SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)進(jìn)展及應(yīng)用

黃 斐， 張春燕， 潘柏申， 王蓓麗， 郭 瑋

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361015）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）可引起新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19），目前SARS-CoV-2核酸檢測是確診COVID-19和無癥狀感染的有效手段。臨床主要針對SARS-CoV-2的抗體和核酸進(jìn)行檢測。SARS-CoV-2抗體檢測操作簡便、檢測快速，但抗體具有一定的窗口期，僅可作為核酸檢測的補(bǔ)充手段。核酸檢測作為診斷病原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有早期診斷以及靈敏度和特異性高等特點，適用于無癥狀感染者的早期篩查以及患者疾病的管控。

近年來，病毒核酸檢測技術(shù)發(fā)展迅猛，除臨床常用的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)外，基于高通量測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)、基于等溫擴(kuò)增技術(shù)、基于雜交捕獲免疫熒光技術(shù)和基于基因芯片技術(shù)檢測SARS-CoV-2的方法也處于研發(fā)當(dāng)中，部分技術(shù)已應(yīng)用于臨床。為擴(kuò)大重點地區(qū)篩查范圍，加強(qiáng)疫情防控力度，尋求一種高效的核酸檢測途徑勢在必行?；鞓訖z測可大幅提升檢測效率，緩解檢測壓力，節(jié)省醫(yī)療資源，但其如何規(guī)范、科學(xué)地應(yīng)用于臨床實踐，需要更多研究結(jié)果的積累和總結(jié)。本文對SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)和混樣檢測模式進(jìn)行綜述，以期為臨床實驗室選擇適宜的檢測技術(shù)和大規(guī)模人群的篩查策略提供參考。

1 基于NGS技術(shù)的核酸檢測

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]明確了病原學(xué)檢查應(yīng)采用NGS技術(shù)檢測上/下呼吸道、血液、糞便等樣本中的SARSCoV-2核酸。NGS是對樣本中的病毒核酸進(jìn)行大規(guī)模平行測序，通過生物信息分析病毒全序列或特定序列[2]，檢測流程包括構(gòu)建文庫、測序和生物信息分析?；贜GS的核酸檢測包括宏基因組測序、探針捕獲測序和多重PCR擴(kuò)增子測序，表1為不同NGS技術(shù)的原理、特征和適用場景[3]。宏基因組測序受樣本中病毒載量的影響，測序數(shù)據(jù)量不足會導(dǎo)致病毒序列信息獲取不完整，影響后續(xù)分析。多重PCR建庫能富集極低載量（載量＜102拷貝/mL或Ct值＞35）的病毒核酸?；赥n5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄組測序法優(yōu)化了建庫過程，對樣本量需求較小，提高了SARS-CoV-2測序的質(zhì)量和速度[4]。

表1 不同NGS技術(shù)的特征

NGS技術(shù)在SARS-CoV-2的鑒定中發(fā)揮了重要作用。疫情初期，借助NGS技術(shù)，僅用5 d就獲得了病毒全基因組序列并確認(rèn)了病原體[5]，而2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒和2013年人禽流感病毒的發(fā)現(xiàn)均耗時數(shù)月，NGS作為可快速確定病原體的關(guān)鍵技術(shù)，為后續(xù)設(shè)計其他檢測試劑盒提供了相關(guān)基因序列信息。研究人員通過NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)5例湖北武漢金銀潭醫(yī)院重癥肺炎患者的支氣管肺泡灌洗樣本中存在相似度99.9%的共同序列，且與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒有79.5%的序列一致[6]。病毒全基因組序列的組裝在溯源進(jìn)化分析、預(yù)測病毒的傳播模式、發(fā)現(xiàn)和分析突變位點等方面亦有重要的作用。多個研究機(jī)構(gòu)的測序結(jié)果顯示，SARS-CoV-2與蝙蝠相關(guān)冠狀病毒ZC45和ZXC21的同源性約為88%[7]，為揭示病原體傳播途徑、追溯傳染源頭提供了依據(jù)。NGS技術(shù)也有助于混合感染的鑒別，已有團(tuán)隊研發(fā)出納米孔靶向測序技術(shù)，此技術(shù)能同時檢測包括SARS-CoV-2在內(nèi)的40種常見呼吸道病毒[8]。盡管NGS技術(shù)有上述優(yōu)勢，但檢測周期長、流程復(fù)雜、未標(biāo)準(zhǔn)化、缺乏專業(yè)生物信息分析人員、測序深度不足（綜合成本和時間）等不足，使其難以成為臨床一線普遍開展的方法。

2 基于實時熒光RT-PCR技術(shù)的核酸檢測

實時熒光RT-PCR技術(shù)是目前臨床上廣泛應(yīng)用的SARS-CoV-2核酸檢測方法，具有檢測時間短、操作便捷、特異性及重復(fù)性好的特點。實時熒光RT-PCR技術(shù)首先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，利用熒光標(biāo)記的特異性探針對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時監(jiān)測產(chǎn)物擴(kuò)增量，根據(jù)擴(kuò)增曲線計算出起始模板量[9]。

目前獲批的SARS-CoV-2檢測試劑盒主要針對ORF1ab、N和E基因保守基因序列，根據(jù)針對靶標(biāo)數(shù)量可分為單靶標(biāo)、雙靶標(biāo)和三靶標(biāo)檢測試劑。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[1]推薦選用至少包含針對ORF1ab、N基因區(qū)域的檢測試劑。我國共有80多家企業(yè)進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒的研發(fā)，目前已有10余個基于實時熒光RT-PCR技術(shù)的檢測試劑盒獲得國家藥品監(jiān)督管理局的審批。獲批的試劑盒主要采用2種不同的內(nèi)標(biāo)方式對檢測體系進(jìn)行監(jiān)控，包括人源性內(nèi)標(biāo)（內(nèi)源性）和合成假病毒內(nèi)標(biāo)（外源性）。相比外源性內(nèi)標(biāo)，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)能對整個步驟進(jìn)行監(jiān)控，包括采樣（檢測前）、實時熒光RT-PCR檢測（檢測中）。全國SARS-CoV-2核酸檢測室間質(zhì)量評價以及多項研究結(jié)果顯示，不同試劑的檢測靈敏度不同（200～1 000 拷貝/mL），針對的靶標(biāo)也不同，同時各檢測試劑對弱陽性樣本的結(jié)果存在一定的差異，因此應(yīng)盡可能采用不同檢測試劑對弱陽性樣本進(jìn)行復(fù)檢，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。緊急獲批的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒研發(fā)上市時間短，質(zhì)量良莠不齊，因此各實驗室應(yīng)在臨床應(yīng)用前完成性能驗證，實驗人員應(yīng)在檢測過程中做好質(zhì)量控制，對可疑結(jié)果應(yīng)及時與臨床溝通。

3 基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的核酸檢測

實時熒光RT-PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，是SARS-CoV-2核酸檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但仍存在局限性，昂貴的檢測設(shè)備和對檢測人員的專業(yè)要求限制了這一技術(shù)在各級醫(yī)院，尤其是基層醫(yī)院檢驗科的開展，且檢測耗時（2 h）無法滿足龐大的檢測需求，因此亟待開發(fā)更快速、簡便、高靈敏度的檢測方法[11]?；诘葴財U(kuò)增的核酸檢測技術(shù)在SARS-CoV-2檢測中顯示出了良好的應(yīng)用前景。

3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)

2000年，NOTOMI等[12]建立了一種快速、便捷、高靈敏度的新型核酸檢測方法，即LAMP技術(shù)。應(yīng)用WarmStart RTx逆轉(zhuǎn)錄酶可在1個反應(yīng)中同時完成RT和LAMP，無需逆轉(zhuǎn)錄后的純化，顯著縮短了反應(yīng)時間，實現(xiàn)了快速SARSCoV-2核酸檢測。國內(nèi)外多個團(tuán)隊正在研發(fā)基于RT-LAMP技術(shù)的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒[13-15]，用4～6條針對SARS-CoV-2ORF1ab、S、E和N基因?qū)ｉT設(shè)計的引物，在等溫（65 ℃）條件下利用鏈置換DNA聚合酶合成靶序列，整個過程不到1 h即可完成，最后通過pH指示劑的顏色變化進(jìn)行可視化判讀，或通過探針進(jìn)行實時熒光監(jiān)測[13]。有研究結(jié)果顯示，RT-LAMP技術(shù)檢測靈敏度與實時熒光RT-PCR技術(shù)相似，且與其他呼吸道冠狀病毒無交叉反應(yīng)，檢測特異性高于血清學(xué)檢測[14]。通過比較56例臨床樣本的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法檢測一致率高達(dá)92.9 %[14]。在4例檢測結(jié)果不一致的樣本中，有2例實時熒光RTPCR陽性但RT-LAMP陰性，這是由病毒載量較低（在實時熒光RT-PCR檢測中Ct值接近38）導(dǎo)致的；而2例RT-LAMP陽性（閾值＞45 min），但實時熒光RT-PCR陰性，推測原因可能是存在病毒變體，導(dǎo)致與實時熒光RT-PCR引物和/或探針不匹配[15]。RT-LAMP與實時熒光RT-PCR比較詳見表2。隨著技術(shù)的優(yōu)化，研究組人員已開發(fā)出免抽提的RT-LAMP檢測方法用于即時檢驗（pointof-care testing，POCT），盡管有假陽性結(jié)果，但可用于快速篩查，對陽性樣本，經(jīng)實時熒光RT-PCR進(jìn)行確認(rèn)。

表2 RT-LAMP與RT-PCR技術(shù)的比較

3.2 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)（nicking endonuclease amplification reaction，NEAR）技術(shù)

NEAR技術(shù)通過切口酶識別病毒核酸的特定短序列，被切割序列在等溫（60℃）條件下合成平末端，合成的短序列被繼續(xù)切割，上述過程循環(huán)往復(fù)。短序列（單鏈）與熒光探針結(jié)合，熒光信號達(dá)到閾值才能判斷為陽性。該項技術(shù)穩(wěn)定性高、檢測速度快、靈敏度高，但由于反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，產(chǎn)量易受模板限制，后期將從指數(shù)擴(kuò)增轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性擴(kuò)增。雅培ID NOW平臺已獲得美國食品與藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)證，可在5～13 min內(nèi)獲得結(jié)果，在13 min內(nèi)達(dá)到閾值即可判斷為陽性；超過13 min則為陰性。其檢測限為幾百拷貝，免核酸提取，設(shè)備簡單，在任何情況下均可快速檢測，但無法滿足高通量的需求，且對于短序列的檢測假陽性率高。有研究將該方法與實時熒光RT-PCR進(jìn)行比較，使用2種方法檢測524例確診患者的鼻咽拭子，陽性和陰性一致性分別為75%和99%[16]。

3.3 核酸序列擴(kuò)增（nucleic acid sequencebased amplification，NASBA）技術(shù)和滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）技術(shù)

NASBA技術(shù)是由一對引物介導(dǎo)的對單鏈RNA特異等溫擴(kuò)增的技術(shù)，其反應(yīng)溫度為42 ℃，可在2 h內(nèi)對核酸實現(xiàn)109～1012的擴(kuò)增[17]。該技術(shù)不受樣本中內(nèi)源和外源性物質(zhì)的干擾，更適用于鼻咽拭子、血液和體液樣本的直接檢測[18]。RCA技術(shù)基于核酸分子滾環(huán)復(fù)制的等溫擴(kuò)增技術(shù)，可在90 min內(nèi)實現(xiàn)109擴(kuò)增[19]。WANG等[20]利用RCA技術(shù)實現(xiàn)了少量呼吸道樣本中SARS-CoV-2的核酸檢測。

3.4 聯(lián)合等溫擴(kuò)增的CRISPR-Cas13技術(shù)

2017年，ABUDAYYEH等[21]證實Cas13編輯后能靶向切割多種哺乳動物體內(nèi)單鏈RNA病毒，隨后，其團(tuán)隊研發(fā)了一種聯(lián)合等溫擴(kuò)增的CRISPR-Cas13檢測RNA的技術(shù)，被稱為特異性高靈敏度酶報告系統(tǒng)[22]。利用該技術(shù)，研究人員設(shè)計出2種向?qū)NA，分別針對SARSCoV-2的S和ORF1ab基因。若樣本中存在SARSCoV-2，向?qū)NA可靶向識別，激活與其結(jié)合的Cas13蛋白，實現(xiàn)病毒RNA切割，隨后根據(jù)試紙上的條帶數(shù)目和位置，直觀地確認(rèn)SARS-CoV-2是否存在。檢測流程僅需3步，整個過程不到1 h：（1）42 ℃等溫擴(kuò)增25 min；（2）加入Cas13蛋白，向?qū)NA以及報告分子，37 ℃反應(yīng)30 min；（3）利用試紙檢測反應(yīng)后的樣本，僅需2 min。該技術(shù)能穩(wěn)定檢出SARS-CoV-2序列，且靈敏度高，檢出限為10～100拷貝/μL[23]。該方法操作便捷、儀器便攜、檢測周期短，適用于基層醫(yī)療單位和居家自檢，具有ROCT的應(yīng)用潛力。我國已有企業(yè)利用此技術(shù)研發(fā)試劑盒，但目前尚未應(yīng)用于臨床。由于使用的引物較多，向?qū)NA設(shè)計難度高，應(yīng)注意特異性及“脫靶”效應(yīng)導(dǎo)致的假陰性。

4 其他檢測技術(shù)

4.1 雜交捕獲免疫熒光法

雜交捕獲免疫熒光法是核酸雜交和免疫熒光捕獲相結(jié)合的檢測技術(shù)，可快速檢測病毒核酸，無需核酸提取純化和PCR擴(kuò)增。通過處理液直接裂解并釋放病毒靶標(biāo)核酸，靶標(biāo)核酸和探針形成DNA/RNA雜交體，通過識別雜交體的熒光信號來判斷結(jié)果。該技術(shù)僅需20 μL咽拭子或痰液樣本，平均檢測時間為45 min，1 h最多可檢測60例樣本。

4.2 基因芯片

基因芯片作為一種快速且高通量的檢測技術(shù)，已廣泛用于其他冠狀病毒檢測。該技術(shù)首先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并與特定探針結(jié)合，與特定探針結(jié)合的cDNA和固相芯片上的寡核苷酸雜交，經(jīng)洗滌后去除游離DNA，最后通過特定檢測探針完成病毒核酸檢測[24]。目前，研發(fā)人員已開發(fā)出6種呼吸道病毒核酸等溫擴(kuò)增芯片，可在1.5 h內(nèi)檢測包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種呼吸道常見病毒。隨著技術(shù)的發(fā)展，基因芯片檢測靈敏度與實時熒光RT-PCR技術(shù)相當(dāng)，且多種病毒特異性基因序列探針的設(shè)計使其診斷準(zhǔn)確率也有所提高。

5 混樣檢測模式

有研究者提出可采用混樣檢測進(jìn)行SARSCoV-2核酸篩查，即9～10個拭子樣本混合篩查的策略[25]。早在2000年，混樣檢測已在血庫中開展，用于排除獻(xiàn)血者感染乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒和梅毒螺旋桿體?；鞓映卮笮】赏ㄟ^數(shù)學(xué)模型進(jìn)行預(yù)估[26]，根據(jù)給定的流行率能估算出最佳混樣數(shù)量，但僅能作為研究的理論依據(jù)，無法直接應(yīng)用于實踐。在提升檢測效率的同時，為保證檢測敏感性和準(zhǔn)確性，多個研究對不同混樣檢測模式進(jìn)行了驗證和探索，同時指出了低病毒載量樣本漏檢的風(fēng)險[27-28]。2020年7月23日，我國國家衛(wèi)生健康委辦公廳印發(fā)的《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測技術(shù)指引》[29]劃定了混樣檢測適用范圍，規(guī)定了樣本混合的模式、具體步驟和注意事項，指出嚴(yán)禁應(yīng)用“一步法”檢測。2020年8月19日，我國國家衛(wèi)生健康委辦公廳制定了《新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范》[30]，規(guī)范了混采的模式、具體步驟和注意事項，取消了對檢測試劑的方法學(xué)限制，提出“選擇檢測限低和靈敏性高的檢測試劑盒”的要求。相比單樣檢測，混樣檢測對樣本質(zhì)量要求更高。在混樣檢測的情況下，無法通過內(nèi)參基因發(fā)現(xiàn)單個樣本采樣不足的情況，可能產(chǎn)生錯誤報告，因此應(yīng)對采樣人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，確保每例樣本的質(zhì)量都合格。目前，對于發(fā)熱門診有癥狀患者、密切接觸者等高風(fēng)險人群的檢測，還是應(yīng)該采用單采單檢。對于低風(fēng)險人群的篩查，則可以優(yōu)先選擇混樣檢測。

6 展望

為適應(yīng)我國疫情防控需求，做到“早發(fā)現(xiàn)、早報告、早診斷、早隔離、早治療”，越來越多的醫(yī)療和公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)擬開展SARSCoV-2核酸檢測。檢測需求激增，加之臨床實驗室的空間、人力、軟件和硬件資源受限，使得核酸檢測實驗室對簡便、快速、友好的檢測技術(shù)更為青睞，如POCT和自動化一體機(jī)。在此基礎(chǔ)上，微流控恒溫分子診斷技術(shù)應(yīng)運而生，其快捷、簡便的優(yōu)點可實現(xiàn)去中心化，有利于推進(jìn)基層疫情的防控。

不同SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒具有不同的技術(shù)特征，因此在臨床應(yīng)用前應(yīng)充分了解檢測技術(shù)的優(yōu)劣。臨床應(yīng)用時提倡采用多技術(shù)相結(jié)合的模式，取長補(bǔ)短，增強(qiáng)實用性，提高病毒的快速明確診斷和鑒別診斷的能力，發(fā)現(xiàn)疑似結(jié)果應(yīng)及時與臨床溝通。