Pax3和Pax7在胚胎發(fā)育早期及神經(jīng)嵴形成中的作用

李云曉，楊慈清，3，林俊堂

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，新鄉(xiāng)453003；2.河南省干細胞與治療工程研究中心，新鄉(xiāng)453003；3.河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，新鄉(xiāng)453003）

Pax 基因（Paired box gene）是一類進化上保守的轉錄因子家族，它們參與機體內的細胞信號傳導和靶基因的轉錄調控。脊椎動物生長發(fā)育過程與Pax 基因功能調控緊密相關，正常表達Pax基因動態(tài)調控發(fā)育相關基因轉錄、促進細胞增殖與自我更新、抑制細胞凋亡、誘導前體細胞定向遷移與分化。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Pax基因在細胞和區(qū)域指定、增殖、祖細胞維持、抗凋亡和神經(jīng)分化等方面發(fā)揮重要作用。脊椎動物中Pax 基因在進化上是保守的，基因序列與昆蟲、兩棲動物和鳥類中具有高度同源性。研究發(fā)現(xiàn)，脊椎動物中Pax基因家族共9 個成員（Pax1-Pax9），不同Pax 成員協(xié)同調控同一器官或組織的正常生長發(fā)育和形態(tài)建成［1］。

Pax 家族蛋白都包括一個結合DNA 序列的成對結構域（Paried DNA-binding domain，PD）和一個轉錄激活結構域（Transactivation domain，TD）。部分成員還包括一個結合DNA 序列的同源結構域（Home-do?main，HD）和一個連接PD 和HD 的八肽（Octapeptide，OP）結構?；贒NA 結構、序列相似性和功能組，Pax家族蛋白被分為4 個亞家族。亞家族I（Pax1 和Pax9）由成對結構域和八肽組成，亞家族II（Pax2、Pax5 和Pax8）由成對結構域、部分同源結構域和八肽組成。亞家族III（Pax3 和Pax7）由成對結構域、完全同源結構域和八肽組成，亞家族IV（Pax4 和Pax6）由成對和完全同源結構域組成。

Pax3和Pax7是Pax蛋白家族中僅有的兩個包含所有結構的成員（圖1），基于高度的序列同源性和相似的基因組和功能組［2］，二者同屬于第三亞家族，功能上與神經(jīng)和肌肉發(fā)育密切相關。過去有關Pax3 和Pax7的研究工作主要集中在肌肉發(fā)生發(fā)育，對其在神經(jīng)發(fā)育早期的功能探討并不深入。本文主要針對Pax3 和Pax7 在胚胎發(fā)育早期的功能，特別是二者對神經(jīng)嵴發(fā)生發(fā)育的調控機制的最新研究進展作簡要的概述。

圖1 Pax3和Pax7的蛋白結構示意圖Figure 1 Schematic diagram of protein structure of Pax3 and Pax7

1 Pax3和Pax7概述

1.1 Pax3的結構與生物學功能

人類Pax3 基因位于2 號染色體長臂的q36.1 區(qū)域，由8 個外顯子組成，編碼由479 個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量為53 ku。人Pax3 蛋白與小鼠Pax3蛋白的同源性為98%。Pax3蛋白的主要結構包括一個N端DNA結合域和一個C端轉錄激活結構域。DNA結合域由成對結構域（PD）、八肽（OP）和同源結構域（HD）組成，轉錄激活結構域（TD）含有一個78 個氨基酸的富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸（PST）的區(qū)域。PD由128 個氨基酸組成，包括PAI 和RED 兩個亞區(qū)，在進化上非常保守。每個亞域都由一個三螺旋折疊組成，其中包括一個螺旋-轉角-螺旋（HTH）基序，每個HTH的C 端螺旋在DNA 的主溝中進行堿基特異性結合［3］。HD 的長度為60 個氨基酸，包含3 個α-螺旋。Pax3 和另外3 個Pax 成員（Pax4、Pax6 和Pax7）具有這個DNA結合域。HD和PD結構域之間聯(lián)系密切且存在協(xié)同作用，這是這兩個結構域在DNA 結合中功能相互依賴的原因。

小鼠和人類Pax3 基因的突變分別導致斑點（Splotch）突變表型和WaardenburgⅠ型綜合征，純合的Splotch 胚胎具有嚴重的神經(jīng)嵴細胞（NCC）缺陷，從而產生包括脊柱裂、腦外畸形和心臟流出道異常在內的復雜表征［4］；WaardenburgⅠ型綜合征的特征為先天性感音神經(jīng)性耳聾、眼角異位和虹膜色素異常等［5］。Pax3還被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生相關，在膠質母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤和胃癌中表達上調［6］。Liang 等［7］通過免疫共沉淀（Co-immunoprecipi?tation，CO-IP）實驗證實，Pax3 過表達促進人神經(jīng)膠質瘤細胞增殖和細胞周期進程，同時通過改變與Wnt信號通路相關的重要分子β-catenin、Myc、VEGF、cy?clinD1、MMP7 和Wnt1 的表達而抑制細胞凋亡。這些研究表明，Pax3 作為轉錄因子與組織分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。

1.2 Pax7的結構與生物學功能

Pax7 基因定位于人染色體1p36.13 和小鼠的第4條染色體。其編碼區(qū)域由8 個外顯子組成，和Pax3 基因相應的外顯子位置和長度相似。Pax7 蛋白由505 個氨基酸殘基編碼，結構和Pax3 蛋白類似，含有PD、TD、HD 和OP 區(qū)域。其羧基端比高度相關的Pax3 蛋白多47 個氨基酸。功能分析表明，成對結構域由外顯子2、3、4 編碼，而同源結構域由外顯子5 和6 編碼，外顯子6、7、8 編碼轉錄激活結構域。Pax7 和Pax3 顯示高度同源的N-末端區(qū)域，包含配對結構域、八肽結構域和同源結構域。這個N-末端結構域介導DNA結合特性，由此推測Pax3 和Pax7 可能結合相似的基因。同時Pax7在該家族中是獨一無二的，因為C-末端存在一個14 個氨基酸序列，即OAR（Otp/Aristaless/Rax）序列，它存在于多個配對型HD 蛋白中，但仍然沒有明確的活性［8］。

在人類中，Pax7 在背側神經(jīng)管和年輕胚胎早期遷移的神經(jīng)嵴細胞中表達。Proskorovski-Ohayon 等［9］通過連鎖分析和外顯子全序列測定，證明了Pax7 純合子突變導致常染色體隱性人類綜合征，導致患者出現(xiàn)發(fā)育不全、軸性低張力和嚴重的全身神經(jīng)發(fā)育遲緩，并伴有小頭畸形、錐體體征、肌張力障礙、癲癇、易怒和自殘等癥狀。在小鼠中，Pax7雜合子突變具有正常表型和生育能力，但純合子發(fā)育到足月后，在出生3周內死亡。對Pax7突變小鼠的分析表明，在所有的突變個體中，主要是面部骨骼結構受到影響，這可能與顱神經(jīng)嵴細胞缺陷有關［10］。因為顱神經(jīng)細胞向背側遷移到頭部區(qū)域，產生神經(jīng)元、膠質細胞和顱面間充質細胞，還有各種結締組織肌肉、骨骼和軟骨等。綜上所述，Pax7是神經(jīng)管和神經(jīng)嵴發(fā)育的關鍵轉錄因子，不同形式的突變會對生命體造成嚴重的遺傳損傷甚至是生命危險。

2 Pax3和Pax7在胚胎發(fā)育早期的表達

2.1 Pax3與神經(jīng)管發(fā)育

在神經(jīng)系統(tǒng)形成階段，Pax3 在神經(jīng)皺褶、神經(jīng)管背部、神經(jīng)嵴細胞和體節(jié)中表達，調節(jié)這些組織中影響增殖、維持、分化和運動的靶基因的表達。Pax3 最初在小鼠胚胎期8.5 d 的神經(jīng)溝的背側區(qū)域表達。隨著神經(jīng)溝的加深和閉合，繼續(xù)在神經(jīng)管的背側區(qū)域表達，這種表達沿著神經(jīng)管從前腦延伸到后腦神經(jīng)孔。隨著神經(jīng)管的增厚，Pax3 主要表達于心室內區(qū)的增殖細胞，并隨著這些細胞的遷移而表達下調。在E12-13 d，隨著神經(jīng)管的發(fā)育，Pax3的表達在神經(jīng)管尾部結束。

在小鼠中，Pax3在脊髓背側的神經(jīng)發(fā)育早期被誘導，并在隨后的模式化過程中保持不變，導致組織分為背側和腹側兩個亞區(qū)，而神經(jīng)管在胚胎發(fā)育第8 天開始關閉，主要由放射狀定向的未分化柱狀上皮細胞組成。研究表明，Pax3 的功能是維持神經(jīng)上皮處于增殖、未分化狀態(tài)，使神經(jīng)形成得以正常進行。胚胎發(fā)育早期，Pax3 功能缺失可能會導致胚胎神經(jīng)管背側上皮細胞增殖減少，這直接誘發(fā)未來中腦神經(jīng)元的過早分化。Pax3 在神經(jīng)管閉合過程中也發(fā)揮了關鍵作用，Pax3突變和缺失的小鼠胚胎既表現(xiàn)出脊柱裂又表現(xiàn)出腦外畸形［11］。Wang等［12］證實在神經(jīng)管閉合階段Pax3表達降低導致p53 依賴性細胞凋亡的抑制，可能與人類神經(jīng)管缺陷（Neural tube defects，NTDs）的發(fā)生有關。這一發(fā)現(xiàn)為Waardenburg 綜合征和NTDs 相關疾病的治療提供了新的靶點。

2.2 Pax7與上丘腦／視頂蓋的發(fā)育

在雞胚發(fā)育過程中，Pax7 最早被發(fā)現(xiàn)在HH5 時期外胚層的神經(jīng)板邊緣表達。Pax7 表達了許多交替轉錄物，這些轉錄物被認為負責引導胚胎細胞沿著神經(jīng)源性或肌源性組織分化，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌的發(fā)育。Pax7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期起作用，以建立神經(jīng)管的背極性。表達不斷細化最終導致Pax7在中腦背側，特別是在上丘腦（與禽類的視頂蓋同源）中發(fā)揮作用。隨著上丘／視頂蓋的發(fā)育，Pax7在遷移的神經(jīng)細胞中表達，這些神經(jīng)細胞集中在視神經(jīng)投射到的背側視網(wǎng)膜接受層淺層［13］。

Pax7作為主控基因，促進了上丘／視頂蓋組織的形成。最初Pax7作用于中腦的翼板，接著是中腦背側的視頂蓋。雛雞和鵪鶉之間的移植實驗表明，視頂蓋形成的關鍵取決于誘導和維持Pax7 的表達以及抑制Pax6 的表達。將雞中腦底板移植到視頂蓋導致Pax7的抑制和視頂蓋區(qū)域向腹側擴張。此外，Pax7在雞間腦中的異常表達導致視頂蓋相關基因Fgf8、En-2、Pax3 和Pax7 的內源性表達，隨后形成異位視頂蓋。Pax7 在間腦中誘導的視頂蓋相關基因通常不是內源性表達的，再加上Pax7在中腦翼板中的早期表達，提示Pax7 可能在遺傳級聯(lián)的最前端起作用，而遺傳級聯(lián)對上丘／視頂蓋的發(fā)育至關重要。Pax7還調控遷移到顱面部區(qū)域的小鼠腦神經(jīng)嵴細胞的亞群，并最終產生各種各樣的嗅覺上皮細胞類型，導致Pax7 突變小鼠顱面畸形［14］。由此可見，脊椎動物胚胎發(fā)育階段，Pax7在腦視覺中心和視覺神經(jīng)系統(tǒng)的分化形成發(fā)揮至關重要的作用。

3 Pax3和Pax7在神經(jīng)嵴發(fā)育中的共同作用

脊椎動物的神經(jīng)嵴發(fā)育機制在很大程度上是保守的（圖2）。在神經(jīng)和非神經(jīng)外胚層的交界處，由分泌信號和轉錄調控因子組成的復雜且動態(tài)的組合控制著Pax3 和Pax7 基因的誘導［13］。神經(jīng)嵴基因調控網(wǎng)絡（Neural crest-gene regulatory networks，NC-GRN）認為，包括Wnts、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）和成纖維細胞生長因子（FGF）在內的信號分子通過誘導一組稱為邊界特異性基因（Msx1、Pax3／7、Cdx、Tfap2、Gbx2）的表達來建立神經(jīng)板邊界。信號分子和邊界特異性因子指導神經(jīng)嵴特異性基因（Snail1／2、Sox8／9／10、Foxd3、Twist）的表達，進一步誘導與遷移和分化相關基因的表達。對不同的脊椎動物發(fā)育模型的研究共同闡明了神經(jīng)嵴基因調控網(wǎng)絡中涉及Pax3 和Pax7 基因的分子機制。

圖2 脊椎動物胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)嵴與神經(jīng)管的形成過程Figure 2 Formation of neural crest and neural tube during embryonic development

3.1 Pax3和Pax7在神經(jīng)板邊界形成中的作用

神經(jīng)誘導起始于原腸胚早期，神經(jīng)嵴前體最初定位于在神經(jīng)板和外胚層之間的細胞層，這一區(qū)域稱為神經(jīng)板邊界（Neural plate boundary，NPB）［15］。Pax3 和Pax7 最早出現(xiàn)在神經(jīng)板的外側邊緣，用來區(qū)分神經(jīng)板和外胚層。隨著神經(jīng)誘導的進行，神經(jīng)板的外側邊緣增加Pax3 和Pax7 的表達，這標記了神經(jīng)分化結束時閉合脊髓的背側。在雞、非洲爪蟾和斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，Wnt、FGF和BMP信號協(xié)同調控神經(jīng)板邊界的形成。Wnt 和FGF 配體由神經(jīng)板和下層中胚層分泌，而表皮外胚層產生BMP 配體，神經(jīng)板分泌BMP 拮抗劑，導致BMP 信號沿背腹軸梯度分布。NPB 被指定在接受中等劑量的BMP 信號的外胚層區(qū)域。BMP、Wnt和FGF 這些信號的結合誘導NPB 特異性基因的表達，包括Pax3／7 和Zic 家族的成員。非洲爪蟾中的研究表明，Pax3 在神經(jīng)板邊緣的表達受規(guī)范的Wnt 信號通過直接和間接兩種方式調節(jié)。Pax3可以被規(guī)范的Wnt信號直接誘導，也可以通過轉錄因子AP2a來觸發(fā)Pax3和Msx1。Pax3是AP2a的即時早期目標。在Pax3上游基因序列中發(fā)現(xiàn)2 個可能的AP2a 結合位點，該序列驅動Pax3 在神經(jīng)邊界的強勁表達，同時AP2a 被證明調節(jié)神經(jīng)嵴標記物Sox10 的活性［16］。對斑馬魚中兩個Pax3 神經(jīng)嵴特異性增強子的詳細分析顯示，每個增強子都是由Wnt、FGF 和BMP 信號的精確整合激活的。在雞胚的神經(jīng)板和相鄰的非神經(jīng)外胚層之間邊界的建立和維持中，Msx-1 是BMP 信號傳遞的靶標，在神經(jīng)板邊界表達的時間很早。有趣的是，Msx1 由FGF 和Hensen's Node 信號誘導產生，卻作為BMP 信號的早期靶點發(fā)揮作用［17］。同時，Pax7 由轉錄調控因子cMyb介導FGF信號激活，cMyb的缺失降低了神經(jīng)板邊界中Pax7和Twist的表達。cMyb能夠與Pax7中的增強子相互作用，調控報告基因Pax7的早期表達［14］。在神經(jīng)形成過程中，這些對Pax3／7 激活的精細控制對于胚胎外胚層不同區(qū)域的形成，尤其是神經(jīng)板邊界非常關鍵［圖3（a）］。

3.2 Pax3和Pax7在神經(jīng)嵴形成中的調控

神經(jīng)嵴是一種短時的、高度多能性的胚胎細胞群，在脊椎動物中形成各種細胞和組織。神經(jīng)嵴細胞（NCC）起源于原腸胚形成過程中的神經(jīng)性和非神經(jīng)性外胚層之間的邊緣，隨著神經(jīng)褶的形成在封閉的神經(jīng)管的背部融合。NPB 特異性因子（Msx1／2、Pax3／7）對于NC誘導是必不可少的，但在誘導后通常不保持在NC 細胞中。它們通過不同的作用將FGF、Wnt 和BMP信號整合到NC特異性因子的一致誘導中，這個網(wǎng)絡在脊椎動物進化過程中保守。在神經(jīng)外胚層中，Mxs1足以誘導多個早期神經(jīng)嵴基因，Msx1 自主誘導Pax3 和ZicR1，反過來Pax3 結合ZicR1 激活依賴Wnt 信號的Slug［18］。另一方面，Wnt 直接通過Pax3 激活Slug，而FGF 通過Pax3 和Msx1 兩種途徑誘導神經(jīng)嵴發(fā)育。類似地，神經(jīng)嵴細胞的一個早期標記同源盒基因Gbx2，同樣被Wnt 信號激活而介導Pax3 表達［19］。因此，在神經(jīng)嵴誘導過程中，Wnt 和FGF 信號在神經(jīng)邊界處并行作用并整合調節(jié)Pax3表達。Pax7是神經(jīng)嵴的一個早期標記，也是神經(jīng)嵴發(fā)育的必要組成部分，阻斷Pax7的翻譯會抑制神經(jīng)嵴特異性基因Slug、Sox9、Sox10 和HNK-1的表達。在雞胚中，Pax7 缺失導致早期神經(jīng)嵴特異性因子（如Snail2 或Foxd3）激活失敗，隨后神經(jīng)嵴遷移和進一步發(fā)育不足。發(fā)育異常胚胎的表型與哺乳動物的Pax3突變體非常相似，有神經(jīng)管開放、顱面和色素缺陷等特征［20］。綜上所述，Pax3 和Pax7 通過整合來自FGF、Wnt 和BMP 的信號，同時激活多個神經(jīng)嵴特異性因子：Slug、Sox9／10、Snail1／2、Foxd3、Ets1、Twist 和HNK-1來實現(xiàn)完整的神經(jīng)嵴發(fā)育級聯(lián)反應［圖3（b）］。

圖3 Pax3和Pax7在神經(jīng)板邊界和神經(jīng)嵴發(fā)育過程中的調控網(wǎng)絡Figure 3 Regulatory networks of Pax3 and Pax7 in neural plate boundary（NPB）and neural crest（NC）development

3.3 Pax3和Pax7與神經(jīng)嵴細胞的遷移和分化

神經(jīng)嵴細胞（NCC）是脊椎動物特有的多能遷移細胞，出現(xiàn)在神經(jīng)板（NP）和非神經(jīng)外胚層的交界處，結合到神經(jīng)褶／背側神經(jīng)管中，并以固定模式在整個胚胎中遷移。神經(jīng)嵴細胞廣泛遷移并產生多種衍生物，包括顱骨和軟骨、脂肪組織、周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和膠質細胞以及色素細胞。NCC 的缺陷會導致神經(jīng)病變，包括黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、唇腭裂和先天性巨結腸。

Pax3 調節(jié)祖細胞增殖和維持未分化表型的能力，在神經(jīng)嵴細胞（Neural crest cell，NCC）的遷移中發(fā)揮重要作用。Pax3 缺陷小鼠中神經(jīng)嵴細胞正常遷移，但祖細胞增殖能力降低，從而導致發(fā)育缺陷。NCC 標記物Pax3 是典型Wnt 信號下游Cdx 蛋白的直接靶點。Cdx蛋白通過與Pax3中進化保守的Nce2增強子Cdx結合位點的直接結合，將規(guī)范的Wnt 信號傳遞到Pax3 近端的啟動子［21］。cMyb 在調節(jié)神經(jīng)嵴指定基因Ets1 的表達中起著關鍵作用，二者是遷移前和遷出的顱神經(jīng)嵴細胞中Sox10 初始表達的直接激活因子［22］。因此，通過作用于Pax3 的上游，規(guī)范的Wnt-Cdx 途徑可能控制正常神經(jīng)嵴和神經(jīng)管發(fā)育所需的祖細胞群體的細胞分化和維持。值得注意的是，Pax7 除了作為禽類胚胎神經(jīng)嵴形成所需的早期標記外，還參與了神經(jīng)嵴細胞的遷移［23］。在腹側遷移開始之前，一些NC 細胞沿著背側神經(jīng)管發(fā)生縱向遷移。Pax7即表達于遷移中的主干NC細胞，位于內部和側向遷移路線。此外，由于NC經(jīng)常以相鄰細胞流的形式出現(xiàn)，轉錄因子Pax7 的核表達為NCC分類提供了可靠的方法。

4 小結與展望

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是整個生命體發(fā)育過程中極其重要的組成部分，顯然，從胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的早期到大腦的成熟，Pax3 和Pax7 在神經(jīng)發(fā)生中起著關鍵作用。最初的擴展表達決定神經(jīng)源性譜系，隨后的表達限制作用于神經(jīng)管的背側和特定的大腦區(qū)域。Pax3的表達起始于神經(jīng)管的發(fā)生，結束于神經(jīng)管的尾部；Pax7最終特異性地表達在上丘／視頂蓋的SGF層，說明Pax7在脊椎動物視覺系統(tǒng)的形成中起著重要作用；Pax3和Pax7出現(xiàn)在早期原腸胚從非神經(jīng)外胚層分化衍生的神經(jīng)板中，二者對神經(jīng)嵴的發(fā)生、遷移和分化具有重要作用。

我們的前期實驗證實，在脊髓發(fā)育過程中Pax3 和Pax7 之間相互調控，過表達Pax3 和Pax7 動態(tài)調控Cadherin-7（Cdh7）可導致神經(jīng)元分化遷移異常［24］，同時神經(jīng)元軸突生長受抑制且不能投射到達相應部位［25］，說明Pax3和Pax7在脊髓發(fā)育過程中也扮演重要角色。轉錄組測序和生物信息學分析顯示異常表達Pax3、Pax7 和Wnt／β-catenin 信號通路密切相關，這一結果與Pax3／Pax7 與β-catenin 相互作用調控神經(jīng)管閉合和延伸以及Pax3 和Pax7 參與非經(jīng)典Wnt 信號通路體外調節(jié)細胞行為相一致。綜上所述，Pax3 和Pax7 作為經(jīng)典的轉錄因子在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)管和神經(jīng)嵴發(fā)生發(fā)育方面研究較為系統(tǒng)，但是有關Pax3／Pax7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中如調控神經(jīng)前體細胞分化、遷移、軸突生長和路徑選擇等的研究尚屬空白，調控機制仍不清楚。Pax3 和Pax7 對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的具體調控機制仍有待于進一步研究。系統(tǒng)而深入地研究將有助于對神經(jīng)發(fā)育調控機制認識的突破，推動發(fā)育生物學和神經(jīng)生物學等多學科共同進步。