虎地腸溶膠囊對大鼠實驗性結腸炎的療效及機制的研究*

孔夢玉，劉曉芳，武金寶

(1.包頭醫(yī)學院2018級碩士研究生，內蒙古 包頭 014060；2. 包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院病理科；3.包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內蒙古消化病研究所)

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種慢性特發(fā)性炎癥性疾病。在病理學上UC是一種局限于結腸黏膜和結腸黏膜下層的慢性炎癥性腸病，累及部分或全部結腸，主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便，其為慢性病程，病情輕重不等，有終生復發(fā)傾向。據報道，全球UC患病率為(2.42～298.5)/10萬，其中北美和北歐的發(fā)病率最高，且UC在全球范圍內發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[1-3]。UC的發(fā)病機制尚未明確，目前認為由多種因素相互作用所致，包括腸上皮屏障破壞、腸道反應相關通路中的遺傳缺陷、包括益生菌群失調在內的環(huán)境影響及免疫因素等[4-5]。目前，對潰瘍性結腸炎的診斷、病程監(jiān)測以及UC患者對干預措施的反應和粘膜愈合(MH)的檢測依賴于臨床評估、糞便或血清學生物標志物及結腸鏡檢查，其中結腸鏡檢查是“金標準”。

由于UC有反復發(fā)作，病程遷延的特點，故需要長期維持治療。目前維持治療用藥選擇依然有限，主要為氨基水楊酸制劑。雖然糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物對于UC也有較好的療效，但由于有較多且嚴重的副作用，使它們不能用于UC的長期維持治療?；⒌啬c溶膠囊具有清熱、利濕、涼血的功效，其作為新型中藥用于UC的臨床治療已經十余年，對于緩解UC患者腹痛、黏液膿血便的癥狀效果顯著，尤其針對輕、中度UC具有較好的療效，但對于其相關的研究報道較少，其作用機制尚不清楚。DSS飲水法被廣泛應用于急、慢性結腸炎發(fā)病機制、藥物藥效的研究[6]。

因此本實驗采用DSS飲水法建立UC大鼠模型，通過用虎地腸溶膠囊內容物干預造模大鼠，與對照組大鼠進行比較，選取大鼠一般情況、大便隱血評分、疾病活動指數評分(DAI)、組織病理學表現(xiàn)、反應腸上皮屏障功能相關因子(ZO-2、Occludin)、腸黏膜保護性因子(AQP4、HSP70)作為療效評價指標，對比分析各組指標的差異，探究虎地腸溶膠囊對于大鼠實驗性結腸炎的療效及其可能作用機制，為UC的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1對象

1.1.1實驗動物 SD大鼠30只，SPF級，雄性，體質量(160±10)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。 許可證號:SCXK (京) 2014-0004。北京市實驗動物質量合格證號：No.114013000075657。質量檢測單位為中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所。

1.1.2藥品和試劑 虎地腸溶膠囊(安徽九方制藥有限公司，國藥準字Z20020035，規(guī)格0.4 g/粒)，純凈水稀釋，配置混懸液，按2.5 mg/g體重灌胃；4 %葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液(美國MP Biomedicals公司，批號216008120，分子量36 000～50 000)；兔抗大鼠多克隆TJP2(ZO2)抗體(貨號GTX12276，批號821904953)、兔抗大鼠多克隆Hsp70抗體(貨號GTX104126，批號43138)、兔抗鼠多克隆Occludin抗體(貨號GTX114949，批號43670)、兔抗大鼠多克隆Aquaporin 4抗體(貨號GTX133151，批號42640)。以上抗體均購置于美國Gene Tex公司。通用二步法試劑盒(鼠/兔增強聚合物法檢測系統(tǒng))購置于北京中杉金橋生物技術有限公司。抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒、EDTA抗原修復液、PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)均購置于福州邁新生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組 將30只SPF級SD大鼠隨機分為3組，分別為對照組、UC模型組、虎地腸溶膠囊治療組，每組各10只。

1.2.2造模方法 采用DSS飲水法誘導大鼠潰瘍性結腸炎模型。隨機選取10只大鼠為對照組，給予自由飲水喂養(yǎng)7 d。余20只大鼠造模，給予自由飲用4 % DSS水溶液喂養(yǎng)7 d。造模第5 d，造模大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、食量減少、出現(xiàn)稀溏血便等癥狀，表明造模成功。

1.2.3給藥方法 造模成功后，治療組大鼠給予虎地膠囊內容物混懸液按2.5 mg/g的劑量灌胃，對照組及模型組大鼠給予同等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥25 d。

1.2.4樣本采集 末次給藥后禁食24 h，脫頸處死大鼠，進行末次稱重，取肛門至結腸末端，福爾馬林液保存。

1.2.5觀測指標 (1)一般情況：從造模第一天起每日觀察記錄各組大鼠進食飲水情況、精神狀況、體重、糞便性狀及糞便隱血情況，計算疾病活動指數(DAI=體重下降評分+大便性狀評分+隱血評分)，參考熊駿[7]等評分標準。(2)結腸組織病理學改變：實驗終點，取各組大鼠結腸病變部位組織或距肛門口1.5 cm處組織進行4 % 多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察，記錄。(3)免疫組化檢測:取各組大鼠結腸病變部位組織或距肛門口1.5 cm處組織進行4 %多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、烤片，免疫組化染色過程嚴格按照1.2中所述試劑盒說明書操作，AQP4、HSP70、Occlundin、ZO2抗體濃度均為1∶300，封片完成，顯微鏡下觀察，并進行免疫組化評分，參考陳衛(wèi)[8]等評分標準。

2 結果

2.1一般狀況 實驗期間對照組大鼠精神佳，毛色光亮，食量正常，大便為硬質橢球形，實驗期間未出現(xiàn)稀溏血便。除對照組外，其余兩組大鼠均在飲用4 % DSS水溶液后出現(xiàn)毛色晦暗、不喜動、食量減少、大便不成形等表現(xiàn)，幾乎所有造模大鼠均在飲用4 % DSS水溶液第4 d時出現(xiàn)稀溏血便，部分大鼠肛門口可見血便附著，表示造模成功。治療組大鼠在虎地治療后精神、食量、大便情況逐漸好轉，實驗終點時為硬質橢球形便，隱血陰性。UC模型組大鼠毛色晦暗，精神差，進食量少，稀溏血便持續(xù)時間較長，實驗終點時大便為松軟成形便，隱血陰性。如圖1所示，治療組大鼠大便隱血評分在實驗第11 d(即虎地灌胃治療第4 d)時開始下降，實驗第27 d評分降至0分，UC模型組大鼠實驗第17 d時大便隱血評分開始下降，至實驗終點評分為1分。

圖1 每日記錄各組大便隱血評分變化

2.2疾病活動指數 造模結束后，模型組和治療組大鼠DAI均為4分，治療組DAI于灌胃第5 d時下降，且與模型組相比出現(xiàn)顯著差異(P<0.001，n=9),模型組DAI于灌胃第11 d下降，此后模型組與治療組相比無顯著差異(P=0.606，n=9)。結果如圖2、表1所示。

圖2 灌胃第1-11 d大鼠DAI變化(*P<0.001，#P=0.606)(n=9)

表1 灌胃期治療組、模型組之間DAI的差異性分析M(Q1，Q3)

2.3組織病理學變化 光鏡下觀察三組大鼠結腸組織病理切片，部分病理切片見圖3。結果如下：對照組大鼠結腸黏膜完整，腸腺整齊，黏膜無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠結腸黏膜失去完整性，腸腺排列混亂，伴有黏膜糜爛，可見杯狀細胞消失、隱窩結構消失，部分出現(xiàn)隱窩膿腫，腸黏膜大量炎癥細胞浸潤，部分結腸可見炎癥浸潤至黏膜肌層；治療組大鼠結腸黏膜破壞程度較模型組輕，炎癥細胞較模型組少，炎癥局限于黏膜層。

圖3 各組大鼠結腸組織HE染色×100注：A對照組：黏膜連續(xù)，隱窩結構完整；B治療組：黏膜、隱窩結構較完整，少量炎癥細胞局限于黏膜層；C、D模型組：黏膜糜爛、隱窩結構消失

2.4各組大鼠結腸AQP4、ZO-2、Occludin、HSP70表達情況 模型組大鼠結腸組織中AQP4、ZO-2、Occludin、HSP 70表達水平顯著降低，與對照組相比有顯著差異(P<0.05，n=10)。與模型組相比，虎地治療組大鼠結腸組織中AQP4、ZO-2、Occludin、HSP 70表達水平上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，n=10)。見表2。

表2 各組大鼠結腸組織Occludin、ZO-2、AQP4、HSP 70表達情況

3 討論

潰瘍性結腸炎(UC)作為一種反復發(fā)作，病程遷延的消化道疾病，對患者的健康、生活均造成了嚴重的影響，在過去的幾十年里，越來越多的實驗研究致力于解開UC發(fā)病的謎團，關于UC發(fā)生發(fā)展的病理生理學途徑方面已經取得了很大的進展，目前認為腸上皮屏障破壞、免疫相關的細胞因子失衡在UC的發(fā)生發(fā)展中至關重要。

腸黏膜形成的一種選擇性屏障，保護宿主免受腔內內容物和微生物的侵襲，同時允許營養(yǎng)物質、離子和水的自由流動，我們稱之為“腸上皮屏障”。 腸上皮屏障功能在維持腸道健康中起著舉足輕重的作用。當上皮屏障的完整性受到破壞，會導致腸黏膜通透性增高，微生物、毒素、病原體和過敏原進入黏膜組織和血液循環(huán)導致炎癥的發(fā)生。腸上皮屏障主要由上皮細胞緊密連接(TJ)蛋白組成，如ZO-2、occludin和claudins等。這些TJ蛋白在形成和維持細胞旁屏障方面起著重要作用，緊密連接結構的破壞與UC炎癥的啟動和加速有關[9-10]。Kuo等[11]的實驗顯示在UC患者結腸組織中，occludin表達減少，導致caspase-3下調，從而限制上皮細胞凋亡，破壞黏膜動態(tài)平衡，并引起結腸炎。Chang等[12]研究表明與對照組相比，DSS處理組小鼠結腸組織occludin、ZO-2的表達均顯著減少。

水通道蛋白4(AQP 4)、熱休克蛋白70(HSP 70)作為兩種重要的保護性因子廣泛存在于全身各個組織臟器。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一種跨膜通道蛋白，負責水和/或小分子溶質跨細胞膜的高效、選擇性轉運，同時在調節(jié)細胞的體積和細胞內滲透壓中起著關鍵的作用[13]。Hardin JA等[5]實驗結果顯示在DSS誘導小鼠結腸炎模型中，AQP 4的表達在DSS直接刺激12-24 h后顯著降低，并在整個治療期間保持抑制狀態(tài)。熱休克蛋白的功能主要是在各種生理應激條件下(如感染、缺血等)給予細胞保護，有著強大的抗炎作用，是機體關鍵抗炎分子之一[8-9]。腸道內的熱休克蛋白以HSP 70為主。Barbatis C等[15]研究發(fā)現(xiàn)活動期UC炎癥上皮HSP 70c表達下調。Ramakrishna等[14]免疫組化結果顯示，DSS誘導結腸炎大鼠腸上皮細胞HSP 70的染色強度較低。

本實驗研究結果顯示模型組大鼠結腸組織中ZO-2、Occludin、AQP 4、HSP 70表達均較對照組顯著降低，提示DSS可以導致大鼠上皮緊密連接結構受損、腸上皮屏障功能缺陷、抗炎因子缺失導致結腸炎癥的發(fā)生。與此同時本實驗中，虎地治療組大鼠一般情況、大便隱血情況、疾病活動情況較模型組均有好轉，組織病理學結果顯示，治療組黏膜損傷及炎癥反應程度較輕。經虎地治療后，大鼠結腸組織中ZO-2、Occludin、AQP 4、HSP 70含量均有顯著增加。

綜上表明，虎地腸溶膠囊對改善實驗性結腸炎大鼠一般情況、大便隱血情況、疾病活動情況、組織病理學表現(xiàn)等方面具有一定作用。因此，我們推測虎地腸溶膠囊治療UC的機制可能與增加AQP 4、HSP 70等腸黏膜保護性因子的表達對抗腸道炎癥反應、增加腸上皮緊密連接蛋白修復受損的腸上皮屏障有關。