小球藻對羅非魚養(yǎng)殖水體水質(zhì)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

秦 璐，陳 曦，裘麗萍，范立民，宋 超，鄭 堯，孟順龍,，陳家長,

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)部長江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站/中國水產(chǎn)科學(xué)研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081）

0 引言

中國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，2019年淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量為3013萬t，其中羅非魚產(chǎn)量達(dá)164萬t，占整個(gè)淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的5.44%[1]。吉富羅非魚(GIFT)作為被改良過的品種，其遺傳性狀穩(wěn)定，養(yǎng)殖周期短，是中國目前羅非魚養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一[2]。近年來，隨著養(yǎng)殖密度的不斷增加、餌料的過量投喂以及藥物的濫用等，使養(yǎng)殖水域環(huán)境不斷惡化，甚至引發(fā)養(yǎng)殖生物大規(guī)模死亡現(xiàn)象?？梢?，良好的水質(zhì)條件對養(yǎng)殖動(dòng)物的生長和養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定至關(guān)重要[3]。

微生物在水體中扮演重要角色，它參與營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)、殘餌和糞便的分解以及魚體病原體的抑制等[4-6]。水體中微生物群落組成并非固定的，它們?nèi)菀资艿金B(yǎng)殖水環(huán)境和人為因素的影響，并且微生物群落結(jié)構(gòu)變化能影響?zhàn)B殖水體水質(zhì)狀況及養(yǎng)殖生物的健康生長[7]。因此，研究投加小球藻對養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)的影響能從微觀層面揭示微生物的水質(zhì)凈化機(jī)理，提高水體凈化效率[8]。

目前，應(yīng)用于養(yǎng)殖水體調(diào)節(jié)的方法主要包括物理和化學(xué)方法，包括增氧、換水、吸附和氧化還原法等，但處理效果并不理想，運(yùn)行成本較高，在實(shí)際運(yùn)用過程中容易造成環(huán)境污染。生物方法主要包括種植浮生植物、投加微生態(tài)制劑等，它主要是通過生物自身的特性對養(yǎng)殖水體進(jìn)行調(diào)控。利用浮游動(dòng)植物和微生態(tài)制劑來調(diào)控水質(zhì)已經(jīng)在生產(chǎn)中有較多應(yīng)用[9]，并能有效減少對水產(chǎn)藥物的依賴性[10-11]。直接利用小球藻來調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體的研究也有很多[12]，通常是直接潑灑在水體中，還有將小球藻加工成藻粉添加到飼料中，通過間接方式作用于水體和養(yǎng)殖生物[13]。目前，關(guān)于小球藻直接潑灑在羅非魚養(yǎng)殖水體，研究其對水體中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的報(bào)道較少。筆者以吉富羅非魚為研究對象，探究不同添加量的小球藻對養(yǎng)殖水體N、P的調(diào)節(jié)作用，并利用16S rRNA高通量測序技術(shù)，分析不同添加量的小球藻對養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，探索對養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)節(jié)的最佳濃度，以期從微觀層面揭示微生物凈化水質(zhì)機(jī)理，提高水體凈化效率[14]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)購自中國科學(xué)院淡水藻種庫(FACHB)，在實(shí)驗(yàn)室用BG11液體培養(yǎng)基對藻種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。試驗(yàn)用羅非魚為吉富羅非魚(GIFT)，由宜興羅非魚養(yǎng)殖試驗(yàn)基地提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

每10天取樣一次，取樣之前先測定水體T、DO、C、pH和SD，然后用5 L有機(jī)玻璃水質(zhì)采集器在水下30 cm處采水，裝入5 L的塑料瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室測定水體理化指標(biāo)和水體微生物。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水質(zhì)分析方法 水質(zhì)測定指標(biāo)包括氨氮(NH4+-N)、亞硝態(tài)氮(NO2--N)、硝態(tài)氮(NO3--N)、總磷(TP)和葉綠素a(Chl.a)。測定方法參考國家水質(zhì)檢測標(biāo)準(zhǔn)GB 11893—89。

1.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 取水樣3 L，經(jīng)0.22 μm混合纖維素酯濾膜，用抽濾裝置負(fù)壓抽濾，然后用滅菌后的剪刀把濾膜剪碎，放入5 mL的無菌EP管中，放入液氮中速凍，用于細(xì)菌DNA的提取。

根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進(jìn)行水樣中細(xì)菌DNA提取，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，使用Nano Drop 2000儀器測定DNA濃度和純度。對于檢驗(yàn)合格的細(xì)菌DNA，對細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū) 進(jìn) 行 PCR擴(kuò) 增 ，引 物 為 ：338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，擴(kuò) 增 程 序 為 ：95℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。擴(kuò)增體系包括4 μL 5*FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL引物(5 μm)，0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板。

1.3.3 Illμmina Miseq高通量測序 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用Tris-HCl洗脫后用2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST(Promega,USA)進(jìn)行檢測定量，經(jīng)檢測合格后進(jìn)行純化及測序文庫構(gòu)建。依托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina,San Diego,USA)將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE2*300文庫，利用Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 21.0軟件對水體數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 94C對數(shù)據(jù)作圖分析。為保證對微生物群落組成后續(xù)分析質(zhì)量，原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用Flash軟件(version 1.2.11)進(jìn)行拼接。使用Usearch軟件(version 7.0)，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類并剔除單序列和嵌合體[15]。利用RDP classifier(version 2.11)貝葉斯算法對97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設(shè)置比對閾值為70%。

利用Mothur軟件(version 1.30.2)對序列進(jìn)行抽平[16]，計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)(Ishannon)、Simpson指數(shù)(Isimpson)、Chao指數(shù)(Ichao)和Ace指數(shù)(IAce)和Coverage指數(shù)(Icoverage)。利用QIIME軟件(version 1.9.1)制成稀釋曲線，進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis,PCA)，繪 制 相 關(guān) 性Heatmap圖。

3.形式的多樣性。流行音樂不應(yīng)該只是流行歌曲的代名詞，它還包括通俗鋼琴曲、經(jīng)典影視音樂和影視歌曲、輕音樂等。豐富多彩的流行音樂能夠使學(xué)生更好地了解經(jīng)典作品。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻對養(yǎng)殖水體中N、P的影響

在整個(gè)養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，水體TP的濃度呈上升趨勢，在第2、3次取樣期間，TP的濃度上升最快。在第3次取樣時(shí)，MC組與NC組的總磷濃度差異顯著(P＜0.05)，在第4次取樣時(shí)，MC和HC組的總磷濃度都比NC組低，但各組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

在整個(gè)養(yǎng)殖期間，水體NH4+-N濃度整體呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，下降速率HC＞MC＞LC＞NC。第3次取樣時(shí)，各處理組之間差異不顯著(P＞0.05)，但MC組和HC組的NH4+-N濃度明顯低于NC組，且HC組的濃度更低。第4次取樣時(shí)，LC組與MC組、MC組與HC組之間，水體NH4+-N濃度差異顯著(P＜0.05)，NC、MC和HC組的NO3--N濃度均呈上升趨勢。試驗(yàn)期間，各處理組水體中NO2--N濃度整體呈上升趨勢，但不同取樣期間各處理組之間差異不顯著(P＞0.05)。第1、2次取樣時(shí)，水體NO2--N濃度差異不大，但第3、4次取樣時(shí)，水體NO2--N含量比前2次明顯升高，且第3次取樣HC組的NO2--N含量低于NC組。

2.2 小球藻對水體微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 微生物群落多樣性分析 對試驗(yàn)過程中采集的48個(gè)水體樣品進(jìn)行16S rRNA測序，共獲得7027597對Reads，將雙端Reads拼接、過濾后共產(chǎn)生2537423條優(yōu)化序列(clean tags)，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生39973條優(yōu)化序列，平均產(chǎn)生52863條優(yōu)化序列；所有樣品平均序列長度在415～416 bp之間，分類注釋共獲得1637個(gè)OTU。

不同的指數(shù)可以反映不同微生物群落組成多樣性和豐富度變化[17]。通過對樣品多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))、豐富度指數(shù)(Ace指數(shù)和Chao指數(shù))的研究，如表1所示，在第1次取樣時(shí)，分析發(fā)現(xiàn)Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)在各處理組之間存在差異，且LC1組的Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)與MC1組相比，有顯著性差異(P＜0.05)。MC1組的Shannon指數(shù)值高于其他3個(gè)處理組。在各處理組中，MC1組的Chao指數(shù)值最高，該組的微生物群落豐富度高于其他3組。LC、MC和HC組的Shannon指數(shù)值在第2、3次取樣時(shí)較對照組高，差異不顯著(P＞0.05)，但在第4次取樣時(shí)，NC4組與MC4組的Chao指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)，且NC4組的物種總數(shù)最高，群落豐富度也高于其他組。

表1 細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)

圖1 養(yǎng)殖水體營養(yǎng)鹽N、P濃度的變化

稀釋曲線可以用于比較不同樣本的物種豐富度，在選取相同序列的條件下，OTU數(shù)值越多，說明物種豐富度越高。同時(shí)，它還可以表征樣本的測序深度情況，判定取樣量是否合理。如圖2所示，當(dāng)在97%相似水平下曲線趨向平坦，說明本研究得到的序列可以代表羅非魚養(yǎng)殖過程中水體中大多數(shù)微生物群落，能夠很好地反映該養(yǎng)殖水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 Shannon稀釋曲線圖

2.2.2 細(xì)菌群落組成分析 根據(jù)Venn圖（圖3）分析可知，第1、2、3、4次取樣時(shí)，水體中總OUT數(shù)目分別為1358、1275、1390和1480；NC、LC、MC和HC四個(gè)分組共有的OUT數(shù)目為282、398、456和463。在第4次取樣時(shí)，NC4組與LC4、MC4和HC4組共有的OTU數(shù)目比前3次取樣時(shí)高，這可能由于小球藻的添加次數(shù)增加，細(xì)菌群落組成逐漸趨于穩(wěn)定。

圖3 各分組樣品中OUT數(shù)目Venn圖

根據(jù)OUT的注釋結(jié)果，分別對各處理組在門(Phylum)和屬(Genus)的分類水平上群落結(jié)構(gòu)組成分析，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)養(yǎng)殖過程中，各組的優(yōu)勢菌門主要為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，這3種優(yōu)勢菌門在各處理組所占比例均達(dá)80%以上。從1～4次取樣上看，NC、LC、MC和HC四個(gè)組中變形菌門的相對豐度隨養(yǎng)殖時(shí)間的增加呈降低趨勢，而放線菌門有增加的趨勢，這也是群落隨時(shí)間變化的重要特征之一。從單個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)來看，在第1次取樣時(shí)，NC1和LC1組放線菌門的相對豐度明顯低于MC1和HC1組，擬桿菌門變化趨勢與放線菌門相反；第2次取樣時(shí)，MC2組疣微菌門(Verrucomicrobia)的相對豐度在各處理組之間最大；第3、4次取樣時(shí)，放線菌門的相對豐度比前2次取樣時(shí)增加，但變形菌門的比例變小，這說明隨著養(yǎng)殖周期的增加，水環(huán)境的變化更有益于放線菌門細(xì)菌的生長，而對變形菌門細(xì)菌的生長有一定程度的抑制作用，對擬桿菌門的影響變化不大，但在HC3組中，擬桿菌門的相對豐度明顯高于其他分組（圖4）。

圖4 門分類水平上的群落組成

分別對4次取樣的水體樣品在屬分類水平上進(jìn)行群落豐度分析。在第1次取樣時(shí)，NC1和LC1處理組的優(yōu)勢菌屬不明顯，主要為Limnohabitans、Ramlibacter和新鞘脂菌屬(Novosphingobium)，MC1組的絕對優(yōu)勢菌屬為norank-f-Rhizobiales-Incertae-，HC1組的絕對優(yōu)勢菌屬為鞘脂菌屬(Sphingobium)。在第2次取樣時(shí)，各處理組的優(yōu)勢菌屬較第1次取樣時(shí)差別較大，主要由norank-f-Rhizobiales-Incertae-、noranko-OPB56和Mycobacterium三種菌屬組成，且隨著小球藻濃度的增加，3種優(yōu)勢菌屬的相對豐度有降低趨勢，unclassified-f-Rhodobacteracea和黃桿菌屬(Flavobacterium)的相對豐度逐漸增加。與前2次取樣時(shí)相比，第3、4次取樣時(shí)Aurantimicrobium和hgcI-clade菌屬的相對豐度顯著增加。在整個(gè)養(yǎng)殖過程中，HC3組Flavobacterium的相對豐度明顯高于其他各處理組，HC4組中hgcI-clade菌屬的相對豐度在該組占比達(dá)30%，屬絕對優(yōu)勢菌屬。Limnohabitans菌屬隨養(yǎng)殖時(shí)間的增加逐漸減少，這種現(xiàn)象表明不僅是因?yàn)樾∏蛟宓奶砑右种屏嗽摼鷮俚纳L，還可能因?yàn)檫@種菌屬是自然養(yǎng)殖過程中群落隨時(shí)間變化的標(biāo)志菌之一。

2.3 水體微生物與環(huán)境之間的關(guān)系

圖6為養(yǎng)殖期間水體微生物在門分類學(xué)水平上與環(huán)境因子NH4+-N、NO3--N、NO2--N和TP的相關(guān)性Heatmap圖，紅色越深代表對應(yīng)菌門的豐度越高，藍(lán)色越深代表對應(yīng)菌門的豐度越低。選取豐度前10的門類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體中主要菌門為放線菌門(Actinobacteria)、棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和梭桿菌門(Fusobacteria)，其中，變形菌門細(xì)菌的豐度和NO3--N、NO2--N和總磷都具有極顯著的相關(guān)性，但和NH4+-N的相關(guān)性不大；變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)和裝甲菌門(Armatimonadetes)在養(yǎng)殖期間的豐富度較低，尤其以變形菌門的豐富度最低。在4種水質(zhì)指標(biāo)中，擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和梭桿菌門(Fusobacteria)和NH4+-N的相關(guān)性最高，和其他水質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性較低。

圖5 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)組成分布

圖6 門分類水平上環(huán)境因子與微生物組成相關(guān)性分析圖

3 討論

3.1 小球藻對水體氮磷的去除作用

養(yǎng)殖水體是魚類生活的直接環(huán)境，水質(zhì)的好壞決定了魚體能否健康生長。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著養(yǎng)殖周期的增加，殘餌和糞便在水體中不斷積累，使水體中的氮磷含量都有一定程度的上升趨勢。對于水體磷含量，上升呈先急后緩的趨勢，這可能因?yàn)樵囼?yàn)前期小球藻未能在水體中形成優(yōu)勢物種，在水體中含量較少，從而對磷酸鹽的去除效果不好。不同取樣時(shí)期，HC組的總磷含量低于其他處理組，也說明有吸收磷酸鹽的作用，這與陳春云等研究小球藻在對蝦養(yǎng)殖水體中的影響[18]，它能夠去除水體中的磷酸鹽一致，但去除率較低，可能與養(yǎng)殖生物種類和小球藻的添加量有關(guān)。

水體中殘餌和魚體代謝物經(jīng)微生物分解，變成NH4+-N等小分子無機(jī)物[19]，使水體游離態(tài)的氨濃度上升，含量過高會(huì)對魚體產(chǎn)生毒害作用[20]。養(yǎng)殖過程中，NH4+-N呈先上升后下降的趨勢，可能隨著殘餌、糞便的不斷積累，水體中的NH4+-N含量升高，而小球藻的濃度不足以降低養(yǎng)殖水體中的NH4+-N濃度。但隨著小球藻添加量的增加，對NH4+-N的去除效果更好。第3次取樣HC組明顯低于NC組，這說明小球藻有去除養(yǎng)殖水體氮的作用，與王黎穎等[21]的結(jié)果一致。

NO2--N作為NH4+-N轉(zhuǎn)化為NO3--N的中間產(chǎn)物，對魚類的毒害作用比NH4+-N和NO3--N更強(qiáng)[22]。在養(yǎng)殖試驗(yàn)后期，水體中的NO2--N含量較前兩次高，可能因?yàn)轲B(yǎng)殖后期，陰雨天較多，水體中溶解氧含量降低，阻礙了水體中NH4+-N轉(zhuǎn)化為NO3--N，使中間產(chǎn)物NO2--N增多，但HC組的含量和其他3個(gè)組相比偏低，這可能與小球藻的不同添加量有關(guān)。與NO2--N相比，NO3--N對養(yǎng)殖生物的毒性比NH4+-N和NO2--N小得多，但高濃度NO3--N對養(yǎng)殖生物也會(huì)產(chǎn)生不良影響[23]。馬紅芳等[24]研究發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖廢水中添加一定濃度的柵藻，在一定時(shí)間內(nèi)可以降低水體中NO3--N含量，且去除效率可達(dá)90%，與本研究結(jié)果相似，但本研究中小球藻對NO3--N的去除率較低，這可能與小球藻的添加量以及飼料投喂量的增加有關(guān)。因此，建議在實(shí)際養(yǎng)殖水體中，適當(dāng)提高小球藻的添加濃度，使養(yǎng)殖水體中N、P營養(yǎng)鹽濃度處于達(dá)標(biāo)狀態(tài)。

3.2 小球藻對養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

3.2.1 小球藻對養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性影響 養(yǎng)殖水體是養(yǎng)殖生物直接生活的環(huán)境，水體中細(xì)菌群落種類和豐富度是水質(zhì)條件好壞的綜合反映[25]。在養(yǎng)殖期間，隨著添加蛋白核小球藻次數(shù)的增加，水體中共有的OUT數(shù)目也在不斷增加，群落組成相似性增加，說明小球藻的添加有助于某些微生物的生長，使養(yǎng)殖水體中的共有物種數(shù)目增加，細(xì)菌群落相似性增加。

細(xì)菌群落多樣性決定了它對外界干擾因素的抵抗能力，菌群組成越復(fù)雜，說明對外界環(huán)境變化和種群波動(dòng)的調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高[26]。在試驗(yàn)前期和中期，隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，各處理組物種多樣性和群落豐富度差異減小，且添加小球藻組(LC、MC和HC)的Shannon指數(shù)值高于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)，這可能是因?yàn)樵谛∏蛟逋斗懦跗?，它還沒有在養(yǎng)殖水體中形成優(yōu)勢種，對水體中微生物群落的影響較小。在養(yǎng)殖試驗(yàn)?zāi)┢?，NC4組與MC4組的Chao1指數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)，且NC4組的物種總數(shù)最高，群落豐富度也高于其他組，這可能由于小球藻在該水體中逐漸穩(wěn)定，生長優(yōu)勢形成，對水體某些微生物種群的影響較大，形成優(yōu)勢種，導(dǎo)致其他物種種類減少，物種豐富度降低。

3.2.2 小球藻對微生物群落組成差異性分析 細(xì)菌在養(yǎng)殖水體中營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)具有重要作用，細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)決定了水體環(huán)境生態(tài)功能特性。添加不同濃度的小球藻對養(yǎng)殖水體細(xì)菌微生物的群落結(jié)構(gòu)影響不同。在養(yǎng)殖前期和中期，投加小球藻可以改變原有的群落組成結(jié)構(gòu)，增加各菌門細(xì)菌微生物的競爭，使原有菌門的優(yōu)勢度降低，但在養(yǎng)殖后期，變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的比例，這可能與隨著養(yǎng)殖周期的增加，這些菌門很快適應(yīng)這種變化，又形成了新的競爭優(yōu)勢有關(guān)。眾多學(xué)者研究表明：在淡水養(yǎng)殖水體中，微生物主要由變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、疣微菌門和浮霉菌門等[27-29]在整個(gè)養(yǎng)殖過程中，發(fā)現(xiàn)變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的細(xì)菌豐度最高，這與之前學(xué)者的研究結(jié)果相似。放線菌門的生長能調(diào)節(jié)水質(zhì)，抑制有害微生物的生長繁殖，還可以將水體中的N、P等元素轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)[30]，與水環(huán)境中N、P的去除緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)添加小球藻可以使變形菌門微生物有一定程度增加，但各處理組之間差異不明顯，這可能與小球藻的添加濃度較低有關(guān)。

在養(yǎng)殖中后期，優(yōu)勢菌屬為不動(dòng)桿菌屬、Aurantimicrobium和hgcI_clade等。hgcI_clade具有很強(qiáng)的吸附能力，它可以吸收養(yǎng)殖水體中碳水化合物和含氮量較高的化合物[31]，還可以促進(jìn)水體碳、氮循環(huán)，與環(huán)境因子相互作用，從而改善養(yǎng)殖水環(huán)境。不動(dòng)桿菌屬多為致病菌，它們會(huì)危害魚類健康[32]。在最后一次取樣時(shí)，不動(dòng)桿菌屬的相對豐度較前3次偏高，這可能與第3～4次取樣期間陰雨天氣較多，水體溶氧含量低，對不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌生長有利。但HC4組的該菌屬的相對豐度偏低，這也能說明添加小球藻可以一定程度上降低該菌屬的比例，減輕對魚體的毒害作用，但且該黃桿菌屬是一種條件致病菌，且為革蘭氏陰性菌，它可以引起魚體爛鰓和出血病。在第3次取樣時(shí)，HC3組該菌屬的相對豐度比其他處理組高，且該組部分魚體出現(xiàn)輕微爛鰓狀況，導(dǎo)致這種差異的主要原因可能是受自然環(huán)境和水體環(huán)境因子如光照、溫度等條件的影響，使該處理組的水體條件有益于黃桿菌門的生長[33]。

3.3 養(yǎng)殖水環(huán)境與微生物群落的關(guān)系

在整個(gè)養(yǎng)殖過程中，從斯皮爾曼相關(guān)性熱圖可以看出，養(yǎng)殖水體中擬桿菌門群落豐富度與NH4+-N含量顯著相關(guān)，這與[34]研究結(jié)果中擬桿菌門豐度與NH4+-N濃度呈正相關(guān)結(jié)果一致。在本研究中，還發(fā)現(xiàn)放線菌門的相對豐度和水體NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度呈正相關(guān)，這與Philippot等[35]的研究結(jié)果水體NH4+-N和NO3--N的含量與放線細(xì)菌門相對豐度呈負(fù)相關(guān)相反，這可能與養(yǎng)殖生物的種類、水溫、天氣狀況等有關(guān)。

4 結(jié)論

投加小球藻可以一定程度降低羅非魚養(yǎng)殖水體中氮磷含量，且高濃度組的去除效果更好，對3種形態(tài)氮的去除率NH4+-N＞NO3--N＞NO2--N。投加小球藻可以使養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落多樣性和物種豐富度有不同程度的降低作用，中濃度組和高濃度組的降低效果更顯著；此外，小球藻還可以改變養(yǎng)殖水體細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)，使變形菌門相對豐度減小，放線菌門相對豐度增加，擬桿菌門群落豐富度與NH4+-N含量顯著相關(guān)，放線菌門的相對豐度和水體NH4+-N、NO3--N和NO2--N濃度呈正相關(guān)。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過向羅非魚養(yǎng)殖池塘潑灑一定濃度的小球藻來調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體中的氮磷含量，從而達(dá)到對水體微生物群落的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也可以從微觀層面解釋微生物對水體的調(diào)控機(jī)理，為養(yǎng)殖廢水的處理提供參考，進(jìn)而提高水體凈化效率。