2020年上海市青浦區(qū)肉制品中單增李斯特菌分子分型及耐藥性分析

盧曉蕓 施怡茹 張相猛

摘 要：為了解2020年上海市青浦區(qū)肉制品中單增李斯特菌的污染狀況、分子分型及耐藥情況，按照《國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》檢測肉制品中的單增李斯特菌，使用微量肉湯稀釋法（MIC法）進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗，應(yīng)用PFGE分子分型并采用 BioNumerics軟件分析聚類。結(jié)果顯示，111份肉制品中單增李斯特菌的檢出率為12.61%，生、熟肉制品的檢出率存在統(tǒng)計學(xué)差異（χc2=29.09，P<0.05）。藥敏試驗表明，一株菌多重耐藥——所有株菌對頭孢西丁均耐藥（100%），其次為苯唑西林（21.43%）。PFGE結(jié)果表明，LM聚類分析呈整體多態(tài)性且無聚集。結(jié)論為，2020年上海市青浦區(qū)肉制品中，雞肉類生肉制品的單增李斯特菌污染情況嚴(yán)重，對頭孢西丁完全耐藥，極個別菌株存在多重耐藥率。此外，分型帶型存在多態(tài)性，為散發(fā)污染。因此，應(yīng)加強(qiáng)對肉制品的安全監(jiān)測，關(guān)注耐藥菌株發(fā)展趨勢，預(yù)防爆發(fā)性食品安全事件。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌? 食品? 脈沖場凝膠電泳? 耐藥性

單增李斯特菌（Lesteria monocytogenes，以下簡稱“LM”）是革蘭氏染色陽性短桿菌，也是李斯特菌屬最具危害性的一種人畜共患食源性致病菌[1]，其能夠引起人類嚴(yán)重感染一系列疾病，如腦膜炎、敗血癥、肺炎、熱性腸胃炎、流產(chǎn)等[2]。LM廣泛分布于自然界中，可在低溫、高滲透壓[3]、冷凍[4]等惡劣環(huán)境中生存，是低溫冷藏食品的重要污染致病菌。本研究對2020年上海市青浦區(qū)肉制品中LM的感染現(xiàn)況、分子分型及耐藥性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2020年1～12月，從上海市青浦區(qū)各零售渠道抽取111份肉制品，其中熟肉制品84份，生肉制品27份。

1.1.2 試劑與儀器

李氏增菌肉湯（LB）及相應(yīng)添加劑、木糖發(fā)酵管、鼠李糖發(fā)酵管、TSA培養(yǎng)基，均購自青島海博;李斯特顯色平板、PALCAM平板、血瓊脂平板，均購自科瑪嘉;GP生化鑒定卡，購自法國梅里埃;以上均在有效期內(nèi)。

VITEK 2 COMPACT，法國梅里埃;電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、PFGE及配套設(shè)備，均購自美國Bio-Rad。蛋白酶K（TAKARA）、限制性內(nèi)切酶Asc I（TAKARA）、Seakem Gold瓊脂糖（瑞士lonza）、96孔藥敏板（珠海美華），均在有效期內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)菌株：單核細(xì)胞李斯特氏菌CICC 21633，由CICC提供;脈沖場凝膠電泳所用Marker標(biāo)準(zhǔn)菌株沙門氏菌H9812，由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法和藥敏試驗

按照《2020年國家食品污染和有害因素風(fēng)險監(jiān)測工作手冊》規(guī)定來定性、定量檢測LM，檢出木糖-鼠李糖（陰性-陽性）發(fā)酵結(jié)果的可疑菌落，用VITEK 2 COMPACT儀器和GP生化鑒定卡鑒定LM菌株。檢出的LM參照《2020年食源性疾病監(jiān)測工作手冊》和CLSI M45-A3，用MIC法進(jìn)行耐藥分析。

1.2.2 PFGE分型

參照美國疾病預(yù)防控制中心PFGE標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對分離出的LM進(jìn)行PFGE分子分型。以沙門氏菌（H9812）作為Marker，使用限制性內(nèi)切酶Asc I（50U），37℃酶切2h。電泳參數(shù)：最小分子量49kb，最大分子量450kb，初始切換時間4.0s，最終切換時間40.0s;電壓：6V;夾角：120°;運行時間：19h。電泳結(jié)束后，使用GelRed染料染色30min，于超純水中脫色30min，然后使用Gel DocXR+凝膠成像系統(tǒng)讀取并保存圖譜，使用BioNumerics 7.6軟件進(jìn)行聚類分析，相似系數(shù)設(shè)置為Dice系數(shù)，優(yōu)化1.5%，容忍度1.5%，聚類方法選擇UPGMA。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。檢出率的比較用χ2，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體檢出情況

111份樣品中，LM檢出率為12.61%，兩份樣本中定量水平為60CFU/g。熟肉制品檢出率為2.38%（2/84），生肉制品檢出率為44.44%，兩者檢出率有統(tǒng)計學(xué)差異（χc2=29.09，P<0.05）。熟肉制品中畜類并未檢出LM，菌株均來源于熟鴨肉。生肉制品中禽、畜類檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=1.05，P>0.05）。生肉制品每月檢出率相同，均為44.4%（4/9），主要以生雞肉污染為主（54%，7/13），生豬肉次之（38%，3/8），生牛肉最少（33%，2/6）。

2.2 PFGE分型

14株LM使用Asc I酶切產(chǎn)生7～12條帶，條帶片段長度在25～1000kb范圍內(nèi)，共獲得14種帶型。聚類分析結(jié)果表明無本地優(yōu)勢帶型，其中，QPLM20011/QPLM20013雖然為同一地點采集，但條帶相似度低于60%，菌株聚類圖詳見圖1。

2.3 耐藥率比較

14株LM藥敏結(jié)果顯示，對頭孢西丁均耐藥（100.00%，14/14），3株LM對苯唑西林耐藥（21.4%，3/14），僅有1株LM（QPLM20009，牛肉來源）存在多重耐藥（頭孢西丁、苯唑西林、四環(huán)素和克林霉素），見表2。

3 討論

約99%的LM被認(rèn)為是食源性致病菌[5]，故完善LM在食品方面的各項研究具有重要意義。脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術(shù)作為菌株溯源和食源性疾病爆發(fā)調(diào)查的金標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛應(yīng)用于LM分子分型。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)LM的耐藥情況不同，即耐藥性隨時間推進(jìn)會向著復(fù)雜化發(fā)展[6]。因此，從多角度持續(xù)追蹤LM的污染現(xiàn)況對未來的疾病預(yù)防和控制工作具有預(yù)警和指示作用。

①2020年上海市青浦區(qū)肉制品中LM檢出率為12.61%，高于多地肉制品檢出率[7-10]。該地區(qū)熟肉制品和生肉制品中均存在LM污染的情況，生肉制品中生雞肉LM污染情況尤為嚴(yán)重，熟肉制品中LM污染均源自于熟鴨肉。因此，需加強(qiáng)對該地區(qū)肉制品中LM污染的監(jiān)測，擴(kuò)大覆蓋范圍和渠道。2019年起，全國多省市中少數(shù)具有檢測能力的醫(yī)院陸續(xù)開展LM專項檢測，但目前仍缺乏全國范圍的病例監(jiān)測數(shù)據(jù)。我國缺乏LM的爆發(fā)報道[5]，原因可能為我國烹飪習(xí)慣、臨床等未將LM納入常規(guī)監(jiān)測、LM定量結(jié)果低等。LM可在低溫下生存，工具、操作者及環(huán)境均可造成污染[11]，且較低含量仍可對消費者產(chǎn)生食品安全隱患，故建議將LM檢測納入基層臨床、公共衛(wèi)生常規(guī)監(jiān)測中，加強(qiáng)監(jiān)管，及時預(yù)警爆發(fā)風(fēng)險。

②PFGE使用Asc I酶切，條帶分布均勻，容易識別且沒有出現(xiàn)降解的情況[10]。PFGE圖譜分析結(jié)果為菌株分型帶型存在多態(tài)性、無聚集，提示青浦地區(qū)LM污染為散發(fā)污染。統(tǒng)一采樣來源的菌株聚類分析條帶相似度低，提示其來自于不同的污染來源，總體存在多種潛在風(fēng)險，食源性LM分型數(shù)據(jù)庫可對爆發(fā)事件提供線索。

③從耐藥結(jié)果分析，LM涉及所有耐藥物（頭孢西丁、苯唑西林、克林霉素、四環(huán)素）且與臨床首選用藥（青霉素或氨芐西林）無重合[6]，故不影響臨床治療用藥。大多數(shù)菌株對所測抗生素敏感，僅一株來源牛肉的LM存在多種耐藥情況，需持續(xù)關(guān)注和了解本地區(qū)LM的耐藥發(fā)展趨勢，結(jié)合畜類養(yǎng)殖抗生素使用情況提供臨床治療用藥建議。

隨著人民生活水平的提高，肉制品已經(jīng)頻繁出現(xiàn)在人們的餐桌上。熟肉制品需重視流通環(huán)節(jié)防污染、熟食吃前再加工等，并關(guān)注鴨肉類肉制品的安全風(fēng)險。生肉制品雖已在食用前煮熟，但污染飲食環(huán)境的風(fēng)險依然存在，因此，應(yīng)關(guān)注生肉制品（尤其是雞肉類）流通鏈上的安全風(fēng)險和控制措施。同時，健全食品安全知識普及工作，提高大眾對食品安全防范意識，有效降低食物中毒風(fēng)險。

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作者簡介：盧曉蕓，女，初級檢驗技師，主要從事食品安全衛(wèi)生與食源性疾病防治。