水稻草銨膦耐性突變體的篩選及其耐性機制

任 艷，葉亞峰，陶亮之，謝 建，何 丹，姜鴻瑞，楊 陽，劉斌美，吳躍進

（1.中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院技術(shù)生物與農(nóng)業(yè)工程研究所，合肥230031；2.中國科學技術(shù)大學，合肥230026；3.安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，合肥230036）

稻田雜草與水稻爭奪生長空間、肥料和水分，同時又是傳播病蟲害的媒介，嚴重威脅水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量［1］。因此，防除農(nóng)田雜草是保證水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的一項重要內(nèi)容。傳統(tǒng)人工除草方式效率低、成本高、費時費力；化學除草方式成本低、效率高，其中滅生性除草劑藥效快、廣譜高效。然而，由于滅生性除草劑的作用對象無選擇性特點，其會損傷作物，不能直接施用于大田農(nóng)作物［2］。同時長期施用同一類型除草劑易使田間雜草產(chǎn)生耐藥性［3］，增加除草難度，而交替施用不同類型除草劑雖可大大降低雜草產(chǎn)生耐藥性的概率，但對水稻的損傷仍不可避免［4］。因此，篩選和培育抗多種廣譜除草劑的水稻突變體是現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)發(fā)展的新趨勢之一。目前市場上的滅生性除草劑有百草枯、草甘膦、草銨膦等，百草枯因?qū)θ梭w有劇毒，且無特效解毒藥而被禁用；草甘膦使用不當易造成環(huán)境污染，降低了其利用價值；草銨膦因除草快速高效、在土壤中易分解、對人畜無毒等優(yōu)勢而獲得廣泛的使用［5］。草銨膦為接觸性、廣譜性和非選擇性除草劑，其基本原理是通過抑制植物體內(nèi)谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthe?tase，GS）活性，降低氨代謝過程。有研究指出植物體內(nèi)氨過量積累會降低光合活性，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)［6?8］，幾小時內(nèi)可導(dǎo)致植物組織死亡。

抗草甘膦水稻種質(zhì)目前可通過基因編輯［9］、EMS誘變［10］等途徑獲得；抗咪唑啉酮類水稻種質(zhì)可通過EMS 伽馬射線［5］和基因編輯技術(shù)［11］獲得。而目前抗草銨膦水稻種質(zhì)只能通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)而獲得，抗草銨膦的基因是來自吸水鏈霉菌的Streptomyces hygroscopi?cus 的Bar 基因［12］和來自Streptomyces viridoehromogenes的Pat 基因［13］。然而，轉(zhuǎn)基因技術(shù)復(fù)雜、存在未知風險，消費者對轉(zhuǎn)基因作物較為排斥，推廣難度較大［14］。近幾年在常施用草銨膦的地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)具有草銨膦耐性的黑麥草［15?16］，證明在禾本科植物中存在耐草銨膦的機制，然而迄今為止還未有通過非轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗草銨膦水稻的報道。本文選用具有咪唑乙煙酸抗性的水稻品種為野生型材料，對其進行重離子處理，篩選出對草銨膦具有耐性的水稻突變體，并對其作用機制進行初步探索，以期為遺傳育種發(fā)掘新的抗除草劑的水稻新基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻材料為粳稻品種“金粳818”，從種子市場上購買。除草劑草銨膦原藥純度為99.6%（購自湖北康寶泰精細化工有限公司）；商用咪唑乙煙酸（水劑，有效成分5%）。

1.2 方法

1.2.1 水稻草銨膦耐性突變體的篩選與表征

“金粳818”種子經(jīng)過重離子處理（12C6+，能量80 Mev，劑量120 Gy）。篩選實驗于2018 年11 月在海南試驗基地進行，播種量為15 kg／畝，水稻幼苗生長到三葉期時用300 mg/L（實驗室前期驗證的最佳篩選濃度）的草銨膦溶液均勻噴施幼苗。一周后對存活的幼苗進行復(fù)噴驗證。復(fù)噴10 d后，篩選存活植株并移栽，常規(guī)田間管理至收獲M3種子。M3種子播種后至三葉期時噴施草銨膦，10 d 后，每個系隨機取20 株測定水稻株高、鮮重和烘干重量。

1.2.2 突變體水稻耐性生理指標的測定

草銨膦耐性突變體耐性水稻植株經(jīng)過復(fù)篩后，進行草銨膦耐性驗證和耐性機制研究。待水稻植株長至7～8 葉期時，用棉簽蘸取質(zhì)量濃度為200 mg/L 的草銨膦溶液均勻涂抹在水稻葉面上（含對照）。檢測草銨膦處理后0、6、24、48、72 和96 h 葉片葉綠素含量相對值，及處理0、6、48 和96 h 葉片氨含量和谷氨酰胺合成酶（GS）活性。水稻葉片葉綠素含量相對值使用SPAD 計測量（Soil and Plant Analyzer Development，日本柯尼卡美能達）。氨含量檢測方法采用茚滿三酮比色法［17］；谷氨酰胺合成酶（GS）活性采用海聯(lián)生物科技公司的檢測試劑盒測定。

1.2.3 突變體對咪唑乙煙酸耐性的驗證

驗證草銨膦耐性突變體是否仍具有野生型的咪唑乙煙酸耐性。播種草銨膦耐性突變體M3 代種子于田間，長至三葉期時，用咪唑乙煙酸溶液（500 mg/L）噴施幼苗，一周后觀察植株存活情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.1 統(tǒng)計分析軟件的Proc ANOVA 過程進行方差分析和多重比較（α=0.05）。數(shù)據(jù)圖采用Excel 2019數(shù)據(jù)繪圖軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 水稻草銨膦耐性突變體的篩選與驗證

噴藥一周后對水稻的存活情況進行觀察，根據(jù)葉色（綠色或枯黃）來鑒定對草銨膦具有耐性的植株，特別是選擇被枯黃水稻植株包圍的綠色水稻植株，以確保特定地區(qū)的水稻植株噴施了足夠量的草銨膦除草劑，從而盡量減少遺漏的概率［18］。大田篩選結(jié)果如圖1 所示，枯黃的水稻植株對草銨膦不具有耐性，有5 株保持綠色的水稻植株，初步確定為耐草銨膦水稻突變體并編號為R1～R5。為了排除由于漏噴而造成的錯誤選擇，一周后對這些綠色植株進行復(fù)噴，結(jié)果表明這5株水稻植株仍表現(xiàn)出明顯的草銨膦耐性。

在三葉期對草銨膦耐性突變體M3 代植株噴施草銨膦溶液，10 d 后，對照組水稻幼苗已枯黃萎蔫，而5個突變系水稻葉尖雖略微枯黃，但整株水稻仍保持綠色（圖2）。生物量結(jié)果表明：因?qū)φ战M水稻施藥后迅速枯萎死亡，失去水分，鮮重與干重相差較小，而突變系水稻生長良好，含水量大，所以鮮重與干重相差較大。噴施草銨膦后，突變系水稻的鮮重、干重和株高均顯著高于對照組水稻（P＜0.05）（表1）。其中：突變系水稻R3 鮮重最高可達1.520 g，比對照組（0.719 g）增加111.5%；突變系水稻干重比對照組（0.2 g）增加36.6% ～53.4%；突變系水稻株高比對照組（17.5 cm）增加21.71%～48.00%。

圖1 草銨膦耐性水稻的大田篩選Figure 1 Field screening of glufosinate?tolerant（GT）rice plants

圖2 突變體M3代對草銨膦耐性的復(fù)篩Figure 2 The screening of glifosinate tolerance in mutant M3 generation

表1 草銨膦對水稻生物量和株高的影響Table 1 Effects of glufosinate on rice biomass and plant height

2.2 突變體水稻耐性生理指標的測定

2.2.1 草銨膦對水稻葉片SPAD值的影響

水稻葉片葉綠素的含量可以直接反映水稻的生理狀況及受害程度［19］。由表2 可見，不同水稻單株和處理時間對葉片SPAD 影響顯著（P＜0.05）：涂藥后5 個草銨膦耐性水稻突變系和對照組水稻的葉片SPAD 值均隨著時間推移而下降；在涂藥72 h以后，各個突變系水稻的SPAD值均顯著高于對照組（P＜0.05）。突變系R4、R5 和對照組水稻在涂藥48 h 時SPAD 值顯著下降（P＜0.05），而突變系R1、R2 和R3 則在24 h 均顯著下降，這可能與離子束誘變的位置和個體間的差異有關(guān)。在涂藥48 h 和72 h 之間，對照組葉片SPAD 值出現(xiàn)“陡降”現(xiàn)象（降低144.42%）；在涂藥96 h 時，對照組葉片SPAD值已降至8.43，出現(xiàn)不可逆的枯死（圖3和表2）。突變系水稻的葉片SPAD 值在21.80 ～31.40，與對照組相比下降幅度較小。該結(jié)果說明：在施藥后的24～48 h，草銨膦使對照組水稻內(nèi)部系統(tǒng)出現(xiàn)“崩塌”式毀壞，可能是草銨膦誘發(fā)植物產(chǎn)生大量的活性氧以及其后的氨積累［20］使得葉綠體快速解體、細胞崩潰死亡；而突變系水稻則沒有對照組的這種“崩塌”式毀壞過程。

圖3 草銨膦對水稻葉片的影響Figure 3 Effect of glufosinate treatment on rice leaves

草銨膦耐性突變系水稻雖然仍受到草銨膦的藥害，但是其受害程度要遠遠小于其野生型對照。野生型對照為整片葉的褪綠枯黃，而突變系水稻葉片僅葉尖失綠（圖3）。由于草銨膦在組織中移動非常有限，只有極少量的草銨膦會運輸?shù)洁徑慕】到M織中［21］，因此草銨膦耐性突變系水稻在受到草銨膦藥害后，經(jīng)過一定時間的恢復(fù)可以存活，而野生型對照則沒有恢復(fù)能力。這一過程的差異可能是突變系水稻產(chǎn)生草銨膦耐性的機制之一。

表2 草銨膦對水稻葉片SPAD值的影響Table 2 Effect of glufosinate on SPAD value in rice leaves

2.2.2 草銨膦對水稻葉片氨含量的影響

草銨膦除草的主要原理是抑制GS活性，降低氨同化效率，導(dǎo)致氨大量積累，引起植物氨中毒死亡［7］。因此，葉片氨含量可作為衡量植物對草銨膦抗性大小的參考指標［22］。如圖4 所示，對照組水稻在施藥后，葉片氨含量保持在較穩(wěn)定的水平，1.30 mg/g左右。突變系水稻R1～R5 在施藥后，葉片氨含量呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢。其中在施藥后6 h 時，各突變系水稻葉片氨含量之間無顯著差異（P＞0.05）。但施藥后48 h時，突變系水稻R1、R2 和R5 葉片氨含量顯著上升（P＜0.05），分別增加53.29%、59.12%和63.49%，而突變系水稻R3 和R4 則無顯著變化（P＞0.05）。在施藥后96 h時，突變系水稻R1～R5葉片氨含量均顯著下降，且5 個突變系之間無顯著差異（P＞0.05），氨含量為0.67～0.80 mg/g。

施藥后6 h，突變系水稻葉片氨含量與對照組也無顯著差異（P＞0.05）；施藥后48 h，突變系水稻R1、R2和R5 葉片氨含量（分別為1.96、2.32 和2.04 mg/g）均顯著高于對照組（P＜0.05），而R3 和R4 葉片氨含量與對照組無顯著差異（P＞0.05）；施藥96 h，R1～R5 葉片氨含量均顯著低于對照組（P＜0.05），且R1～R5之間葉片氨含量無顯著差異（P＞0.05）。其中R1、R2和R5突變系水稻葉片在涂藥后48 ～96 h，出現(xiàn)了“快積快消”的特殊氨積累過程，而R3 和R4 突變系水稻葉片氨含量在涂藥后則無顯著上升的過程。最終各突變系水稻葉片氨含量均顯著下降（P＜0.05），可能是由于在葉片中的氨還沒有實現(xiàn)植物毒性時就被及時清除或者代謝，大大降低了氨對水稻的損傷，這一特性是突變系水稻產(chǎn)生草銨膦耐性的另一可能機制。未來還需進一步研究突變系水稻中的兩種不同氨積累過程，以揭示突變系水稻對草銨膦產(chǎn)生耐性的機制。

圖4 草銨膦對水稻葉片氨含量的影響Figure 4 Effect of glufosinate treatment on ammonia content of rice leaves

2.2.3 草銨膦對水稻葉片GS活性的影響

谷氨酰胺合成酶（GS）在植物氨同化及氨代謝調(diào)節(jié)中起解毒作用，這是一個依賴于三磷酸腺苷（ATP）的酶系，可將氨同化成谷氨酰胺基，解除由硝酸還原作用、氨基酸降解及光呼吸中釋放的氨的毒性，對植物中氮的同化起著核心作用［23］。草銨膦對GS 的不可逆抑制會導(dǎo)致有毒氨迅速積累，抑制光合作用，導(dǎo)致葉片組織壞死和植物死亡［24］。如表3 所示，施藥后對照組與突變系水稻R1～R5的葉片GS活性均逐漸下降，說明施用草銨膦抑制葉片GS活性。在施藥后各個時間，對照組與突變系水稻組內(nèi)葉片GS活性無顯著差異，變化趨勢較一致。該結(jié)果說明，突變系水稻對草銨膦的抗性不是基因突變引起的GS 敏感性改變所致。研究結(jié)果與Wilson 等［25］的研究結(jié)果類似，其抗性可能與該突變株對草銨膦的吸收、轉(zhuǎn)運、代謝有關(guān)，或者是減少到達目標GS 位置（如液泡固存）的除草劑的量［26］，這種抗性機制在抗草甘膦機制中已經(jīng)被證明［27］，或者是由細胞對除草劑攝取的差異而產(chǎn)生的抗性［28］。

表3 草銨膦對水稻葉片GS活性的抑制率Table 3 Inhibition rate of glufosinate on GS activity in rice leaves

GS抑制率（%）=草銨膦處理葉片的GS活性／未處理葉片的GS活性×100%

2.3 咪唑乙煙酸抗性的驗證

圖5中，a為野生型水稻“金粳818”；b～f為篩選出的草銨膦耐性突變系水稻R1～R5，g 為無咪唑乙煙酸抗性的水稻“武運粳7號”。

圖5 水稻咪唑乙煙酸抗性的驗證Figure 5 Verification of resistance to imazamox in rice

“金粳818”攜帶抗咪唑乙煙酸的基因。前述結(jié)果已證明誘變篩選出的草銨膦耐性突變體對草銨膦具有較好的耐性，進一步分析草銨膦耐性突變體是否還具有咪唑乙煙酸抗性。結(jié)果表明（圖5），對照組為對咪唑乙煙酸無耐性的粳稻品種“武運粳7 號”，噴施過咪唑乙煙酸后，對照組出現(xiàn)枯黃萎蔫癥狀，而草銨膦耐性突變體則未受到藥害仍保持綠色無枯黃癥狀，說明其對咪唑乙煙酸的抗性并未丟失，仍具有抗除草劑咪唑乙煙酸的特性。因此，誘導(dǎo)篩選出草銨膦耐性突變體水稻適用草銨膦和咪唑乙煙酸聯(lián)合除草，可提高田間除草效率，且不易使雜草產(chǎn)生耐藥性。未來還需要進一步研究突變體中的抗咪唑乙煙酸基因和耐草銨膦的基因之間是否存在相互作用，以及兩個抗除草劑基因疊加后是否會對水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量造成影響。

3 結(jié)論

研究利用重離子處理種子法結(jié)合大田試驗，篩選出了5 株具有草銨膦耐性的水稻突變體并進一步培育出相應(yīng)的突變系。用草銨膦溶液處理后代幼苗，對照組植株完全枯死，而草銨膦耐性突變系則表現(xiàn)為葉緣略微枯黃，所受藥害程度顯著輕于對照組，且一段時間后可復(fù)青。突變系水稻的葉片氨含量在施用草銨膦后呈現(xiàn)“快積快消”模式，這可能是具有草銨膦耐性的機制之一。有關(guān)草銨膦耐性突變系水稻受草銨膦藥害后的快速恢復(fù)機制目前尚未清楚，還有待進一步研究。