不同產(chǎn)地柴胡的HPLC指紋圖譜與有效成分分析

董蘇瑩，杜靈均，王安琪，尹 鑫，周志杰，田曄林*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442； 3.承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000)

柴胡作為常用的中藥材之一，在中國(guó)使用歷史悠久，具有解表和里、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效,為中醫(yī)治療少陽(yáng)證的首選要藥[1-5]。柴胡最早被記載是在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，該書(shū)將中藥材分為上、中、下三品，柴胡被列為上品[6-10]?！吨袊?guó)藥典》2015年版一部收載的柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按性狀不同，分別習(xí)稱(chēng)“北柴胡”和“南柴胡”[11]。據(jù)報(bào)道在全球約有200種柴胡屬植物，主要在歐亞大陸及北非有分布[12]，中國(guó)已報(bào)道的柴胡屬植物有42種，17個(gè)變種及7個(gè)變型[13]。1916年惠澤等報(bào)道了柴胡中的主要有效成分為柴胡皂苷[14]，其中柴胡皂苷a、d的生物活性最強(qiáng)。柴胡皂苷a是柴胡抗癲癇作用的主要生物活性成分，柴胡皂苷d具有抑制肝組織纖維化、抑制肝臟癌細(xì)胞增殖的功能[15]。皂苷類(lèi)成分主要在柴胡的根部，而地上部分則很少[16]。

高效液相色譜法(HPLC)具有分離效能高，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于定性定量分析中藥材及其制劑有效成分[17]。由于中藥的成分較為復(fù)雜，選用高效液相色譜法構(gòu)建中藥指紋圖譜時(shí)，一般多采用梯度洗脫的方法，這樣能夠分開(kāi)中藥中的大多數(shù)成分，因而能更準(zhǔn)確、充分地揭示中藥的鑒別信息[18]。本研究以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為參照組分，通過(guò)HPLC法，對(duì)不同產(chǎn)地的柴胡進(jìn)行指紋圖譜研究，為柴胡的質(zhì)量評(píng)價(jià)和種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

共收集了11個(gè)不同產(chǎn)地的柴胡樣品(表1)(由田曄林副教授鑒定，保存于北京農(nóng)學(xué)院園林樓)，測(cè)試樣品為陰干處理的干燥的根。

表1 材料來(lái)源Tab.1 Origin of Bupleuri Radix

1.2 分析方法

1.2.1 儀器 研磨儀(Retsch GmbH MM400)、篩子(孔徑0.25 mm)、超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52)、高效液相色譜儀(Waters2695)、檢測(cè)器(waters2998 PAD)、Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm，150 A)(天津艾杰爾生物公司)。

1.2.2 試劑 濃氨水、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、蒸餾水、柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品(E-0239)、柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品(E-0240)(購(gòu)自上海同田生物有限公司)。

1.2.3 溶液的制備 分別稱(chēng)取一定量的柴胡皂苷a、d對(duì)照品，加入甲醇，制成0.4 mg/L的柴胡皂苷a溶液，0.5 mg/L的柴胡皂苷d溶液，搖勻。

將柴胡用研磨儀打成粉末狀，0.25 mm孔徑過(guò)篩后稱(chēng)取0.5 g，置于50 mL塑料管中，加入25 mL含5%濃氨試液的甲醇溶液，密塞，超聲處理(功率600 W,頻率40 kHz)30 min，水溫為30 ℃，濾過(guò)，用20 mL甲醇分為2次進(jìn)行容器和藥渣的洗滌，洗液與濾液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑至干。加入適量甲醇溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用注射器吸取2 mL溶液，后用0.22 μm濾膜過(guò)濾至色譜進(jìn)樣瓶中，做好樣品標(biāo)記。

1.2.4 高效液相色譜測(cè)定 使用Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm，150 A)，以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，等度洗脫，皂苷a A∶B=40∶60,皂苷d A∶B=45∶55；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。測(cè)定時(shí)精密吸取20 μL進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 線性關(guān)系考察 取1.2.3中制備好的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將進(jìn)樣量分別設(shè)置為2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，上機(jī)檢測(cè)后以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果柴胡皂苷a回歸方程為y=296 809x-35 248，R2=0.999 6，柴胡皂苷d回歸方程為y=304 388x-94 946，R2=0.999 4。

1.2.6 精密度考察 取1.2.3中制備好的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置每次進(jìn)樣量20 μL，連續(xù)6次進(jìn)樣，通過(guò)所得圖譜進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算得出柴胡皂苷a的RSD為1.10%，柴胡皂苷d的RSD為0.75%，表明儀器精密度良好。

1.2.7 重復(fù)性考察 用1.2.3方法制備2號(hào)柴胡樣品6份，設(shè)置每次進(jìn)樣量20 μL，連續(xù)6次進(jìn)樣。計(jì)算得出柴胡皂苷a的RSD為2.25%，柴胡皂苷d的RSD為3.27%，表明重復(fù)性良好。

1.2.8 穩(wěn)定性考察 用1.2.3方法制備2號(hào)柴胡樣品一份，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、24 h、48 h進(jìn)樣進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，進(jìn)樣量20 μL。計(jì)算得出柴胡皂苷a的RSD為1.85%，柴胡皂苷d的RSD為0.50%，表明室溫下混合對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。

1.2.9 加樣回收率考察 用1.2.3方法制備2號(hào)柴胡樣品并加入1 mg柴胡皂苷a、柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品制備成混合溶液，通過(guò)色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣量20 μL。計(jì)算得出柴胡皂苷a的加樣回收率為100.73%，RSD為1.65%；柴胡皂苷d的加樣回收率為95.56%，RSD為1.02%。

1.2.10 不同產(chǎn)地柴胡HPLC指紋圖譜的建立 利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件進(jìn)行指紋圖譜的建立及相似度計(jì)算，根據(jù)生成峰圖進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，并驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地柴胡皂苷a的含量及色譜圖

通過(guò)高效液相色譜儀上機(jī)檢測(cè)，11個(gè)不同產(chǎn)地的柴胡進(jìn)樣量均為20 μL，藥用成分柴胡皂苷a含量測(cè)定結(jié)果如表2所示，色譜結(jié)果如圖1所示。

從表2中可以看出，11個(gè)柴胡藥材樣品中柴胡皂苷a的含量從高到低依次是甘肅人工種植兩年生柴胡(2.654%)、海升堂藥店購(gòu)買(mǎi)柴胡(1.705%)、河北承德人工種植兩年生柴胡(1.449%)、陜西人工種植三年生柴胡(1.012%)、同仁堂藥店購(gòu)買(mǎi)柴胡(0.865%)、東北野生柴胡(0.553%)、河北承德人工種植三年生柴胡(0.389%)、山西人工種植兩年生柴胡(0.302%)、隆化野生柴胡(0.222%)、豐寧野生柴胡(0.178%)、海拉爾野生柴胡(0.101%)。最后三個(gè)地點(diǎn)的柴胡皂苷a的含量未達(dá)到中國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)。

表2 11個(gè)不同產(chǎn)地柴胡的柴胡皂苷a和皂苷d含量Tab.2 Contents of saikosaponin a in Bupleuri Radix from 11 different habitats

2.2 不同產(chǎn)地柴胡皂苷d的含量及色譜圖

通過(guò)高效液相色譜儀上機(jī)檢測(cè)，11個(gè)不同產(chǎn)地的柴胡的藥用成分柴胡皂苷d含量測(cè)定結(jié)果如表2所示，色譜結(jié)果如圖2所示。從表2中可以看出，11個(gè)柴胡樣品中柴胡皂苷d的含量從高到低依次是甘肅人工種植兩年生柴胡(3.287%)、陜西人工種植三年生柴胡(1.619%)、同仁堂藥店購(gòu)買(mǎi)柴胡(1.495%)、海升堂藥店購(gòu)買(mǎi)柴胡(1.490%)、河北承德人工種植2年生柴胡(0.756%)、東北野生柴胡(0.734%)、海拉爾野生柴胡(0.538%)、河北承德人工種植三年生柴胡(0.485%)、隆化野生柴胡(0.441%)、山西人工種植兩年生柴胡(0.416%)、豐寧野生柴胡(0.115%)。僅豐寧的未達(dá)到中國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 不同產(chǎn)地柴胡皂苷a和柴胡皂苷d總含量

通過(guò)對(duì)表2中柴胡皂苷a、d總含量的計(jì)算可以看出，不同產(chǎn)地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d總含量在0.292%～5.941%之間，總含量最高的比最低的高出5.649%，其中甘肅人工種植兩年生柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總含量最高，為5.941%，豐寧野生柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總含量最低，為0.292%。通過(guò)對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)自河北地區(qū)的4個(gè)柴胡樣品中，野生柴胡的柴胡皂苷a、d的總含量低于人工種植柴胡。還發(fā)現(xiàn)山西產(chǎn)柴胡的柴胡皂苷a、d的總含量低于甘肅產(chǎn)，這與余菁等[19]研究結(jié)果相一致。

《中國(guó)藥典》2015年版一部中規(guī)定北柴胡的柴胡皂苷a、d的總量最低為0.30%[20]，分析實(shí)際所得數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，除豐寧野生柴胡以外，其他地區(qū)的總量均在0.30%以上，最高者可達(dá)5.941%。

2.4 不同產(chǎn)地柴胡皂苷a、d的HPLC指紋圖譜匹配建立及相似度評(píng)價(jià)

分別以柴胡皂苷a、d標(biāo)準(zhǔn)品為參照?qǐng)D譜生成對(duì)照峰R(圖3)，進(jìn)行多點(diǎn)校正。通過(guò)色譜圖上重疊峰進(jìn)行對(duì)比，非共有峰所占比例較大。通過(guò)圖譜之間對(duì)比，柴胡樣品間皂苷含量和出峰時(shí)間存在明顯

差異，是生長(zhǎng)區(qū)域和生長(zhǎng)環(huán)境不同導(dǎo)致的[6,21]。

將色譜圖匹配到《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》中，通過(guò)相似度軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表3所示，與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行對(duì)比，柴胡皂苷a的相似度在0.106～0.937之間，柴胡皂苷d的相似度在0.029～0.955之間。

表3 柴胡皂苷a、d相似度結(jié)果Tab.3 Similarity results of saikosaponin a and d

3 討論與結(jié)論

3.1 柴胡皂苷含量與生長(zhǎng)地域相關(guān)

本研究的11個(gè)樣品分別來(lái)自于陜西省(1個(gè))、甘肅省(1個(gè))、河北省(4個(gè))、內(nèi)蒙古(1個(gè))、山西省(1個(gè))、北京(2個(gè))和東北地區(qū)(1個(gè))。通過(guò)數(shù)據(jù)分析可以發(fā)現(xiàn)，11個(gè)產(chǎn)地柴胡的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量存在差異。其中甘肅省、陜西省柴胡的柴胡皂苷含量較高，與王硯等的研究得出的西北地區(qū)柴胡品質(zhì)較高相一致[22]。有文獻(xiàn)報(bào)道指出藥材生長(zhǎng)環(huán)境不同，溫度、濕度和光照會(huì)對(duì)藥用植物成分積累產(chǎn)生較大影響[23],環(huán)境的差異是造成不同產(chǎn)地柴胡含量的不同的主要原因[6,22]。

3.2 柴胡皂苷含量與生長(zhǎng)方式相關(guān)

本研究采集的樣品有人工種植樣品和野生樣品。其中S1、S2、S4、S8、S9為人工種植樣品，S3、S5、S10、S11為野生樣品，S6、S7未知。人工種植樣品的柴胡皂苷含量均達(dá)標(biāo)，而野生樣品中豐寧地區(qū)的柴胡皂苷含量未達(dá)標(biāo)。通過(guò)對(duì)柴胡皂苷含量的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，人工種植柴胡的柴胡皂苷含量明顯高于野生柴胡的皂苷含量，這與楊洋的研究結(jié)論一致，即人工種植的柴胡從色澤、形狀、品質(zhì)到適應(yīng)性均優(yōu)于野生柴胡種[24]，但野生柴胡資源仍作為主要資源應(yīng)用于市場(chǎng)。

3.3 柴胡皂苷含量與生長(zhǎng)年限相關(guān)

本研究中人工種植柴胡有兩年生和三年生。其中S2、S4、S8為兩年生，S1、S9為三年生，S6、S7未知。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，各樣品間柴胡皂苷含量差異顯著，甘肅兩年生的柴胡皂苷含量最高，河北承德人工種植兩年的柴胡品質(zhì)優(yōu)于三年的，野生樣品生長(zhǎng)年限不詳。建議甘肅和河北承德地區(qū)種植的柴胡兩年采收，既可以提高土地利用率，也可以降低柴胡根腐病的發(fā)生，提高柴胡的品質(zhì)。

通過(guò)對(duì)色譜圖的相似度分析發(fā)現(xiàn)樣品間化學(xué)成分相似度極高，說(shuō)明樣品全部為中藥材柴胡，但對(duì)重疊峰進(jìn)行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，柴胡樣品的非共有峰所占比例較大，表明各樣品間差異明顯。這不僅反映出柴胡中藥用成分的質(zhì)量含量在不同產(chǎn)區(qū)有一定的差異，也反映了柴胡在中藥材市場(chǎng)中存在質(zhì)量不一的情況。有利于市場(chǎng)北柴胡的質(zhì)量監(jiān)督[13]。

柴胡皂苷a含量最高的是來(lái)源于甘肅的柴胡，含量為2.654%，最低的是海拉爾野生柴胡，含量為0.101%；柴胡皂苷d含量最高的是甘肅柴胡，含量為3.287%，最低的是豐寧野生柴胡，僅0.115%。野生柴胡的含量沒(méi)有人工種植的含量高，建議規(guī)范柴胡人工種植技術(shù)，其中西北地區(qū)柴胡品質(zhì)優(yōu)良，建議在西北地區(qū)建立種植基地。