十二烷基羥丙基磺基甜菜堿對表皮葡萄球菌生物被膜的影響

石晶金，李 杰，許錦濤，吳嘉迪，官 妍

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院，上海200030；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，合肥230012；3.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，連云港222005）

表皮葡萄球菌是正常人體主要共生菌之一，也是附著于導(dǎo)管、假體、隱形眼鏡、人工關(guān)節(jié)等醫(yī)用生物材料上導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌，其在生物材料表面所形成的生物被膜是造成相關(guān)感染治療困難的主要原因［1］。細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌附著在有生命或無生命體表面，被自身分泌的胞外黏質(zhì)物（Extracellular poly?meric substance，EPS）包裹，具有高度組織化的多細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)［2］，是細(xì)菌為了適應(yīng)周圍的環(huán)境而形成的一種生存方式［3］。與浮游狀態(tài)的細(xì)菌相比，生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌對抗生素抗性提高1 000～1 500 倍，對機(jī)體的免疫細(xì)胞、抗體等也都有極高的抗性［4］，單用任何一種抗生素均無法徹底殺滅生物被膜內(nèi)細(xì)菌。在適宜條件下，這些存活的膜內(nèi)菌又可以游離出來，在機(jī)體其他地方定植并形成新的感染灶，使感染反復(fù)遷延，給臨床治療帶來困難。

表面活性劑的抑菌、殺菌作用早為人所熟知，同時它又是一種帶電荷、有親水和疏水雙重功效并可改變兩相性質(zhì)的物質(zhì)。其在醫(yī)用材料的界面處可發(fā)生定向吸附，從而大幅提高抑菌效果，阻止細(xì)菌黏附和成膜。由于細(xì)菌生物被膜顯示負(fù)電性，就可能與表面活性劑相互作用，影響EPS的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致生物被膜的瓦解。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，兩性離子型表面活性劑——十二烷基羥丙基磺基甜菜堿（Dodecyl hydroxypro?pyl sulfobetaine，DSB）的抑菌（MIC 為16 mg/L）及抗細(xì)菌初始黏附效果均較為突出。DSB 因結(jié)構(gòu)中同時帶有羥基及陰離子和陽離子基團(tuán)，不僅具有兩性表面活性劑的所有優(yōu)點，廣泛用于家居洗滌劑的配制和制備溫和的嬰兒洗護(hù)用品，亦具有耐高濃度酸、堿鹽，良好的乳化性、分散性和抗靜電性，以及具有抑霉、殺菌性和黏彈性等。研究通過DSB對表皮葡萄球菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌代謝、對生物被膜的清除效率和對形成生物被膜的關(guān)鍵物質(zhì)多糖胞間黏附素（Polysaccharide intercellu?lar adhesion，PIA）產(chǎn)生等作用指標(biāo)的檢測，去探究其對表皮葡萄球菌生物被膜的抑制和破壞作用，拓展DSB 在醫(yī)療上更多的用途，為更好地控制由表皮葡萄球菌生物被膜所引起的醫(yī)院獲得性感染，提供新的思路和可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

表皮葡萄球菌ATCC 35984（生物被膜表型和PIA表型均為陽性），復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院瞿滌教授饋贈；ATCC 12228（生物被膜表型和PIA 表型均為陰性），購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 培養(yǎng)基

瓊脂粉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSA、TSB，杭州微生物試劑有限公司）；剛果紅培養(yǎng)基（剛果紅0.8 g/L，腦心浸液干粉47 g/L，蔗糖36 g/L，瓊脂粉20 g/L；本實驗室配制）。

1.1.3 藥物與試劑

萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；DSB（上海銀聰新材料科技有限公司），XTT（生工生物工程股份有限公司）；甲萘醌（上海笛柏生物科技有限公司）；丙酮（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；N-（2-羥乙基）哌嗪-N-（2-乙磺酸）（無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司）；GH 溶液：2.38 g N-（2-羥乙基）哌嗪-N-（2-乙磺酸）溶于約10 mL 水中，再加入右旋葡萄糖0.2 振蕩溶解。

1.1.4 實驗器材

K3 型酶標(biāo)儀（LabServ）；激光共聚焦電子顯微鏡（Olympus IX81）；激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿（NEST）。

1.2 方法

1.2.1 DSB對表皮葡萄球菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌代謝的影響

以往實驗測得DSB、萬古霉素對ATCC 35984 的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）分別為16和8 mg/L［5］。

XTT 作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物。通過酶標(biāo)儀檢測水溶性甲臜產(chǎn)物的吸光度，可以反映細(xì)胞中脫氫酶活性的高低，繼而反映對細(xì)胞代謝的影響。當(dāng)XTT 與電子耦合劑聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性甲臜產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。參照文獻(xiàn)［6］將搖床培養(yǎng)過夜的ATCC 35984 以TSB 稀釋至0.5 Mc（麥?zhǔn)蠁挝唬?，?00 μL 的菌液接種入96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基及懸浮菌，用PBS清洗3次。以TSB對倍稀釋DSB、萬古霉素，分別加入DSB（1 024、512、256、128、64、32、16 和8 mg/L）、萬古霉素（512、256、128、64、32、16、8 和4 mg/L）（每個濃度設(shè)8 個復(fù)孔）100 μL，于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入XTT 溶液（林格液稀釋為0.5 g/L，0.22 μm 孔徑的濾膜過濾除菌，臨用前加VK3）100 μL，37 ℃避光培養(yǎng)2 h；630 nm波長處檢測各孔OD值。另設(shè)空白對照組（只加培養(yǎng)基）、陰性對照組（未加藥劑的生物被膜生長對照）。

1.2.2 DSB對PIA形成的影響

參照文獻(xiàn)［7］用TSB分別配制DSB（16和8 mg/L）、萬古霉素（8 和4 mg/L）1 mL 于試管中，均加入搖床過夜增菌的ATCC 35984（0.5 Mc）50 μL（5%的接種量）。取37 ℃培養(yǎng)4、8、12、16、20 和24 h 等時間段的菌液分別分區(qū)劃線在剛果紅培養(yǎng)基上［8］，37 ℃培養(yǎng)24 h后，室溫放置24 h，觀察菌落顏色。另設(shè)陽性對照（0.5 Mc ATCC 35984），陰性對照（0.5 Mc ATCC 12228）。

1.2.3 DSB對表皮葡萄球菌生物被膜清除效率的測定

在管道安裝過程中，焊接出現(xiàn)夾渣的現(xiàn)象較為普遍。管道焊接過程中，存在焊接夾渣主要是由于焊接工人的技術(shù)水平偏低，焊接技術(shù)水平未能很好地滿足管道焊接的需求。焊接夾渣的現(xiàn)象發(fā)生的概率較高，并且不能確定產(chǎn)生的位置。焊接夾渣對于管道金屬質(zhì)量產(chǎn)生的影響較大，并且與焊接位置清理以及焊接電流設(shè)置有著密切關(guān)聯(lián)。對此，必須提升焊接工人的技術(shù)水平，提升綜合能力，才能有效提升焊接的質(zhì)量，才能有效確保管道安裝的質(zhì)量。

通過文獻(xiàn)［9-10］方法，向96 孔板中加入100 μL 0.5 Mc 的ATCC 35984，于37 ℃培養(yǎng)24 h 后，去除菌液和培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗3次，依次加入DSB（終質(zhì)量濃度為64、32、16、8 和4 mg/L），萬古霉素（終質(zhì)量濃度為32、16、8、4和2 mg/L），每個濃度均設(shè)8個復(fù)孔；于37 ℃分別培養(yǎng)6、12和24 h后取出，PBS清洗3次，加XTT溶液（配制、處理方法同1.2.1），于37 ℃避光培養(yǎng)2 h。另設(shè)空白對照組（只加培養(yǎng)基）和陰性對照組（未加藥劑的生物被膜生長對照），于630 nm波長下測出OD值。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察DSB對表皮葡萄球菌生物被膜的清除效率

吸取500 μL 0.5 Mc 的ATCC 35984 加入到激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿凹槽中，37 ℃培養(yǎng)24 h。棄去懸浮菌和培養(yǎng)基，用PBS 清洗1 次，吸取DSB（64、32 和16 mg/L）、萬古霉素（32、16 和8 mg/L）各500 μL，分別加入到各培養(yǎng)皿凹槽中，37 ℃分別培養(yǎng)6、12 和24 h。設(shè)置陰性對照。

各組樣本培養(yǎng)到規(guī)定時間后，吸棄上層培養(yǎng)基，用無菌PBS 洗去未黏附的浮游菌，吸取1 mL FUN1 染液（4 μL FUN1 染料加入10 mL GH 溶液中，配成FUN1 染液），加入各培養(yǎng)皿中，37 ℃避光染色30 min。激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行3D 掃描（激發(fā)波長532 nm，發(fā)射波長640 nm）；先用100 倍低倍鏡觀察生物被膜完整程度，然后設(shè)定Z 軸，選用200 倍視野連續(xù)掃描8 層并拍照；每組平行測3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 24.0 軟件，進(jìn)行兩樣本間獨立t 檢驗；數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSB對ATCC 35984生物被膜內(nèi)細(xì)菌代謝的影響

如圖1 所示，與陰性對照組相比，質(zhì)量濃度為1 024、512、256 和128 mg/L 的DSB 對ATCC 35984 生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝有極顯著影響（P ＜0.001）；質(zhì)量濃度為64 mg/L時，對生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝亦有明顯影響（P＜0.01）；當(dāng)質(zhì)量濃度為32、16 和8 mg/L 時，對ATCC 35984生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝無明顯影響（P＞0.05）；表明DSB 在4 MIC 以上濃度時可影響生物被膜內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞的酶活力，顯著抑制細(xì)胞代謝。與陰性對照組相比，質(zhì)量濃度為512、256、128、64、32 和16 mg/L 的萬古霉素，對ATCC 35984生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝有極顯著影響（P＜0.001）；當(dāng)質(zhì)量濃度為8 和4 mg/L 時，對ATCC 35984生物被膜內(nèi)菌的代謝無明顯影響（P＞0.05），表明萬古霉素在2 MIC 以上濃度時才可顯著抑制生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝（圖2）。

圖1 不同質(zhì)量濃度DSB對ATCC 35984生物被膜內(nèi)菌代謝的影響（,n=8）Figure 1 Effects of different concentrations of DSB on bacterial metabolism in ATCC 35984 biofilm（,n=8）

圖2 不同質(zhì)量濃度萬古霉素對ATCC 35984生物被膜內(nèi)菌代謝的影響（,n=8）Figure 2 Effects of different concentrations of vancomycin on bacterial metabolism in ATCC 35984 biofilm（,n=8）

2.2 DSB對PIA形成的影響

與陽性對照ATCC 35984 產(chǎn)膜菌株和陰性對照ATCC 12228 不產(chǎn)膜菌株（圖3）相比，DSB 質(zhì)量濃度為16 和8 mg/L 時，分別作用4、8、12、16、20 和24 h 后，ATCC 35984 在剛果紅培養(yǎng)基表面長出的菌落顏色均為黑色，表明在MIC 以下濃度的DSB 并不能顯著影響PIA 的形成（圖4）。萬古霉素質(zhì)量濃度為8 和4 mg/L，作用4、8、12 和16 h 時，ATCC 35984 在剛果紅培養(yǎng)基表面長出的菌落顏色均為黑色，20 和24 h 時菌落顏色為紅色，表明萬古霉素在作用較長時間后可影響PIA的形成，結(jié)果見圖5。

圖3 PIA陽性菌株與PIA陰性菌株在剛果紅培養(yǎng)基上菌落顏色對照Figure 3 Colony color comparison of PIA positive strains and PIA negative strains on Congo red medium

圖4 DSB作用后ATCC 35984在剛果紅培養(yǎng)基上菌落顏色Figure 4 Colony color of ATCC 35984 on Congo red medium after DSB treatment

2.3 DSB對表皮葡萄球菌生物被膜清除效率的測定

由表2可知，與陰性對照組相比，萬古霉素的終質(zhì)量濃度依次為32 和16 mg/L 在6 h 對ATCC 35984 已形成的生物被膜有較明顯的清除作用（P＜0.001），其中質(zhì)量濃度為32 mg/L萬古霉素在6、12和24 h對ATCC35984的生物被膜清除作用均極顯著（P＜0.001），但清除率最高只達(dá)到33.33%，8 mg/L 以下質(zhì)量濃度的萬古霉素在作用12和24 h時甚至促進(jìn)了生物被膜菌的生長，具體機(jī)制尚不清楚。

圖5 萬古霉素作用后ATCC 35984在剛果紅培養(yǎng)基上菌落顏色Figure 5 Colony color of ATCC 35984 on Congo red medium after vancomycin

表1 不同質(zhì)量濃度的DSB對ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 1 Clearance efficiency and clearance rate of DSB with different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

表1 不同質(zhì)量濃度的DSB對ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 1 Clearance efficiency and clearance rate of DSB with different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

注：*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；表中清除率計算公式：清除率（%）=（對照組OD630-實驗組OD630）／ 對照組OD630×100%

質(zhì)量濃度/（mg/L）時間/h 6 12 24 4 8 16 32 64陰性對照OD630 0.36±0.01**0.35±0.01***0.27±0.01***0.16±0.01***0.11±0.01***0.38±0.01清除率/%5.26 7.89 28.95 57.89 71.05 OD630 0.38±0.02***0.32±0.04***0.24±0.04***0.16±0.02***0.07±0.03***0.47±0.03清除率/%19.15 31.91 48.94 65.96 85.11 OD630 0.34±0.01*0.25±0.01***0.22±0.01***0.09±0.01***0.05±0.01***0.37±0.04清除率/%8.11 32.43 40.54 75.68 86.49

表2 不同質(zhì)量濃度的萬古霉素對ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 2 Clearance efficiency and clearance rate of vancomycin at different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

表2 不同質(zhì)量濃度的萬古霉素對ATCC 35984生物被膜的清除效率和清除率（,n=8）Table 2 Clearance efficiency and clearance rate of vancomycin at different mass concentrations on ATCC 35984 biofilm（,n=8）

注：*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001；表中清除率計算公式：清除率（%）=（對照組OD630-實驗組OD630）／ 對照組OD630×100%

質(zhì)量濃度/（mg/L）時間/h 6 12 24 2 4 8 16 32陰性對照OD630 0.42±0.04*0.48±0.03***0.37±0.06 0.28±0.03***0.28±0.04***0.38±0.03清除率/%0.00 0.00 2.63 26.32 26.32 OD630 0.35±0.07 0.48±0.05***0.54±0.10***0.42±0.12*0.20±0.03***0.30±0.01清除率/%0.00 0.00 0.00 0.00 33.33 OD630 0.45±0.05**0.45±0.05**0.44±0.06*0.38±0.05 0.28±0.02***0.38±0.04清除率/%0.00 0.00 0.00 0.00 26.32

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察DSB 對表皮葡萄球菌生物被膜的清除效率

以激光共聚焦顯微鏡選用200 倍視野連續(xù)掃描8層并拍照。每組平行測3 次。所得結(jié)果（圖6 和圖7）顯示：當(dāng)細(xì)菌生物被膜完整，膜內(nèi)細(xì)菌正常存活時，圖片上熒光強(qiáng)烈；而當(dāng)生物被膜被破壞，膜內(nèi)細(xì)菌死亡或受損時，則圖片所顯示的熒光變?nèi)趸蛳АＭㄟ^觀察發(fā)現(xiàn)，DSB對ATCC 35984形成的生物被膜清除的效果明顯強(qiáng)于萬古霉素（圖6和圖7）。

圖6 激光共聚焦電子顯微鏡觀察DSB對ATCC 35984生物被膜的清除作用（×200）Figure 6 Scavenging effect of DSB on ATCC 35984 biofilm observed by laser confocal electron microscope（×200）

圖7 激光共聚焦電子顯微鏡觀察萬古霉素對ATCC 35984生物被膜的清除作用（×200）Figure 7 Scavenging effect of vancomycin on ATCC 35984 biofilm observed by laser confocal electron microscopy（×200）

3 討論與結(jié)論

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，各種醫(yī)學(xué)材料（人工晶體、人工關(guān)節(jié)、內(nèi)置導(dǎo)管及人工心臟瓣膜等）的使用大大提高了患者的生存率及生存質(zhì)量，但內(nèi)置的生物醫(yī)學(xué)材料引起的醫(yī)院感染也日益增加。表皮葡萄球菌可附著在生物材料表面進(jìn)入人體，在材料表面形成生物被膜，有效地逃避人體免疫系統(tǒng)的識別和清除，對抗菌藥物產(chǎn)生抵抗的作用，給臨床治療帶來了諸多困難。

目前已知，細(xì)菌可通過黏附（0～4 h）、聚集（6～12 h）、成熟（24 h）、脫落（30～48 h）等4 個階段形成生物被膜［11-12］，其中聚集階段與表皮葡萄球菌產(chǎn)生的PIA、SarA 和群體感應(yīng)系統(tǒng)agr的表達(dá)有關(guān)［13］，尤其依賴PIA的合成。細(xì)菌生物被膜逐漸“成熟”后，細(xì)菌可從生物被膜中脫落、遷徙而產(chǎn)生新的感染性病灶。

前期研究發(fā)現(xiàn)［5］，DSB對產(chǎn)膜表皮葡萄球菌ATCC 35984的MIC為16 mg/L，呈現(xiàn)良好的抑菌效果；無論是對惰性材料預(yù)處理或是直接干預(yù)，DSB 均具有顯著抑制細(xì)菌初始黏附的作用。本研究發(fā)現(xiàn)：1 024、512、256、128和64 mg/L的DSB，對ATCC 35984生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝均有顯著抑制作用（P＜0.01）；但與陽性對照藥萬古霉素相比，總體效果略弱。

在對生物被膜的清除作用方面，DSB 亦有較明顯的效果；無論是通過XTT 減低法定量檢測還是激光共聚焦電子顯微鏡定性檢測，均顯示質(zhì)量濃度為64和32 mg/L的DSB 對ATCC 35984 生物被膜的清除作用極為顯著（P＜0.001），清除效率在50%以上；總體效果強(qiáng)于萬古霉素。但亦發(fā)現(xiàn)XTT減低法與激光共聚焦電子顯微鏡測得的結(jié)果并不完全一致，可能與顯微鏡觀察點較少，生物被膜厚度不夠均一有關(guān)。

在剛果紅平板實驗中，質(zhì)量濃度為16 和8 mg/L時，DSB 對ATCC 35984 的PIA 合成并無明顯抑制作用；可知DSB 對表皮葡萄球菌生物被膜聚集階段關(guān)鍵物質(zhì)PIA 的形成沒有顯著影響；推測DSB 可能是通過其他途徑去影響或破壞表皮葡萄球菌生物被膜的。Valentine 等［14］證實，檸檬酸兩性離子表面活性劑（Cit?ric acid zwitterionic surfactant，CAZS）能螯合生物被膜基質(zhì)中的鈣離子橋，減少生物被膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；佘鵬飛等［15］體外研究證實CAZS 能使細(xì)菌生物被膜的尺寸和厚度大量減少，提示兩性離子型表面活性劑可以通過破壞生物被膜基質(zhì)的某些結(jié)構(gòu)去影響生物被膜的完整性和穩(wěn)定性，這為進(jìn)一步探究DSB 對表皮葡萄球菌生物被膜的作用提供了參考。

在治療感染性疾病方面，臨床上通常首選抗生素殺死細(xì)菌控制感染。然而大量使用甚至濫用抗生素，容易造成細(xì)菌耐藥，且細(xì)菌耐藥的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于抗生素研發(fā)的速度。目前尚未發(fā)現(xiàn)能對抗細(xì)菌生物被膜的強(qiáng)效抗生素。兩性離子表面活性劑最大的特點是無論在酸性、中性或堿性的水溶液中都能溶解。本研究證實了兩性離子表面活性劑DSB對表皮葡萄球菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌活力的影響、對生物被膜清除的作用，提示DSB 可能是一種有效的表皮葡萄球菌生物被膜的清除劑，這為醫(yī)用內(nèi)置材料及醫(yī)療器械等的除菌、殺菌提供了另一種選擇。