濕潤燒傷膏對脂多糖致大鼠皮膚成纖維細胞損傷的改善作用及其機制研究

姜艷 鞏奇明 韋騁 陸飛燕 卓臣義 唐乾利

摘 要 目的：研究濕潤燒傷膏對脂多糖致大鼠皮膚成纖維細胞損傷的改善作用及其機制。方法：將大鼠皮膚成纖維細胞分為對照組、脂多糖組（5 μg/mL）、康復新液組（陽性對照，5 μg/mL脂多糖+1.25%康復新液）和濕潤燒傷膏組（5 μg/mL脂多糖+0.6 mg/mL濕潤燒傷膏），每組設置6個復孔。以脂多糖誘導建立炎性損傷細胞模型（對照組除外）。培養(yǎng)一定時間后，檢測各組細胞存活率和細胞遷移率，測定細胞上清液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）含量，檢測細胞內(nèi)IL-6蛋白定位和熒光強度，檢測細胞中同源性磷酸酶張力蛋白（PTEN）、磷酸化p65（p-p65）、TNF-α、IL-6、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt）蛋白的表達情況。結(jié)果：與對照組比較，脂多糖組細胞存活率顯著升高、遷移率顯著降低，細胞上清液中TNF-α、IL-6含量和PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6和PI3K蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.01），IL-6蛋白主要在細胞質(zhì)中表達且熒光強度增強。與脂多糖組比較，康復新液組和濕潤燒傷膏組細胞存活率均顯著降低、遷移率均顯著升高;TNF-α、IL-6含量和PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6（除康復新液組外）、PI3K、Akt（除康復新液組外）蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），IL-6蛋白熒光強度減弱，且濕潤燒傷膏組細胞中TNF-α、IL-6、PI3K、Akt蛋白的相對表達量均顯著低于康復新液組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：濕潤燒傷膏可抑制脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞增殖，降低炎性因子水平和炎癥反應強度，其機制可能與下調(diào)PTEN/核因子κB、PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 濕潤燒傷膏;皮膚成纖維細胞;炎癥反應;同源性磷酸酶張力蛋白/核因子κB;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0702-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effect and mechanism of MEBO on lipopolysaccharide （LPS）-induced injury of rat skin fibroblasts. METHODS： Skin fibroblasts of rats were divided into control group， LPS group （5 μg/mL）， Kangfuxin solution group （positive control， 5 μg/mL LPS+1.25% Kangfuxin solution） and MEBO group （5 μg/mL LPS+0.6 mg/mL MEBO）， with 6 wells in each group. Inflammatory injury cell model was induced by LPS （except for control group）. After a certain period of cultivation， the cell survival rate and cell migration rate were detected in each group. The contents of TNF-α and IL-6 in cell supernatant was detected. The localization and fluorescence intensity of IL-6 protein were detected. The protein expression of PTEN， p-p65， TNF-α， IL-6， PI3K and Akt in the fibroblasts were also determined. RESULTS： Compared with control group， survival rate of the fibroblasts was increased significantly in LPS group， while cell migration was decreased significantly; the contents of TNF-α and IL-6 in cell supernatant as well as relative protein expression of PTEN， p-p65， TNF-α， IL-6 and PI3K were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; IL-6 protein mainly expressed in the cytoplasm， and the fluorescence intensity was enhanced. Compared with LPS group， survival rate of the fibroblasts was decreased significantly in Kangfuxin solution group and MEBO group， while migration rate was increased significantly; the contents of TNF-α and IL-6， relative protein expression of PTEN， p-p65， TNF-α， IL-6 （except for Kangfuxin solution group）， PI3K and Akt （except for Kangfuxin solution group） were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while fluorescence intensity of IL-6 protein decreased; relative protein expression of TNF-α， IL-6， PI3K and Akt in MEBO group were significantly lower than Kangfuxin solution group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： MEBO can inhibit the proliferation of LPS-induced skin fibroblasts， reduce the level of inflammatory factors and the intensity of inflammatory reaction， which may be related to the down-regulation of PTEN/NF-κB，PI3K/Akt signaling pathway.

KEYWORDS? ?MEBO; Skin fibroblasts; Inflammation reaction; PTEN/NF-κB; PI3K/Akt

皮膚成纖維細胞是創(chuàng)面愈合修復的重要結(jié)構(gòu)細胞，其增殖、凋亡、遷移、炎癥反應均參與創(chuàng)面修復過程，并與毛細血管共同構(gòu)成肉芽組織結(jié)構(gòu)[1]。因此，調(diào)控該類細胞的生物學行為，對創(chuàng)面愈合具有重要意義。

濕潤燒傷膏適用于燒傷、慢性難愈合皮膚潰瘍等創(chuàng)面的修復，且臨床使用療效明顯[2]。已有研究證實，濕潤燒傷膏可明顯改善表皮生長細胞超微結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境、增強成纖維生長因子（bFGF）和血管生長因子（VEGF）的增殖分化能力，促進創(chuàng)面修復[3-4]。目前，關(guān)于濕潤燒傷膏的研究主要集中于在體創(chuàng)面愈合，有關(guān)其作用機制尚不十分明確。已有研究報道，抑制同源性磷酸酶張力蛋白（PTEN）的表達可增加內(nèi)皮細胞分裂和遷移，促進角膜內(nèi)皮傷口愈合[5]。核因子κB（NF-κB）是炎癥和氧化應激的生物標志物，參與創(chuàng)面愈合的炎癥反應及細胞增殖等活動[6]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路可調(diào)控細胞生長、增殖、能量代謝，并可改變細胞結(jié)構(gòu)[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，濕潤燒傷膏可促進大鼠成纖維細胞增殖[8]?；诖?，本研究通過構(gòu)建炎性損傷大鼠皮膚成纖維細胞模型，研究濕潤燒傷膏對模型細胞存活、遷移、炎性因子分泌情況的影響，并基于PTEN/NF-κB、PI3K/Akt信號通路初步研究其可能的作用機制，旨在為完善濕潤燒傷膏促創(chuàng)面愈合的分子機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括TriStar LB941型酶標儀（德國Berthold公司）、FV3000型激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）、PoverPac 3000型電泳儀（美國Bio-Rad公司）、Odyssey型雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

濕潤燒傷膏（批號Z20000004，每1 g相當于飲片0.21 g）購自汕頭市美寶制藥有限公司，康復新液（陽性對照，批號M190550，每瓶100 mL）購自湖南科倫制藥有限公司，CCK-8試劑（批號M4839）購自美國AbMole公司，胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基（批號25200-056、C11995500BT）均購自美國Gibco公司，胎牛血清（批號：ABS972）購自上海愛必信生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、無蛋白快速封閉液（5×）（批號ZJ101、PS108）均購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒（批號CSB-E04741m、E-EL-R0015C）均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，脂多糖（批號L2880，純度≥99%）購自美國Sigma公司，兔PTEN單克隆抗體、兔Akt多克隆抗體、兔PI3K單克隆抗體（批號ab32199、ab8805、ab180967）均購自美國Abcam公司，兔磷酸化p65（p-p65）多克隆抗體（批號3033s）購自美國CST公司，兔TNF-α多克隆抗體、兔IL-6多克隆抗體、大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、大鼠β-微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）Fluor 488結(jié)合多克隆二抗、山羊抗大鼠IgG（H+L）Fluor 647結(jié)合多克隆二抗（批號AF7014、DF6087、T0004、T0023、S0018、S0014）均購自美國Affinity公司，IRDye 800CW山羊抗兔二抗、IRDye 680RD山羊抗鼠二抗（批號925-32211、925-68070）均購自美國LI-COR公司，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料、抗熒光衰減封片劑、Triton X-100試劑和4%組織細胞固定液（批號C0065、S2100、T8200、P1110）均購自北京索萊寶科技有限公司，RIPA裂解液（強）（批號P0013B）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為超純水。

1.3 細胞

大鼠皮膚成纖維細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

取大鼠皮膚成纖維細胞適量，接種于完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。每2天更換1次新的完全培養(yǎng)基，待細胞生長至對數(shù)生長期（即融合度達80%～90%）時傳代。

2.2 藥液的制備

2.2.1 濕潤燒傷膏藥液 取濕潤燒傷膏適量，用無水乙醇-二甲基亞砜溶液（1 ∶ 1，V/V）溶解，制成質(zhì)量濃度為0.1 g/mL（以膏體質(zhì)量計）的溶液，于-4 ℃密封保存，使用時用完全培養(yǎng)基稀釋至0.6 mg/mL。

2.2.2 陽性對照藥液 將康復新液置于-4 ℃密封保存，使用時用完全培養(yǎng)基稀釋至1.25%。

2.3 細胞存活率檢測

采用CKK-8法進行檢測。取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，接種密度為5×103個/孔。培養(yǎng)24 h后，將其隨機分為對照組、脂多糖組（5 μg/mL[9]）、康復新液組（5 μg/mL脂多糖+1.25%康復新液[10]）和濕潤燒傷膏組（5 μg/mL脂多糖+0.6 mg/mL濕潤燒傷膏[8]），每組設置6個復孔，同時設置不含細胞的空白孔。對照組加入完全培養(yǎng)基，脂多糖組加入含5 μg/mL脂多糖的完全培養(yǎng)基，給藥組加入含5 μg/mL脂多糖和相應濃度藥液的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育1 h，使用酶標儀于450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（檢測組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）×100%。試驗重復3次。

2.4 細胞遷移率檢測

采用細胞劃痕試驗進行檢測。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，接種密度為1×105個/孔。培養(yǎng)48 h后，使用10 μL槍頭垂直于孔板劃痕，棄細胞上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2～7.4）清洗細胞1次后，按“2.3”項下方法分組（無需設置空白孔，下同）、給藥（僅此試驗使用含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)）。分別于培養(yǎng)0、24、48 h時拍照記錄細胞遷移情況并計算細胞遷移率：細胞遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-某時間點劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。試驗重復3次。

2.5 細胞上清液中TNF-α和IL-6含量檢測

采用ELSIA法進行檢測。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，接種密度為2×104個/孔，按“2.3”項下方法分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，取細胞上清液，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀測定細胞上清液中TNF-α和IL-6含量。試驗重復3次。

2.6 細胞內(nèi)IL-6蛋白定位和熒光強度檢測

采用免疫熒光法進行檢測。取對數(shù)生長期細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，接種密度為5×103個/皿，按“2.3”項下方法分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，棄上清液，細胞用PBS清洗5 min×3次，用0.4%多聚甲醛溶液固定30 min;細胞用PBS清洗5 min×3次，用0.1%Triton X-100試劑透化20 min;細胞用PBS清洗5 min×3次，用封閉液室溫封閉10 min，加入IL-6、β-tubulin一抗（稀釋度均為1 ∶ 200），于4 ℃下孵育過夜;細胞用PBS清洗5 min×3次，加入相應的IgG（H+L）標記二抗（稀釋度均為1 ∶ 200），室溫避光孵育40 min;細胞用PBS清洗5 min×3次（此步驟及后續(xù)步驟均需避光操作），用5 μg/mL的DAPI染料染色10 min，用PBS溶液清洗，滴加抗熒光衰減封片劑后封片，使用激光掃描共聚焦顯微鏡成像，觀察IL-6蛋白定位并記錄熒光強度。

2.7 細胞中PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6、PI3K、Akt蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取對數(shù)生長期細胞接種于培養(yǎng)皿中，接種密度為8×105個/皿，按“2.3”項下方法分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，棄上清液，細胞用4 ℃預冷PBS清洗2次，以RIPA裂解，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得細胞總蛋白。取上述總蛋白40 μg，煮沸5 min進行變性;取變性蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉10 min，分別加入PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6、PI3K、Akt、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 2 000），于4 ℃孵育過夜;PBST溶液洗膜5 min×3次，加入相應IRDye二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），室溫孵育40 min（此步驟及后續(xù)步驟均需避光操作），PBST溶液洗膜5 min×3次，于雙色紅外激光成像系統(tǒng)上成像。采用Image J 1.8.0軟件處理并分析，計算目標蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的灰度值比值，再以對照組為標準計算相對表達量。試驗重復3次。

2.8 統(tǒng)計學方法

利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 濕潤燒傷膏對脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞存活率的影響

與對照組比較，脂多糖組細胞存活率顯著升高（P<0.01）。與脂多糖組比較，康復新液組和濕潤燒傷膏組細胞存活率均顯著降低（P<0.01）;而康復新液組與濕潤燒傷膏組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見圖1。

3.2 濕潤燒傷膏對脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞遷移的影響

與對照組比較，脂多糖組細胞在作用24、48 h時的細胞遷移率均降低，其中48 h時細胞遷移率組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與脂多糖組比較，康復新液組和濕潤燒傷膏組作用24、48 h的細胞遷移率均增加，其中48 h時細胞遷移率組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;而康復新液組與濕潤燒傷膏組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見圖2、圖3（濕潤燒傷膏作用24 h對脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞遷移的影響圖略）。

3.3 濕潤燒傷膏對脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞上清液中TNF-α、IL-6含量的影響

與對照組比較，脂多糖組細胞上清液中TNF-α、IL-6含量均顯著升高（P<0.01）。與脂多糖組比較，康復新液組和濕潤燒傷膏組細胞上清液中TNF-α、IL-6含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;而康復新液組與濕潤燒傷膏組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表1。

3.4 濕潤燒傷膏對脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞內(nèi)IL-6蛋白定位和熒光強度的影響

IL-6主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達。脂多糖組細胞內(nèi)IL-6蛋白表達熒光強度高于對照組?？祻托乱航M和濕潤燒傷膏組細胞內(nèi)IL-6蛋白表達熒光強度低于脂多糖組，且康復新液組和濕潤燒傷膏組的熒光強度接近，詳見圖4[圖中，“IL-6”標記IL-6陽性表達細胞（綠色），“β-tubulin”標記細胞微管（紅色），“DAPI”標記細胞核（藍色），“Merge”為三者疊加]。

3.5 濕潤燒傷膏對脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞中PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6、PI3K、Akt蛋白表達的影響

與對照組比較，脂多糖組細胞中PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6、PI3K蛋白的相對表達量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與脂多糖組比較，康復新液組和濕潤燒傷膏組細胞中PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6（除康復新液組外）、PI3K、Akt（除康復新液組外）蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），其中濕潤燒傷膏組細胞中TNF-α、IL-6、PI3K、Akt蛋白的相對表達量均顯著低于康復新液組（P<0.05或P<0.01），詳見圖5、表2。

4 討論

創(chuàng)面愈合過程經(jīng)歷3個階段，包括炎癥期、增殖期和修復期。炎癥反應是創(chuàng)面進展中的主導因素，可以直接影響創(chuàng)面細胞增殖和創(chuàng)面重塑[1，11]。已研究證實，創(chuàng)面炎癥反應會影響成纖維細胞增殖、擾亂細胞活動、誘導促炎因子產(chǎn)生，進而延緩創(chuàng)面愈合[12-14]?，F(xiàn)多采用脂多糖刺激成纖維細胞，以建立體外增生性瘢痕成纖維細胞表型類似的細胞模型[15-16]。石珊等[17]研究證實，脂多糖可通過改變正常皮膚成纖維細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、影響細胞外基質(zhì)蛋白表達，從而導致成纖維細胞生物學功能改變，最終轉(zhuǎn)化成增生性疤痕。由此看來，調(diào)控脂多糖誘導的皮膚成纖維細胞生物學功能，對研究創(chuàng)面的進程具有重要意義。

濕潤燒傷膏和康復新液均為臨床創(chuàng)面康復的常用藥?？祻托乱褐饕煞质敲乐薮篌挂掖继崛∥?，可在炎癥期減輕患者局部炎癥反應，調(diào)節(jié)細胞增殖和分泌，減少滲出，促進創(chuàng)面愈合[18]。濕潤燒傷膏也是中藥制劑，包含黃連、黃柏、黃芩、地龍等藥材，被應用于各種慢性創(chuàng)面修復[19-20]。基于此，本研究以康復新液作為陽性對照藥物，研究濕潤燒傷膏對炎癥環(huán)境下成纖維細胞的影響，通過探討相關(guān)分子機制進一步完善濕潤燒傷膏愈合創(chuàng)面的可能機制，為其臨床使用提供理論依據(jù)。

PTEN是一種抑癌因子，具有雙特異性磷酸酶活性，可調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄、增殖和遷移等行為，參與了腫瘤、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展[21-24]。已有研究表明，PTEN受抑制可促進創(chuàng)面細胞遷移、加速創(chuàng)面的愈合[25]。脂多糖可誘導PTEN蛋白活化，激活NF-κB通路，進而引發(fā)“瀑布效應”樣炎癥反應，刺激細胞分泌TNF-α、IL-6等多種炎性因子[26]。另有研究表明，NF-κB參與了成纖維細胞的增殖[27]。TNF-α和IL-6都是NF-κB通路下游的重要調(diào)控因子，具有介導炎癥反應發(fā)生發(fā)展的生物學特性[7，28]。同時，IL-6亦能調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶信號通路以增加炎性因子的表達，在糖尿病足潰瘍模型大鼠創(chuàng)面組織中處于高表達水平[11，29]。本研究結(jié)果顯示，IL-6主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達。濕潤燒傷膏和康復新液均可通過抑制脂多糖過度激活的PTEN表達，抑制大鼠皮膚成纖維細胞增殖，降低TNF-α、IL-6、p-p65表達，從而改善炎癥反應，且濕潤燒傷膏組TNF-α和IL-6表達下降趨勢強于康復新液組。已有體內(nèi)實驗表明，創(chuàng)面愈合需要PI3K/Akt通路蛋白經(jīng)歷先升高后降低的動態(tài)變化過程[3]。由此可見，PI3K/Akt的長期過度激活并不利于創(chuàng)面愈合。筆者結(jié)合文獻[17]分析本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂多糖可促進大鼠皮膚成纖維細胞增殖，但這種增殖作用可被濕潤燒傷膏和康復新液所抑制，其分子機制可能抑制PI3K、Akt蛋白的表達有關(guān)，且濕潤燒傷膏組PI3K和Akt表達下降趨勢強于康復新液組。

綜上所述，濕潤燒傷膏可抑制脂多糖誘導的大鼠皮膚成纖維細胞增殖，降低炎性因子水平和炎癥反應強度，其機制可能與下調(diào)PTEN/NF-κB、PI3K/Akt信號通路有關(guān)。但創(chuàng)面愈合過程涉及多因素、多靶點相互作用，本文僅初步研究了濕潤燒傷膏促進創(chuàng)面愈合的一部分機制，且藥物劑量依賴性與作用時間依賴性等問題均有待深入研究。

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（收稿日期：2020-09-03 修回日期：2021-02-05）

（編輯：鄒麗娟）