兩種純化乳鐵蛋白的肝素親和柱性能對(duì)比研究

張君超 武冬霞 田秀梅

摘 要：本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)兩種商品化肝素親和柱的柱容量、實(shí)際樣本純化效果、重復(fù)性及操作便捷性進(jìn)行了系統(tǒng)性對(duì)比，旨在研究?jī)煞N商品化肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白的性能，同時(shí)為相關(guān)用戶提供選擇商品化肝素親和柱的建議。研究結(jié)果顯示，兩種肝素親和柱對(duì)1mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為90.8%～95.6%，柱容量均能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)需求;對(duì)牛乳及乳粉樣本中乳鐵蛋白的加標(biāo)回收率為81%～95%，且重復(fù)使用3次仍能保持對(duì)牛乳及乳粉樣本80%以上的加標(biāo)回收率，即兩種肝素親和柱對(duì)乳及乳制品中乳鐵蛋白均有良好的純化效果且3次內(nèi)可重復(fù)使用。在操作便捷性方面，兩種肝素親和柱在保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，A柱操作簡(jiǎn)便、前處理時(shí)間短且可同時(shí)使用多個(gè)A柱檢測(cè)多個(gè)樣品，B柱則需要手動(dòng)加壓或使用蠕動(dòng)泵進(jìn)行操作，前處理時(shí)間較長(zhǎng)且無法低成本地同時(shí)處理多個(gè)樣本。綜上所述，兩種商品化的肝素親和柱均可滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化需求，在操作便捷性方面A柱優(yōu)于B柱，相關(guān)用戶可綜合市場(chǎng)、價(jià)格等因素選擇合適的產(chǎn)品。

關(guān)鍵詞：肝素親和柱? 乳及乳制品? 乳鐵蛋白

1 引言

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是哺乳動(dòng)物乳汁中富含的一種天然非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，且具有強(qiáng)大的生物功能，如抗菌、抗氧化、抗癌、促進(jìn)腸道發(fā)育和鐵吸收，以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等[1-3]。因乳鐵蛋白具有優(yōu)質(zhì)的生物功能，免疫力低下的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)的人群，以及缺鐵性貧血人群均對(duì)于乳鐵蛋白的補(bǔ)充有所需求[4]。由于乳鐵蛋白熱穩(wěn)定性差，故加熱過程中會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)變性。一方面，乳鐵蛋白作為生鮮乳中的天然成分，如何更多的保留其天然營(yíng)養(yǎng)活性已成為巴氏殺菌乳研究領(lǐng)域關(guān)注的技術(shù)重點(diǎn)，“國(guó)家優(yōu)質(zhì)乳工程”明確提出優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳生物活性物質(zhì)的指標(biāo)要求——乳鐵蛋白≥25mg/L[5];另一方面，乳鐵蛋白常被作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加入經(jīng)高溫工藝生產(chǎn)的乳制品中，如嬰幼兒配方食品和特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品等，且《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880-2012）中也對(duì)乳鐵蛋白的添加量也做了明確規(guī)定，即在乳品中的添加量不超過1.0g/kg[6]。

據(jù)報(bào)道，乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)方法有免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析快速檢測(cè)法等免疫學(xué)分析法，高效液相色譜法、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法/超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、凝膠電泳檢測(cè)方法等色譜分析法，以及分光光度法、離子共振法、生物傳感測(cè)定法、核酸適配體法等[7-8]，但以上眾多檢驗(yàn)方法均不是國(guó)家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。在眾多乳鐵蛋白檢測(cè)方法中，高效液相色譜法因具有反應(yīng)靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被作為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)公布實(shí)施[9]，同時(shí)也被作為食品中乳鐵蛋白測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿中第一法。但該方法對(duì)樣品純度要求較高，且乳粉的基質(zhì)成分相對(duì)復(fù)雜，故試樣無法直接進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，而需對(duì)其進(jìn)行前處理。目前，常用的前處理方法為肝素親和柱純化乳及乳制品中的乳鐵蛋白。

肝素（Heparin）是一種含硫酸酯的酸性多糖，可通過糖苷鍵與一些結(jié)構(gòu)糖蛋白結(jié)合，同時(shí)肝素表面的負(fù)電荷會(huì)與帶正電的蛋白質(zhì)發(fā)生離子作用。因此，肝素能和抗凝血因子III、凝血酶、類凝血酶、重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等生物大分子結(jié)合。乳鐵蛋白也是一種結(jié)構(gòu)糖蛋白，在合適的緩沖液條件下，乳鐵蛋白與肝素可通過糖苷鍵和離子發(fā)生親和作用，故肝素可用于純化乳及乳制品中的乳鐵蛋白。為方便檢測(cè)，需把肝素制作為填料形式：以高流速瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì)，采用環(huán)氧活化工藝將肝素偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上。目前，市場(chǎng)上已有商品化的肝素親和柱，但由于各廠家肝素親和柱的生產(chǎn)工藝不盡相同，造成肝素親和柱對(duì)乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化效果也有所差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種常見商品化肝素親和柱的柱容量、實(shí)際樣本純化效果、重復(fù)性及操作便捷性等幾個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)性對(duì)比研究，旨在研究?jī)煞N商品化肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白性能，同時(shí)為相關(guān)用戶提供選擇商品化肝素親和柱的建議。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

2.1.1 儀器

高效液相色譜儀（1260），Agilent;天平（PL602E），梅特勒-托利多;親和柱支架（HMG-QS），北京華安麥科科技有限公司;渦旋混合儀（HMG-WX），北京美正生物科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)（TG16-W），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;pH計(jì)（PHS-3C），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

2.1.2 試劑

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度>95%），北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉均為優(yōu)級(jí)純，乙腈、三氟乙酸均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;0.45μm水系濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;肝素親和柱A（3mL），北京美正生物科技有限公司;肝素親和柱B（1mL），美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 乳及乳制品中乳鐵蛋白檢測(cè)前處理方法

方法一：參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中乳鐵蛋白的測(cè)定》征求意見稿中的第一法。

方法二：參照肝素親和柱（北京美正生物科技有限公司）產(chǎn)品說明書。

2.2.2 乳及乳制品中乳鐵蛋白含量測(cè)定

使用高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)肝素親和柱純化后的試樣中乳鐵蛋白的含量。固定相：C4色譜柱、（250mm×4.6mm×5μm，300?），沃特世科技（上海）有限公司;流動(dòng)相：A液為0.1%三氟乙酸，B液為乙腈。檢測(cè)前以最開始洗脫時(shí)的AB流動(dòng)相配比為準(zhǔn)，待基線平穩(wěn)后開始進(jìn)樣;進(jìn)樣體積30μL，梯度洗脫程序如表1所示，柱溫30℃，檢測(cè)紫外波長(zhǎng)280nm;檢測(cè)完成后對(duì)色譜柱進(jìn)行維護(hù)：進(jìn)空針，運(yùn)行梯度洗脫程序，確認(rèn)色譜柱無乳鐵蛋白洗出后再用甲醇水清洗色譜柱。

試樣中乳鐵蛋白含量計(jì)算公式：

式中：X為試樣中乳鐵蛋白含量，mg/g;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的乳鐵蛋白檢測(cè)濃度，μg/mL;V1為洗脫體積，mL;V2為定容體積，mL;V3為上樣液體積，mL;m為試樣稱樣量，g。

2.2.3 肝素親和柱柱容量對(duì)比

肝素親和柱作為乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化工具，柱容量需要滿足常見乳及乳制品的檢測(cè)需求。據(jù)報(bào)道，鮮牛乳中乳鐵蛋白含量約為0.02～0.2g/L，且該成分會(huì)隨著加工過程中加熱時(shí)間、pH值、鐵飽和度及壓力等因素的變化而降低活性和功能[10-12];《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880-2012）中也規(guī)定了嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白使用不超過1.0g/kg。根據(jù)常見乳及乳制品中含量，分別測(cè)試兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下對(duì)1mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合能力，分別平行測(cè)定6次，以回收率的平均值和6次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來評(píng)價(jià)柱容量是否能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)需求。

2.2.4 肝素親和柱純化乳及乳制品效果對(duì)比

肝素親和柱應(yīng)用于乳及乳制品中乳鐵蛋白的純化，但由于乳及乳制品基質(zhì)復(fù)雜，需要分別通過測(cè)試兩種肝素親和柱分別在兩種前處理方法下對(duì)液體乳及乳粉的加標(biāo)回收率來判定其是否能滿足實(shí)際樣本檢測(cè)需求。以市售某品牌UHT乳為液體乳陰性樣本加標(biāo)20mg/100g，兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下分別平行測(cè)定3次，以平均值計(jì)算加標(biāo)回收率;以市售某品牌嬰兒配方奶粉為乳粉陽性樣本（乳鐵蛋白標(biāo)示值為50mg/100g）加標(biāo)60mg/100g，兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下分別平行測(cè)定3次，以平均值計(jì)算實(shí)際檢出占標(biāo)示值的百分比和加標(biāo)回收率。

2.2.5 肝素親和柱重復(fù)性對(duì)比

肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白是利用肝素與乳鐵蛋白的糖苷鍵和離子作用，理論上肝素填料經(jīng)再生后仍可純化乳鐵蛋白，且肝素親和柱是高效液相色譜法檢測(cè)乳及乳制品中乳鐵蛋白的重要耗材，故重復(fù)使用可降低檢測(cè)成本。本實(shí)驗(yàn)用UHT乳和陰性奶粉樣本做空白本底，在其中分別加標(biāo)20mg/100g、60mg/100g，使用方法二測(cè)定兩種肝素親和柱的加標(biāo)回收率及使用次數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平行測(cè)定3次的平均值計(jì)算，每次使用肝素親和柱用結(jié)合緩沖液對(duì)兩種肝素親和柱進(jìn)行再生后再進(jìn)行下一次檢測(cè)。

2.2.6 肝素親和柱操作便捷性對(duì)比

肝素親和柱純化乳及乳制品中乳鐵蛋白的操作過程對(duì)于整個(gè)檢測(cè)過程而言十分重要——在保障檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，便捷的操作過程可有效提高檢測(cè)效率。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)際操作過程對(duì)比兩種肝素親和柱的操作便捷性。

3 結(jié)果與分析

3.1 肝素親和柱柱容量對(duì)比

兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下對(duì)1mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種肝素親和柱對(duì)1mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為90.8%～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%～1.08%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，兩種肝素親和柱的柱容量均能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)需求。

3.2 肝素親和柱純化乳及乳制品效果對(duì)比

兩種肝素親和柱在兩種前處理方法下測(cè)定UHT乳加標(biāo)回收率，嬰幼兒配方奶粉實(shí)際檢出占標(biāo)示值的百分比和加標(biāo)回收率結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種肝素親和柱檢測(cè)UHT乳加標(biāo)回收率在86%～95%范圍內(nèi)，嬰幼兒配方奶粉加標(biāo)回收率在81%～92%范圍內(nèi)。但在嬰幼兒配方奶粉檢測(cè)中，兩種肝素親和柱使用方法一的實(shí)際檢出僅占標(biāo)示值的48%～51%，使用方法二的實(shí)際檢出占標(biāo)示值達(dá)到110%～113%。結(jié)果顯示，由于兩種前處理方法不同造成實(shí)際樣本的檢測(cè)結(jié)果有所差異，與肝素親和柱本身并無相關(guān)性。因此，不同前處理方法對(duì)樣本的適用性有待進(jìn)一步確證。

3.3 肝素親和柱重復(fù)性對(duì)比

使用前處理方法二測(cè)定兩種肝素親和柱對(duì)UHT乳和空白奶粉樣本的加標(biāo)回收率和使用次數(shù)，結(jié)果如圖1和圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種肝素親和柱對(duì)牛乳和乳粉中乳鐵蛋白的加標(biāo)回收率并未隨使用次數(shù)的增加而明顯降低，回收率均在80%以上。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，重復(fù)使用肝素親和柱時(shí)必須對(duì)其充分再生，否則將影響其下次的回收效率。因此，在實(shí)際檢測(cè)過程中為保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議重復(fù)使用次數(shù)不超過2次。

3.4 肝素親和柱操作便捷性對(duì)比

兩種肝素親和柱中，A為重力柱形式且填料粒徑較大，B為預(yù)裝柱形式且填料粒徑小。實(shí)際操作過程中，A無需借助外力對(duì)上樣液進(jìn)行過柱且可以同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行前處理;B則需要手動(dòng)加壓或使用蠕動(dòng)泵對(duì)上樣液進(jìn)行過柱，如要同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行前處理則需增加多個(gè)蠕動(dòng)泵成本。由于A的填料粒徑大造成過柱液體流速相對(duì)B較快，前處理過程中每個(gè)樣本可以縮短10～20min前處理時(shí)間。

4 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究結(jié)果顯示，兩種肝素親和柱的柱容量均能滿足常見乳及乳制品中乳鐵蛋白的檢測(cè)需求;對(duì)牛乳及乳粉樣本的加標(biāo)回收率在81%～95%范圍內(nèi)，且重復(fù)使用3次仍能保持對(duì)牛乳及乳粉樣本80%以上的加標(biāo)回收率。兩種肝素親和柱在保障檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，可同時(shí)使用多個(gè)A柱檢測(cè)多個(gè)樣品且溶液過柱流速較快，即有效縮短前處理時(shí)間;B柱則需要手動(dòng)加壓或使用蠕動(dòng)泵無法低成本同時(shí)處理多個(gè)樣本。綜上所述，兩種肝素親和柱均可以應(yīng)用于乳及乳制品中乳鐵蛋白純化，純化效果相當(dāng)，但A柱在操作便捷性上優(yōu)于B柱，使用者可再綜合市場(chǎng)、價(jià)格等因素選擇合適的產(chǎn)品。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩種肝素親和柱使用不同前處理方法檢測(cè)同一種市售嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量差異為62%，即兩種前處理方法不一定適用于所有乳制品，不同前處理方法對(duì)不同乳制品樣本的適用性有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊燕婷.乳鐵蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用專利技術(shù)綜述[J].現(xiàn)代食品，2018（12）：25-29.

[2] Human Milk Biochemistry and Infant Formula Manufacturing Technology[M].Elsevier Ltd：2014-01-01.

[3] 楊巍，馬雪瑩，王曉宇.乳鐵蛋白的生物學(xué)活性[J].黑龍江科學(xué)，2011，2（04）：43-44+60.

[4] 朱丙連.“天然抗生素”之乳鐵蛋白[J].食品與健康，2020，（3）：28-29.

[5] 王加啟.優(yōu)質(zhì)乳工程技術(shù)體系核心指標(biāo)研究[J].中國(guó)乳業(yè)，2019（06）：2-6.

[6] 《 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880-2012）[S].

[7] 龐莉莉，邱煥煥，黃俊逸.乳鐵蛋白檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（06）：161-164.

[8] Peter Riechel，Torsten Weiss，Martina Weiss，Roland Ulber，Heinrich Buchholz，Thomas Scheper. Determination of the minor whey protein bovine lactoferrin in cheese whey concentrates with capillary electrophoresis[J]. Journal of Chromatography A，1998，817（1）.

[9] 《奶及奶制品中乳鐵蛋白的測(cè)定 液相色譜法》（T/TDSTIA 006-2019）[S].

[10] EFSA Panel on Dietetic Products（2012a）.Scientific Opinion on bovine lactoferrin[J].EFSA Journal，2012，10（5）：2701.

[11] C. Mazri，L. Sánchez，S.J. Ramos，M. Calvo，M.D. Pérez. Effect of high-pressure treatment on denaturation of bovine lactoferrin and lactoperoxidase[J]. Journal of Dairy Science，2012，95（2）.

[12] Paulsson Marie A.，Svensson Ulla，Kishore Alugupalli R.，Satyanarayan Naidu A.. Thermal Behavior of Bovine Lactoferrin in Water and Its Relation to Bacterial Interaction and Antibacterial Activity[J]. Paulsson Marie A.;Svensson Ulla;Kishore Alugupalli R.;Satyanarayan Naidu A.，1993，76（12）.

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1604302-04）。