(RAPID ALKALINIZATION FACTOR, RALF)最早在煙草(Nicotiana tabacum)中由Pearce等人發(fā)現(xiàn)并分離得到。這類小肽可以迅速強(qiáng)烈地升高煙草細(xì)胞懸液培養(yǎng)基的pH值，而且這類小肽在番茄中的同源基因可以抑制番茄與擬南芥幼苗的根長[9]。RALF小肽廣泛存在于植物界中，在地錢、小立碗蘚、擬南芥、番茄、玉米、水稻、苜蓿、草莓等幾十種植物中均發(fā)現(xiàn)了RALF家族的同源基因[10-12]。目前已知，擬南芥中RALF家族至少有37個(gè)同源基因，這些RALF小肽在植物的生長、抗逆、脅迫響應(yīng)以及生殖發(fā)育等不同生理活動(dòng)中起到重要的調(diào)控作用。

1.1 RALF家族保守結(jié)構(gòu)域分析

在分類上，RALF屬于CRPs小肽[3]。RALF小肽合成后分泌到胞外，作為信號分子調(diào)控自身細(xì)胞或鄰近細(xì)胞的生理活動(dòng)。從結(jié)構(gòu)上看，RALF小肽前體由N端信號肽、中間可變區(qū)以及C端保守區(qū)組成。有些RALF小肽的可變區(qū)下游具有保守的氨基酸序列RRXL模序，其中X代表任意氨基酸。RRXL模序可以被S1P (SITE-1 PROTEASE)識別。在擬南芥中，S1P識別RALF23并對其進(jìn)行剪切，剪切后的C端即為成熟的RALF小肽[13]。目前這類含有RRXL模序的小肽研究得比較多。另一個(gè)保守模序YISY在RRXL的下游，通常被認(rèn)為是RALF小肽與受體結(jié)合的位點(diǎn)[14]。成熟RALF小肽包含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸之間形成的二硫鍵可以幫助小肽正確折疊，二硫鍵被破壞則導(dǎo)致RALF小肽失去生理活性[9]。對擬南芥RALF8蛋白結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)其空間結(jié)構(gòu)在整體上呈現(xiàn)無序狀態(tài)，但局部存在兩個(gè)有序的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且每一個(gè)環(huán)都被一個(gè)二硫鍵連接[15]。

1.2 RALF家族和CrRLK1L受體家族

作為信號分子，RALF小肽與其受體的互作識別備受關(guān)注。目前已知長春花類受體激酶家族(Catharanthus roseus receptor-like kinase 1-like, CrRLK1L)和RALF小肽家族存在受體-配體識別關(guān)系。CrRLK1L家族在擬南芥中有17個(gè)成員，其中研究最為清楚的是FER(FERONIA)受體激酶。FER定位于細(xì)胞質(zhì)膜，由包含兩個(gè)串聯(lián)Malectin域的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)組成。FER與其共受體LRE(LORELEI)/ LLG1(LORELEI-like glycosylphosphatidyl-inositolanchor protein 1)相互作用，共同識別小肽RALF[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ER胞外域識別RALF1和RALF23的信號[17-18]，而RALF23的YISY模序?qū)τ谠撨^程是必需的[17]。除了FER以外，CrRLK1L家族的ANXUR1/2(ANX1/2)和BUPS1/2 l/2(Buddha’s paper seal)受體激酶可以識別來自花粉中RALF4/19和柱頭中RALF34的信號[19]，而THESEUS1(THE1)也是RALF34的受體之一[20]。

1.3 RALF4/19與花粉管極性生長

RALF4在花粉中高表達(dá)，體外施加RALF4抑制花粉管萌發(fā)[21]。ralf4 ralf19雙敲除突變體(ralf4/19)和RNAi突變體表現(xiàn)出與anx1/2和bups1/2雙突變體相似的角果變短和雄性不育表型，其花粉管體外萌發(fā)后立即破裂，在柱頭表面或者剛剛進(jìn)入柱頭處破裂[19]。蛋白互作實(shí)驗(yàn)表明RALF4/19與ANX1/2-BUPS1/2互作。在極性生長的花粉管頂端，ANX1/2-BUPS1/2復(fù)合體感知自身分泌的RALF4/19信號，進(jìn)而調(diào)控花粉管細(xì)胞壁的完整性[19]。此外，LLG1同源基因LLG2/3雙突變體也呈現(xiàn)出與ralf4/19突變體花粉管相似的生長缺陷，并且表現(xiàn)出胼胝質(zhì)沉積減少、異常膨大處酸化果膠累積、頂端甲酯化果膠增多的表型。RALF4/19的N端和C端分別與ANX1/2-BUPS1/2和LLG2/3結(jié)合，可以促進(jìn)LLG2/3-ANX1/2-BUPS1/2的互作，RALF4/19也可以增強(qiáng)LLG2/3與ANX1/2-BUPS1/2之間的結(jié)合[22]。LLG2/3作為ANX1/2-BUPS1/2的伴侶蛋白協(xié)助其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，并作為共受體在質(zhì)膜上感知RALF4/19[22-23]。

花粉管特異表達(dá)的NADPH氧化酶RBOHH/J激發(fā)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，進(jìn)而維持花粉管的正常生長[24]；而ROS抑制劑處理則抑制花粉管的生長，并促進(jìn)花粉管破裂。LLG2/3-RNAi突變體中，ROS水平顯著下降，而外源施加H2O2可以回復(fù)LLG2/3-RNAi中花粉管的長度與破裂率的異常表型。此外，施加RALF4可以提高花粉管中ROS的含量。RALF4/19-LLG2/3-ANX1/2-BUPS1/2通過促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)控花粉管的發(fā)育[23]。

花粉管自身分泌的伸展蛋白(LEUCINERICH REPEAT EXTENSIN, LRX)LRX8-11在擬南芥花粉中高表達(dá)，并調(diào)控花粉管的發(fā)育[25]。晶體結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，RALF4可以直接與LRX互作，其4個(gè)半胱氨酸所形成的空間結(jié)構(gòu)對于與LRX蛋白結(jié)合具有重要作用。LRX單體的LRR核心區(qū)域可以結(jié)合一個(gè)RALF4小肽，LRX單體通過形成二聚體而起作用。另外，RALF4依賴于不同的機(jī)制結(jié)合LRX和LLG1[26]。這些結(jié)果對于徹底解析RALF4調(diào)控花粉管生長的機(jī)制具有重要意義。

1.4 RALF34與花粉管破裂

在生殖器官中RALF34主要在成熟的胚珠中表達(dá)，尤其是在珠孔和助細(xì)胞附近高表達(dá)。RALF34處理體外生長花粉管造成其快速破裂，但是ralf34突變體花粉管體內(nèi)生長表型不明顯[19]。生化實(shí)驗(yàn)表明，RALF34競爭RALF4/19與ANX1/2-BUPS1/2的結(jié)合。當(dāng)花粉管抵達(dá)胚囊處，由雌性組織分泌的RALF34可以和花粉管自身的RALF4/19競爭而與ANX1/2-BUPS1/2結(jié)合，進(jìn)而造成花粉管破裂和精子釋放以完成雙受精[19]。

除了在生殖器官中，RALF34也在根部高表達(dá)，調(diào)控中柱鞘細(xì)胞的細(xì)胞分裂而影響側(cè)根發(fā)生[27]。RALF34被證明可以被CrRLK1L家族的THE1受體激酶識別而調(diào)控側(cè)根的發(fā)生[20]。除了RALF4、RALF19和RALF34，仍有多個(gè)RALF在雌雄生殖器官中高表達(dá)，它們的功能有待進(jìn)一步闡明。

2 PCP家族與花粉水合

精準(zhǔn)的植物雌性和雄性器官之間的相互作用對植物的生殖發(fā)育至關(guān)重要，花粉與柱頭之間的信號交流是雌雄互作的第一道門。被子植物根據(jù)其柱頭表面是否有分泌物分為干柱頭和濕柱頭[28-29]。茄科植物，如煙草和矮牽牛等具有濕柱頭；十字花科植物，如擬南芥和甘藍(lán)等具有干柱頭。濕柱頭對花粉的捕獲不具特異性，花粉在濕柱頭上的水合是被動(dòng)的，而干柱頭捕獲花粉存在嚴(yán)格種間差異，且花粉的水合受到精細(xì)的調(diào)控[30-31]。

花粉外被由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖和色素組成，其對花粉的黏附、水合以及識別至關(guān)重要[32]?；ǚ弁獗籔CP-As (pollen coat proteins class A)小肽基因家族最早從甘藍(lán)中被鑒定[33]，其與S基因座糖蛋白(S locus glycoprotein, SLG)互作[34]，被認(rèn)為可能參與自交不親和系統(tǒng)中花粉與柱頭之間的相互作用，其分子機(jī)制尚不清楚。在甘藍(lán)花粉中也鑒定到另一個(gè)富含半胱氨酸小肽PCP-Bs (pollen coat proteinsclass B)基因家族，其參與親和性花粉的水合調(diào)控[35-36]。PCP-Bs廣泛地存在于被子植物中，在擬南芥和幾種蕓薹屬植物中共有46個(gè)相似序列，而且進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白序列在家族間存在高度多態(tài)性，分為獨(dú)立的PCP-B和ESF1(embryo surrounding factor 1)兩支，其中PCP-B家族在花粉中特異性地高表達(dá)。

擬南芥中鑒定出4個(gè)花粉高表達(dá)的PCP-B：AtPCP-Bα、AtPCP-Bβ、AtPCP-Bγ和AtPCP-Bδ。PCP-Bs單突變體和多重突變體花粉沒有明顯形態(tài)異常，其中AtPCP-Bγ單突變及多重突變體花粉水合速率相比野生型明顯變慢，花粉管體內(nèi)生長延遲[36]。這些突變體的花粉在高濕環(huán)境下仍能水合，說明PCP-B的缺失不影響花粉的吸水能力。pcp-b突變體在授粉后出現(xiàn)了各種異常，但其種子數(shù)量與野生型沒有顯著差異，表明PCP-B蛋白在授粉后的啟始階段起作用。因此，PCP-B是目前發(fā)現(xiàn)的花粉中影響柱頭識別的小肽家族，推測其可能被柱頭上存在的受體識別，進(jìn)而開啟柱頭親和性響應(yīng)機(jī)制，促使花粉水合萌發(fā)[35]。對于PCP-B小肽的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究將對柱頭-花粉識別過程的解析有重要意義。

3 SP11/SCR小肽與自交不親和

自交不親和(self-incompatibility, SI)是植物在繁殖過程中的一個(gè)重要調(diào)控系統(tǒng)，自然界約一半的開花植物使用這一系統(tǒng)阻止自身花粉受精繁殖[37]。植物通過這個(gè)系統(tǒng)在柱頭表面識別并拒絕自身花粉以調(diào)節(jié)有害突變基因的積累[38]。自交不親和系統(tǒng)在開花植物的不同科屬中獨(dú)立發(fā)展，一般可分為配子體自交不親和與孢子體自交不親和兩種系統(tǒng)。在孢子體系統(tǒng)中，花粉的特性是由親本的二倍體基因組決定的，目前主要研究來源于蕓苔屬十字花科植物，其最主要的機(jī)制由具有高度多態(tài)性的S基因座(S-Locus)中的小肽SP11/SCR (S locus protein 11/S locus cysteine-rich)和受體激酶SRK (S locus receptor kinase)的識別與結(jié)合引起[39-40]。

SP11/SCR在花藥中特異性表達(dá)，編碼一個(gè)PCP-A1 (protein 1 of class A pollen coat protein)類的富含半胱氨酸小肽。SP11是從白菜型油菜(Brassica rapa) S9單倍型中SLG/SRK側(cè)翼區(qū)被鑒定出[41]的，而SCR是從白菜型油菜S8單倍型中對應(yīng)區(qū)域鑒定出的。研究表明，SP11以S單倍型的方式在乳突細(xì)胞中引起SI反應(yīng)，即在小肽實(shí)驗(yàn)中只有當(dāng)其被施加到相同S單倍型的乳突細(xì)胞時(shí)才會(huì)觀察到這種反應(yīng)，從而抑制了交叉花粉的水合作用[42]。在S基因座中有兩個(gè)柱頭特異表達(dá)的基因，S位點(diǎn)糖蛋白基因SLG(S locus glycoprotein)和S位點(diǎn)受體激酶基因SRK，兩者均定位于柱頭乳突細(xì)胞的細(xì)胞膜上，呈現(xiàn)高度的多態(tài)性，并且SRK是雌性自交不親和的唯一決定性因素[43-44]。

在SI反應(yīng)過程中，與SRK蛋白相同單倍型的SP11/SCR蛋白被特異性識別并結(jié)合，由此激活SRK胞內(nèi)激酶活性，傳遞SI信號，促使柱頭乳突細(xì)胞產(chǎn)生一系列生理生化變化，阻止花粉的水合等必要過程。在B. rapa中，乳突細(xì)胞上的SRK結(jié)合SP11/SCR后，受體激酶寡聚化，其胞內(nèi)激酶區(qū)相互磷酸化從而被激活[45]。晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，SCR9結(jié)合誘導(dǎo)eSRK9(SRK胞外結(jié)構(gòu)域)同源二聚化，形成eSRK:SCR(2:2)四聚體。eSRK9通過三個(gè)高度可變(hyper-variable, hv)區(qū)域特異性識別SCR9。每個(gè)SCR9同時(shí)結(jié)合兩個(gè)hv：來自第一個(gè)eSRK9單體的hvI以及來自第一個(gè)eSRK9的hvII的一半和第二個(gè)eSRK9的hvII的另一半[46]。自交不親和信號通路的體外實(shí)驗(yàn)顯示：在與SP11/SCR小肽結(jié)合前，SRK的激酶活性被硫氧還蛋白H類(thioredoxin-h-like, THL)-1/2抑制；當(dāng)與小肽結(jié)合后，SRK與THL1/2分離，激酶被激活，其下游的信號通路被開啟[47]。目前已知的SCR-SRK介導(dǎo)的自交不親和信號通路中的信號分子尚少，還有待于進(jìn)一步的遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)。

4 LURE小肽和XIUQIU小肽與花粉管導(dǎo)向

傳粉是被子植物生殖過程中的重要環(huán)節(jié)。高度協(xié)調(diào)的雌雄相互作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作為物種特異性屏障以避免近親繁殖和異種雜交。在親和性授粉中，攜帶兩個(gè)精細(xì)胞的花粉管穿過雌蕊傳輸?shù)?，被精確地引導(dǎo)到胚珠，將精細(xì)胞釋放到胚囊中完成受精[48]。在夏堇和擬南芥中發(fā)現(xiàn)，位于卵細(xì)胞一側(cè)的兩個(gè)助細(xì)胞分泌一種擴(kuò)散的物種特異性的信號來吸引花粉管，即一種分泌型富含半胱氨酸多肽(CRPs)——LURE小肽[49-50]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥花粉特異性受體激酶 PRK6 (pollen-specific receptor-like kinase 6)和其同源基因是AtLURE1的受體，其突變體無法響應(yīng)AtLURE1小肽引導(dǎo)的花粉管轉(zhuǎn)向。AtLURE1引起PRK6在花粉管頂端的不對稱分布，并通過ROPGEF12和細(xì)胞質(zhì)激酶LIP1/2傳遞信號，調(diào)控花粉管導(dǎo)向型生長[6]。同時(shí)期的另一工作發(fā)現(xiàn)，MDIS1-MIK受體激酶復(fù)合體也可以感受LURE1小肽，該復(fù)合體包含MDIS1(MALE DISCOVERER1)、MIK1 (MDIS1-INTERACTING RECEPTOR LIKE KINASE1)和MIK2三種富含亮氨酸重復(fù)序列的受體激酶。MIK1-MDIS突變體的花粉管在珠孔附近間或出現(xiàn)分支現(xiàn)象，并且受精率下降。LURE1小肽增強(qiáng)MDIS1與MIK1互作，誘導(dǎo)MIK1形成二聚體并自磷酸化，然后進(jìn)一步激活MDIS1。把MDIS1轉(zhuǎn)化到薺菜(Capsella rubella)中可以顯著提高薺菜的花粉管識別擬南芥胚囊的效率[7]。

AtLURE1基因家族全部敲除的多重突變體和PRK6突變體一樣沒有育性缺陷，只是花粉管延遲進(jìn)入隔膜。這一結(jié)果表明，AtLURE1-PRK6通路不是雌性器官吸引花粉管的唯一信號，而是一類通過增加自身花粉管競爭能力，促進(jìn)與親緣關(guān)系相近物種產(chǎn)生遺傳隔離的信號。XIUQIU小肽是一類與AtLURE1相關(guān)的十字花科富含半胱氨酸的保守肽，由助細(xì)胞表達(dá)分泌，并且也分布于助細(xì)胞絲狀器，其基因位于轉(zhuǎn)錄因子MYB98調(diào)控通路下游。XIUQIU小肽對花粉管的吸引不通過PRK6傳遞信號，并且其對于花粉管的吸引無物種特異性[51]。對花粉管導(dǎo)向的研究仍然有許多問題需要解決，如小肽的作用距離等，同時(shí)花粉管吸引與物種生殖隔離之間的關(guān)系也需進(jìn)一步探索。

5 總結(jié)和展望

相比植物激素，小肽激素種類眾多、功能復(fù)雜，整體研究還處于初級階段。已知小肽的功能還有很多待研究的問題，也還有更多的小肽激素有待于發(fā)現(xiàn)。對于所有小肽激素而言，有一些亟待解決的問題將是未來研究的方向。例如：小肽激素信號通路是如何跟經(jīng)典激素信號整合的？其他物種中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后修飾是否存在于植物小肽激素？受體識別多個(gè)配體的機(jī)制是怎樣的？小肽的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和遠(yuǎn)距離細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)是怎樣發(fā)生的？小肽激素的表達(dá)是如何調(diào)控的？另外，基于小肽的功能特異性及化學(xué)合成的方便性，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用有待開發(fā)利用。