水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李 芹，穆樹荷，韓 剛，劉 歡，吳立冬，許玉艷，李晉成

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京100141；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100141；3上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306）

0 引言

隨著人民生活水平的逐步提高，鮮活魚蝦市場需求增長迅猛。由于產(chǎn)銷地域差別顯著，因此“南魚北運(yùn)”、“北魚南調(diào)”和“東西互運(yùn)”的現(xiàn)象十分普遍。魚用鎮(zhèn)靜劑是一類在水產(chǎn)領(lǐng)域中應(yīng)用能夠抑制水產(chǎn)品中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的藥物[1]，其作用效果快速、成本低、操作簡單。水產(chǎn)品使用鎮(zhèn)靜劑后，部分機(jī)體或全部機(jī)體新陳代謝會降低。鎮(zhèn)靜劑在水產(chǎn)品運(yùn)輸、繁育和手術(shù)等環(huán)節(jié)使用，可顯著降低應(yīng)激反應(yīng)提高成活率[2-3]。近幾年，媒體多次曝光鮮活水產(chǎn)品在運(yùn)輸、暫養(yǎng)等環(huán)節(jié)存在鎮(zhèn)靜劑濫用的問題并引起社會各界廣泛關(guān)注，對魚用鎮(zhèn)靜劑的檢測方法研究已受到研究人員的高度重視[4]，梳理現(xiàn)有的水產(chǎn)品鎮(zhèn)靜劑殘留檢測方法對我國鎮(zhèn)靜劑監(jiān)管具有重要參考意義。

水產(chǎn)品中存在的高水平含量的干擾物質(zhì)（蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂）可能會妨礙目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確分析并導(dǎo)致其回收率偏低。樣品制備是從復(fù)雜樣品基質(zhì)中提取、純化、分離和濃縮目標(biāo)分析物的過程。有效的樣品制備方法可以降低提取物中干擾物質(zhì)的含量，提高檢測準(zhǔn)確度。合適的樣品制備方法已成為準(zhǔn)確分析水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留水平的關(guān)鍵步驟，目前研究人員開發(fā)出了固相萃取(Solid phase extraction,SPE)、固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)、分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology, MIT)以 及QuEChERS(Quick easy cheap effective rugged and safe)方法。高選擇性儀器是精準(zhǔn)分析水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑的另一個關(guān)鍵因素，為了滿足水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留水平的準(zhǔn)確定量需求，高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)[5]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)[6]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[7](Gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)在其殘留檢測中受到了廣泛應(yīng)用。

本文對2007—2019年已報(bào)道的樣品制備和測定方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性進(jìn)行概述。通過對現(xiàn)有樣品制備策略、色譜/色譜-質(zhì)譜的先進(jìn)檢測技術(shù)的比較分析，提出其研究前景，以期為中國魚用鎮(zhèn)靜劑的合理使用和管理提供一些信息和借鑒。

1 水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑類型及使用規(guī)定

目前，世界上部分發(fā)達(dá)國家允許在水產(chǎn)領(lǐng)域中使用的魚用鎮(zhèn)靜劑包括MS-222、苯佐卡因、丁香酚和異丁香酚，其休藥期和最大殘留限量(MRL)詳見表1。然而，國內(nèi)缺乏對魚用鎮(zhèn)靜劑在水產(chǎn)品中使用的相關(guān)規(guī)定和監(jiān)管措施。目前僅有農(nóng)業(yè)部公告第235號《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[8]規(guī)定，地西泮可以用于食品動物，但不得檢出獸藥殘留；另外，我國將地西泮列為第二類精神藥品，參照《麻醉藥品和精神藥品管理?xiàng)l例》（國務(wù)院令第442號）規(guī)定，第二類精神藥品零售企業(yè)應(yīng)當(dāng)憑執(zhí)業(yè)醫(yī)師出具的處方，按規(guī)定劑量銷售第二類精神藥品，并將處方保存2年備查，禁止超劑量或者無處方銷售第二類精神藥品，不得向未成年人銷售第二類精神藥品；農(nóng)業(yè)部176號[9]和235號[10]公告禁止在動物飼料中使用氯丙嗪，在動物源食品中不得檢出。

表1 部分發(fā)達(dá)國家水產(chǎn)領(lǐng)域允許使用的鎮(zhèn)靜劑

2 樣品前處理技術(shù)

由于水產(chǎn)品具有基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多等特點(diǎn)，合理的樣品前處理是水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留準(zhǔn)確測定的關(guān)鍵[17]，如SPE、SPME、MIT和QuEChERS等樣品前處理技術(shù)。

2.1 固相萃取技術(shù)(SPE)

SPE技術(shù)靈敏度高、穩(wěn)定性好，是目前水產(chǎn)品中采用最多的樣品前處理技術(shù)[18]。由于鎮(zhèn)靜劑多為弱極性有機(jī)化合物，因此水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留分析中應(yīng)用最多的是反相SPE柱，如C18柱、苯基柱、HLB柱等。

C18柱使用方便，經(jīng)萃取凈化后可以采用多種檢測儀器進(jìn)行測定，因此被廣泛使用。Li等[11,19]將水產(chǎn)品中丁香酚經(jīng)乙腈提取后采用C18固相萃取凈化，先后建立基于外標(biāo)法和同位素稀釋法的GC-MS/MS分析方法。Scherpenisse等[20]、朱敏等[21]采用C18柱萃取純化水產(chǎn)基質(zhì)中的MS-222，建立了水產(chǎn)品中MS-222的HPLC-MS/MS檢測方法。高平等[22]利用C18柱建立了水產(chǎn)品中4種丁香酚類鎮(zhèn)靜劑殘留的HPLC檢測方法。

Meinertz等[23]采用苯基(Phenyl)固相萃取凈化水產(chǎn)品提取液，建立了水產(chǎn)品中丁香酚的液相色譜檢測方法。Ke等[24]采用苯基柱凈化，建立了水產(chǎn)品中3種丁香酚類鎮(zhèn)靜劑的GC-MS/MS檢測方法，定量限分別為0.4、1.2 μg/kg和0.2 μg/kg。

趙東豪等[25]采用HLB柱凈化，建立了水產(chǎn)品中丁香酚的HPLC-MS/MS檢測方法。于慧娟等[26-27]進(jìn)一步采用含有1%氨水的乙酸乙酯提取水產(chǎn)品中的地西泮及其代謝物（奧沙西泮、替馬西泮和去甲西泮），然后經(jīng)HLB柱凈化，同位素稀釋方法定量，構(gòu)建了水產(chǎn)品中地西及其代謝物的HPLC-MS/MS檢測方法，4種鎮(zhèn)靜劑的定量限均為1.0 μg/kg。

固相萃取技術(shù)具有樣品凈化效果好及回收率高的優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)在于批次間的重復(fù)性難以保證。

2.2 固相微萃取技術(shù)(SPME)

SPME是一種利用表面有機(jī)物固定相選擇性吸附濃縮目標(biāo)化合物，然后解吸附的樣品前處理技術(shù)。解析過程隨SPME后續(xù)分離手段不同而不同，對于氣相色譜(GC)是通過萃取纖維插入進(jìn)樣口后進(jìn)行熱解析，而對于液相色譜(LC)則是通過溶劑進(jìn)行洗脫。

Huang等[28]在纖維表面修飾一層聚二甲基硅氧烷(PDMS)固定相，采用直接萃取微萃取模式，萃取魚糜基質(zhì)中的2-苯氧基乙醇、MS-222、丁香酚、異丁香酚和苯佐卡因等5種鎮(zhèn)靜劑，并用氣相色譜四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，建立的方法最低檢測限分別為30、0.5、2.5、14、6 μg/kg。

固相微萃取技術(shù)集采樣濃縮于一體，克服了傳統(tǒng)樣品前處理技術(shù)的缺點(diǎn)，其高效、快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)得到人們的共識。由于SPME技術(shù)成本高，對多組分化合物存在樣品吸附競爭等問題，因此在水產(chǎn)品檢測中還未受到廣泛應(yīng)用。目前主要用于食品風(fēng)味分析[29]。

2.3 分子印跡技術(shù)(MIT)

MIT是一種通過在吸附材料表面構(gòu)筑對目標(biāo)分子具有選擇性識別功能的“空穴”，達(dá)到對目標(biāo)分子選擇性吸附濃縮，然后解吸附進(jìn)行分析的樣品前處理技術(shù)[30-33]。Sun等[34]利用苯佐卡因?yàn)槟０宸肿?，甲基丙烯酸為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，采用懸浮聚合法得到平均粒徑10～20 μm的吸附材料，填充后制得分子印跡SPE柱，構(gòu)建了水產(chǎn)品中苯佐卡因的HPLC分析方法，回收率為89.82%～91.94%。Seyed Mosayeb等[35]以MIP為填料，利用填充注射器(MEPS)進(jìn)行微萃取，戊卡因?yàn)槟０宸肿印＠肕IP-MEPS和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對利多卡因進(jìn)行了測定，相關(guān)系數(shù)值大于0.999。Yang等[36]采用循環(huán)伏安法在石墨烯-碳納米管復(fù)合材料(GN-CNTs-IL)上制備了多孔分子印跡共聚物膜，丁香酚為模板分子，電解質(zhì)為高氯酸四丁基銨乙醇溶液。該方法選擇性及重現(xiàn)性好，實(shí)用性強(qiáng)，已成功應(yīng)用于實(shí)際樣品中丁香酚的檢測。

雖然MIT技術(shù)具有方便快捷、選擇性好，回收率高等優(yōu)點(diǎn)，但是仍然存在著很多問題：模板不能夠完全洗脫，即使反復(fù)使用有機(jī)溶劑沖洗依舊不能洗脫聚合物內(nèi)部的模板分子，從而影響其分離和純化過程[37-38]。

2.4 QuEChERS技術(shù)

自Anastassiades等[39]于2003年提出QuEChERS技術(shù)以來，其憑借簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜基質(zhì)樣品前處理方面得到了長足的發(fā)展，目前已經(jīng)被應(yīng)用到水產(chǎn)品鎮(zhèn)靜劑檢測的前處理過程中。

Li等[40]利用QuEChERS和HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)建立了水產(chǎn)中MS-222殘留的檢測方法，回收率為79.6%～119.7%，定量限為10.0 μg/kg；高平等[41]建立了QuEChERS結(jié)合SPE-HPLC同時(shí)測定水產(chǎn)品中6種卡因類鎮(zhèn)靜劑的檢測方法。該方法回收率在71.8%～95.3%之間，定量限為0.2 mg/kg。鄒游等[42]采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同時(shí)測定豬肉、魚肉、肝臟和腎臟中氯丙嗪、地西泮和安眠酮?dú)埩袅康姆治龇椒ǎ訕?biāo)回收率為92.5%～117.8%。2016年，潘燦平[43]發(fā)明一種過濾性凈化柱(multiplug filtration cleanup,m-PFC)，他們將QuEChERS技術(shù)中分散固相萃取步驟中的吸附劑裝填至固相萃取柱管內(nèi)進(jìn)行樣品處理以達(dá)到凈化提取液的目的并利用該技術(shù)建立了水產(chǎn)品中MS-222的HPLC-MS/MS檢測方法。方法的回收率為83.7%～95.6%，定量限為5.0 μg/kg。2019年，Xie等[44]基于有機(jī)合成方法合成了MS-222的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物間氨基苯甲酸乙酯-D5，并將其作為同位素內(nèi)標(biāo)，構(gòu)建了基于QuEChERS凈化的水產(chǎn)品中MS-222的同位素稀釋-HPLC-MS/MS分析方法，方法的回收率為92.08%～97.50%，定量限為4.0 μg/kg。另外，Li等[45]還設(shè)計(jì)合成了甲基丁香酚-D3，并構(gòu)建了水產(chǎn)品中甲基丁香酚的同位素稀釋-QuEChERS-GC-MS/MS分析方法，解決了甲基丁香酚同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物缺失的問題，提高了分析精度。除了提高QuEChERS方法的分析精度外，發(fā)展更加簡便的QuEChERS凈化方法是另外一個趨勢。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院李晉成等[46]構(gòu)建了一種活塞式QuEChERS凈化柱。他們將凈化填料放置到注射器底部，并且在凈化填料層的上方和下方均設(shè)有多孔篩板，該凈化柱只需通過推拉活塞就可以實(shí)現(xiàn)待凈化提取液與凈化填料之間的固液混合和固液分離。該課題組[47]最近在凈化柱上端側(cè)壁上設(shè)置了一個加樣孔，在活塞式QuEChERS凈化柱基礎(chǔ)上提出了一種可直接從加樣孔上樣的推桿式濾過型凈化柱，并將其應(yīng)用到水產(chǎn)品中MS-222的快速樣品前處理中，效果良好。在活塞式QuEChERS凈化柱基礎(chǔ)上，該課題組又提出了一種全自動震蕩提取凈化裝置[48]，以期實(shí)現(xiàn)高通量自動化QuEChERS前處理，目前正在開展樣機(jī)的研制工作。

目前，在水產(chǎn)基質(zhì)樣品前處理方面，除了以上提及的幾種常用方法外，研究人員還開發(fā)出來了漂浮-固化分散液微萃取(floating organic droplet,DLLMESFO)[49]方法?？傮w而言，SPE和QuEChERS技術(shù)憑借其較高的靈敏度和簡便的操作過程，是應(yīng)用最多的前處理方法。

3 檢測方法

為了滿足水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留相關(guān)研究的需要，確定水產(chǎn)品體內(nèi)鎮(zhèn)靜劑殘留濃度水平，研究人員開發(fā)出 HPLC[34]、GC-MS/MS[8]和 HPLC-MS/MS[25]等多種鎮(zhèn)靜劑檢測技術(shù)。

3.1 HPLC檢測方法

HPLC常用的檢測器為紫外可見吸收檢測器(Ultraviolet-Visible Detector,UVD)和熒光檢測器(Fluorescence Detector,FD)。由于常見鎮(zhèn)靜劑均具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，這兩種檢測器在水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留的HPLC分析方法中均有報(bào)道。高平等[22]采用中性氧化鋁和C18固相萃取柱(Solid-phase extraction,SPE)凈化水產(chǎn)品提取液，基于HPLC-FD分析，建立了水產(chǎn)品中4種丁香酚類鎮(zhèn)靜劑（丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚）殘留的HPLC檢測方法。檢出限為3.0～6.0 μg/kg，定量限為10.0～20.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為74.7%～103.0%。黃武等[50]利用高效液相色譜法測定了羅非魚中丁香酚殘留量，加標(biāo)回收率為80.5%～101.2%，檢出限為0.03 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg。Sun等[34]報(bào)道了用分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique,MIT)凈化水產(chǎn)品中苯佐卡因殘留，構(gòu)建了水產(chǎn)品中苯佐卡因的HPLC-紫外檢測器分析方法，回收率為89.82%～91.94%。

3.2 HPLC-MS/MS檢測方法

高效液相色譜法準(zhǔn)確度高，分離范圍廣，對化合物的結(jié)構(gòu)破壞性小。質(zhì)譜法靈敏度高，對化合物的結(jié)構(gòu)分析定性十分準(zhǔn)確，對標(biāo)準(zhǔn)樣品要求也比較低，因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在分析過程中被廣泛采用。

趙東豪等[25]采用HLB SPE柱凈化水產(chǎn)品提取液，建立了基于同位素稀釋校正的水產(chǎn)品中丁香酚的HPLC-MS/MS檢測方法。Scherpenisse等[20]、朱敏等[21]采用C18SPE柱凈化水產(chǎn)品提取液，建立了水產(chǎn)品中MS-222的HPLC-MS/MS檢測方法。于慧娟等[27]構(gòu)建了基于同位素稀釋校正方法的水產(chǎn)品中氯丙嗪的HPLC-MS/MS檢測方法，方法的定量限為1.0 μg/kg。還構(gòu)建了基于同位素稀釋校正方法的水產(chǎn)品中地西泮及其代謝物（奧沙西泮、替馬西泮、去甲西泮）的HPLC-MS/MS檢測方法[26]，四種鎮(zhèn)靜劑的定量限均為1.0 μg/kg。儲成群[51]等采用HPLC-MS/MS技術(shù)快速測定黃顙魚/桂花魚中MS-222的殘留，方法回收率為77.8%～95.8%，精密度為3.4%～5.2%。該方法為MS-222的殘留測定提供了參考依據(jù)。

3.3 GC-MS/MS檢測方法

Li等先后發(fā)展了基于外標(biāo)法[11]和同位素稀釋法[45]的水產(chǎn)品中丁香酚的GC-MS/MS分析方法。Ke等[24]利用SPE-GC-MS/MS法實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)品中三種丁香酚類鎮(zhèn)靜劑（丁香酚、異丁香酚和甲基丁香酚）的檢測，定量限分別為0.4、1.2、0.2 μg/kg。Huang等[28]在纖維表面修飾一層聚二甲基硅氧烷(PDMS)固定相得到固相微萃取柱(Solid-phase micro-extraction,SPME)，建立了基于直接萃取微萃取的水產(chǎn)品中2-苯氧基乙醇、MS-222、丁香酚、異丁香酚和苯佐卡因5種鎮(zhèn)靜劑氣相色譜四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測方法，方法檢測限分別為30、0.5、2.5、14 μg/kg和6 μg/kg。陳煥[52]等人建立了同時(shí)檢測水產(chǎn)品中6種丁香酚類麻醉劑殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測方法，該方法對丁香酚類化合物檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定具有一定的參考價(jià)值。

目前，在水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留的檢測方法中，HPLC-MS/MS或GC-MS/MS憑借其靈敏度高、抗基質(zhì)干擾性強(qiáng)和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛應(yīng)用。然而由于基質(zhì)效應(yīng)明顯，除開發(fā)行之有效的樣品制備方法之外，合理內(nèi)標(biāo)物特別是同位素內(nèi)標(biāo)物的選擇是降低基質(zhì)效應(yīng)的另一個有效手段，Li等最近基于有機(jī)合成方法先后合成了MS-222的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物間氨基苯甲酸乙酯-D5[44]和甲基丁香酚同位素標(biāo)記物甲基丁香酚-D3[45]，并將其應(yīng)用于消除色譜質(zhì)譜檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)，取得很好的實(shí)驗(yàn)效果。

4 結(jié)論與展望

隨著國家“水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展”的理念的提出，綠色興漁、質(zhì)量興漁已經(jīng)成為共識。但發(fā)展現(xiàn)代漁業(yè)，保證水產(chǎn)品在市場流通中的品質(zhì)，合理并規(guī)范的使用鎮(zhèn)靜劑是其中重要的一環(huán)。高效、簡便的檢測技術(shù)可為其科學(xué)使用和監(jiān)管提供重要技術(shù)支撐。在未來的研究中，應(yīng)著重進(jìn)行以下研究：逐步完善和健全鎮(zhèn)靜劑使用的相關(guān)法律法規(guī)，建立允許使用的魚用鎮(zhèn)靜劑的目錄及使用標(biāo)準(zhǔn)；合理的樣品前處理方法是水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留準(zhǔn)確測定方法研究的核心內(nèi)容。目前僅有超聲輔助萃取、固相萃取、固相微萃取、分子印跡技術(shù)等前處理技術(shù)的應(yīng)用報(bào)道。未來可以開發(fā)新型吸附材料及凈化方式，如活塞式QuEChERS凈化柱和推桿式濾過型凈化柱，進(jìn)而發(fā)展自動樣品前處理技術(shù)，縮短前處理流程和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)高效前處理。