化學發(fā)光技術(shù)中磁珠濃度對光信號水平的影響

劉 棟,仝 慧,陳 斌,胡 健,張 寧,王曉琴△

.陜西省銅川市人民醫(yī)院檢驗科，陜西銅川 727000；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710061

化學發(fā)光技術(shù)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種實驗室檢測技術(shù)，結(jié)合了抗原抗體反應的特異性及化學發(fā)光反應的靈敏度，因此具有更高的檢測靈敏度和檢測線性范圍，尤其是隨著磁珠的應用，使得其反應過程從非均相變?yōu)榫?，從而更容易實現(xiàn)全自動化，反應速度更快，各種誤差更小，檢測結(jié)果重復性更高，因此被廣泛用于各種化學物質(zhì)的檢測中，是21世紀最具有發(fā)展前景的檢測技術(shù)之一。在化學發(fā)光分析中，通常采用磁珠作為固相吸附材料。應用最為廣泛的是將鏈霉親和素結(jié)合在磁珠上[1]，通過生物素和鏈霉親和素之間的強結(jié)合力來捕獲含有生物素的發(fā)光物質(zhì)，再通過磁珠的磁性以達到分離，并通過對發(fā)光信號的檢測以實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定量測定。磁珠本身雖然與發(fā)光物質(zhì)無關，卻可通過其磁性對發(fā)光物質(zhì)進行捕獲，因此，反應體系中磁珠量的變化可能也會對光信號產(chǎn)生影響，從而影響檢測結(jié)果。但文獻中相關報道較少，本研究擬通過實驗觀察對此進行評價驗證。

1 材料與方法

1.1儀器設備與材料 羅氏E 601全自動電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)；低速離心機；分光光度計；羅氏公司鏈霉親和素磁珠試劑和專用稀釋液；羅氏β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)、糖類抗原125(CA125)、腦鈉肽(BNP)、肌鈣蛋白Ⅰ(TNI)、總前列腺特異抗原(TPSA)、游離前列腺特異抗原(FPSA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、鱗狀細胞癌抗原(SCC)、細胞角蛋白19片段(CYFRA21)、促甲狀腺激素(TSH)、孕酮(Prog)、游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)試劑；高值混合血清(β-HCG、AFP、CEA、CA199、CA125、BNP、TNI、TPSA、FPSA、NSE、SCC、CYFRA21、TSH)、低值混合血清(Prog、FT3、FT4、T3、T4)。

1.2實驗材料準備

1.2.1不同濃度磁珠制備 (1)高濃度磁珠按照PIKETTY等[2]報道的方法進行制備。已知羅氏公司生產(chǎn)的磁珠試劑濃度為0.72 ng/mL，以此為原材料，采用離心法進行2倍、5倍和10倍濃縮，分別制備濃度為1.44、3.60、7.2 ng/mL的磁珠試劑。原倍磁珠試劑充分混勻，分別取出60、30、12 mL分別裝于3組容器中，1 000 r/min 離心15 min，第1組吸取上清液54 mL至清潔容器中，第2組吸取上清液24 mL，第3組吸取上清液6 mL，上清液均置于另一清潔容器中待用。第1組剩余的6 mL即為10倍濃縮磁珠，濃度為7.2 ng/mL；第2組剩余的6 mL即為5倍濃縮磁珠，濃度為3.6 ng/mL；第3組剩余的6 mL為2倍濃縮磁珠，濃度為1.44 ng/mL。(2)低濃度磁珠采用稀釋法對原倍磁珠試劑進行20倍、10倍、5倍和2倍稀釋制成。分別取原倍磁珠試劑3、1.2、0.6、0.3 mL，分別添加離心后上清液3、4.8、5.4、5.7 mL，分別制成2倍稀釋(濃度為0.36 ng/mL)、5倍稀釋(濃度為0.144 ng/mL)、10倍稀釋(濃度為0.072 ng/mL)和20倍稀釋(濃度為0.036 ng/mL)磁珠試劑各6mL。充分混勻，標識清楚，4～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2定量發(fā)光物質(zhì)制備 采用9 000 IU/mL的β-HCG標本100 μL+常規(guī)β-HCG R1試劑720 μL+常規(guī)β-HCG R2試劑800 μL，充分混勻，37 ℃水浴9 min，再加入10倍稀釋的磁珠(0.072 mg/mL)520 μL，充分混勻，37 ℃水浴9 min；取出后3 000 r/min離心15 min，小心吸取上清液1 400 μL棄去。沉淀物質(zhì)即為定量發(fā)光物質(zhì)。4 ℃冰箱保存待用。

1.2.3混合試劑制備 (1)分別取β-HCG、AFP、CEA、CA199、CA125、BNP、TNI、TPSA、FPSA、NSE、SCC、CYFRA21、TSH 試劑1(R1)各2 mL，混勻，裝入潔凈容器中，標注“混合R1夾心法”；同樣取 試劑2(R2)各2 mL，混勻，裝入潔凈容器中，標注“混合R2夾心法”，4～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)分別取Prog、FT3、FT4、T3、T4 R1各 2.4 mL，混勻，裝入潔凈容器中，標注“混合R1競爭法”；同樣取R2 各 2.4 mL，混勻，裝入潔凈容器中，標注“混合R2 競爭法”，4～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4混合血清制備 已收集的凍存于-80 ℃的各項目(夾心法β-HCG、AFP、CEA、CA199、CA125、BNP、TNI、TPSA、FPSA、NSE、SCC、CYFRA21 和TSH，競爭法Prog、FT3、FT4、T3和T4)高值和低值標本各10份；夾心法中每個標本中均含有一個或幾個上述項目的高值結(jié)果；競爭法中每個標本均含有一個或幾個上述項目的低值結(jié)果。高值標本濃度均在其檢測上限附近；低值標本均在其檢測下限附近。每份高值標本各取樣100 μL，充分混勻，共1 000 μL；分為2份，每份500 μL，標識為“夾心法高值混合血清”。同法制備“競爭法低值混合血清”。-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ环萦糜趯嶒灆z測，另一份用于復查備用。

1.3檢測方法

1.3.1觀察磁珠濃度與光信號之間的關系 羅氏E 601檢測平臺上，夾心法模式混合R1/R2試劑+夾心法高值混合血清+不同濃度磁珠，采用β-HCG測量程序進行夾心法模式測量；競爭法模式混合R1/R2試劑+競爭法低值混合血清+不同濃度磁珠，采用Prog測量程序進行競爭法模式測量。觀察磁珠濃度與光信號之間的關系，計算相關系數(shù)R2。

1.3.2觀察不同濃度磁珠的吸光度和透光率 721分光光度計620 nm波長處以空氣調(diào)吸光度為0、透光率為100%，分別測量不同濃度磁珠的吸光度和透光率。

1.3.3觀察定量發(fā)光物質(zhì)在不同濃度磁珠中的光信號變化 分別采用β-HCG和Prog 測量程序，用羅氏專用稀釋液替代R1和R2，不同濃度磁珠分別替代原倍磁珠，定量發(fā)光物質(zhì)作為標本，羅氏E 601檢測平臺上分別測量其光信號水平。

1.4統(tǒng)計學處理 磁珠濃度與光信號、吸光度、透光率的關系采用線性回歸方法進行回歸方程和R2的計算；定量發(fā)光物質(zhì)的光信號強度以磁珠濃度為0 mg/mL時的光信號值為基準，差異在10%以內(nèi)認為無差異[3]；光信號差異超過10%時，以差異幅度和磁珠濃度采用線性回歸方法進行回歸方程和R2的計算。

2 結(jié) 果

2.1磁珠濃度與光信號值的關系 隨著磁珠濃度的增加，光信號分別呈現(xiàn)上升期、平臺期和下降期。夾心法模式在磁珠 20倍稀釋(0.036 mg/mL)至原倍(0.72 mg/mL)之間隨著磁珠濃度的增加，光信號逐漸增加，光信號從31 190增加至306 418，增加幅度882.42%(夾心法上升期Y=389 690X+33 929，R2=0.983 5)，磁珠濃度越大，光信號越高。磁珠濃度在0.72～1.44 mg/mL時光信號保持恒定不變，光信號從306 418至308 131，變化幅度-0.56%，小于10%。磁珠濃度在1.44 ～7.2 mg/mL時，隨著磁珠濃度的增加，光信號逐漸下降，光信號值從308 131減小至85 295，下降幅度-72.32%(夾心法下降期Y=37 315X+342 111，R2=0.939 1)，磁珠濃度越大，光信號值越低。競爭法模式光信號變化曲線與夾心法模式相似但不完全相同，上升期磁珠濃度為0.036～0.36 mg/mL(競爭法上升期Y=325 333X+35 666，R2=0.849 9)，平臺期磁珠濃度為0.36～0.72 mg/mL，下降期磁珠濃度為1.44～7.20 mg/mL(競爭法下降期Y=19 644X+156 692，R2=0.776 8)。見圖1 。

圖1 磁珠濃度與光信號的關系

2.2不同濃度磁珠的吸光度和透光率 磁珠濃度越大，吸光度越大，透光率越低。見表1。

表1 不同濃度磁珠的吸光度和透光率

2.3定量發(fā)光物質(zhì)在不同濃度磁珠中的光信號變化 定量發(fā)光物質(zhì)實驗中，當磁珠濃度在夾心法模式中<0.36 mg/mL、在競爭法模式中<0.72 mg/mL時，與磁珠濃度為0 mg/mL時相比，光信號減少程度在10%以內(nèi)；當磁珠濃度在夾心法模式中>0.36 mg/mL、在競爭法模式中>0.72 mg/mL時，與磁珠濃度為0 mg/mL時相比，光信號減少程度在10%以上；且磁珠濃度越大，光信號水平越低，差異幅度越大。磁珠濃度與光信號水平的差異幅度呈負相關(夾心法Y=-0.138 7X-0.070 9，R2=0.837 7；競爭法Y=-0.529 1X-0.058 1，R2=0.894 3)。見圖2。

注：A為夾心法模式空白光信號；B為夾心法模式總光信號與總光信號-空白光信號；C為競爭法模式空白光信號；D為競爭法模式總光信號與總光信號-空白光信號。

3 討 論

盡管磁珠本身與發(fā)光物質(zhì)的生成無關，卻發(fā)揮著捕獲發(fā)光物質(zhì)以供測量光信號的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，磁珠濃度在0～0.36 mg/mL時，在夾心法模式和競爭法模式中，磁珠濃度均與光信號呈正相關；而當磁珠濃度>0.72 mg/mL時，在兩種模式中，磁珠濃度與光信號呈負相關(圖1)。呈現(xiàn)正相關是因為當發(fā)光物質(zhì)量一定時，磁珠相對不足，隨著磁珠濃度的增加，對發(fā)光物質(zhì)的捕獲量也在增加，因此二者之間呈正相關。而當磁珠相對充足時，所有的發(fā)光物質(zhì)均可被捕獲，此時過多的磁珠反而可能會對光信號的接收識別產(chǎn)生屏蔽作用。目前在化學發(fā)光技術(shù)中常用的磁珠直徑多在1～5 μm，相較于微米級別的磁珠，吸附于其上的粒徑為納米級別的鏈霉親和素對光信號的影響幾乎可以忽略。因此，這種屏蔽效應可能主要是由磁珠本身所產(chǎn)生，磁珠濃度越大，屏蔽作用越強。屏蔽作用可能由以下原因產(chǎn)生：在目前的化學發(fā)光儀器設計中，光信號的測量主要有兩種模式，一種是以磁鐵/電極吸附狀態(tài)直接測量發(fā)光信號；另一種是先吸附，再解吸附后以混懸液狀態(tài)進行光信號測量。在第1種測量模式中，由于磁鐵或電極的表面積有限，過量的含磁珠物質(zhì)不能以單層排列狀態(tài)吸附，而是以層疊狀態(tài)被吸附。這種層疊狀態(tài)可能導致位于底層的發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的光信號被其上層的磁珠遮擋而不能傳至光信號接收器(圖2)。在第2種測量模式中，混懸液由于磁珠濃度增加而透光率下降(表1)，也會導致被光信號接收器接收的光信號減弱。磁珠濃度越大，層疊越多或透光率越小，可測得的光信號越低。因此，磁珠濃度過高或過低均可導致光信號減弱。

在應用磁珠的化學發(fā)光檢測中，光信號減弱可導致夾心法項目檢測結(jié)果假性降低而競爭法項目檢測結(jié)果假性升高。這與外源性生物素對基于生物素-鏈霉親和素的化學發(fā)光技術(shù)的干擾表現(xiàn)相同。典型的表現(xiàn)是在甲狀腺功能檢查組合中，采用夾心法模式的TSH檢測結(jié)果假性降低，而采用競爭法模式的T3、T4、FT3、FT4檢測結(jié)果假性降低，從而完美模擬了Graves病的實驗室表現(xiàn)，極易導致甲狀腺功能正常人群被誤診為Graves病[4-5]。這種影響也可導致采用夾心法模式的肌鈣蛋白檢測結(jié)果假陰性而使心肌梗死患者被漏診，從而喪失最佳救治時間[6-7]。學者們普遍認為其干擾的本質(zhì)是由于反應體系中的鏈霉親和素相對不足所致[4,8]，因此多位學者在體外采用磁珠試劑和血清標本混合的方式，以吸附去除血清標本中的生物素，結(jié)果均顯示可明顯降低外源性生物素對檢測結(jié)果的干擾程度[3，9-10]。劉棟[11]在全自動化學發(fā)光儀器中使用2～10倍濃縮的磁珠試劑進行抗生物素干擾，也取得了較好的效果。這些均說明磁珠濃度的改變可對光信號產(chǎn)生影響。

雖然化學發(fā)光技術(shù)理論上不受朗伯-比爾定律的限制[12]，但前提是所有的發(fā)光物質(zhì)所發(fā)出的光信號均位于同一個空間平面且空間距離的透光性能維持恒定。而當磁珠濃度改變超過一定限度時，則可能改變含有磁珠的發(fā)光物質(zhì)在磁鐵/電極表面的單層吸附狀態(tài)，也會改變即使是很微小的空間距離的透光性能(表1)。因此，化學發(fā)光技術(shù)不受朗伯-比爾定律的限制在技術(shù)實踐層面可能是不完全準確的。本研究還發(fā)現(xiàn)，當磁珠濃度在0.36～0.72 mg/mL時，光信號保持相對穩(wěn)定(圖1)，定量發(fā)光物質(zhì)光信號測量也顯示在此濃度范圍內(nèi)，與磁珠試劑0 mg/mL相比，光信號改變幅度小于10%(圖2)。這說明該范圍是較為適宜的磁珠濃度范圍，既避免了由于磁珠濃度太低所導致的鏈霉親和素不足，也避免了磁珠濃度過高而對光信號的屏蔽作用。

綜上所述，在使用磁珠的化學發(fā)光分析中，磁珠濃度過大或過小均可導致光信號減弱，產(chǎn)生類似于外源性生物素干擾的表現(xiàn)，從而對臨床診療產(chǎn)生嚴重影響。實驗室人員應重視磁珠濃度的管理和控制，在磁珠試劑的儲存、運輸和使用過程中采取有效措施，保證磁珠試劑濃度的穩(wěn)定。