生物制造高附加值乳糖衍生物的研究進展

夏洪志，李 娜，王晨浩，劉雅知，於 昊，徐 錚*

1. 南通勵成生物工程有限公司, 南通 226010;2. 南京工業(yè)大學 食品與輕工學院, 南京 211816

乳糖存在于人類和其他哺乳動物的乳汁中，是由D-半乳糖與D-葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵組成的還原型二糖，通常含有一分子結晶水(C12H22O11·H2O)，在牛奶中的質量比為4.5%～5.0%[1]。嬰幼兒通過小腸上皮細胞刷狀緣分泌的乳糖酶將其水解為單糖，并隨細胞主動轉運獲得吸收。D-葡萄糖為機體提供能量，而D-半乳糖以糖苷鍵結合于神經(jīng)酰胺上形成半乳糖腦苷脂參與大腦的發(fā)育。嬰兒期是神經(jīng)發(fā)育的關鍵期，因此乳糖對嬰兒期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關重要[2]。成年人消化乳糖的能力顯著下降，尤其是亞洲人缺乏乳糖酶普遍不能利用乳糖，所以食入乳糖后會造成脹氣、腹瀉、腹痛等癥狀[3]。這導致乳制品中通常需要去除乳糖，或將其水解為單糖來避免乳糖不耐受癥，例如舒化奶類產(chǎn)品[4]。乳糖主要用于制造嬰兒食品和配制藥物，譬如作為藥用輔料和填料，已廣泛應用于國際制藥行業(yè)，因此是乳糖增值的有效手段。2019年我國藥用乳糖產(chǎn)量就已增長至18 400噸[5]。除此以外，近年來利用生物工程技術將乳糖轉化為更高附加值的糖類產(chǎn)品也具有很大市場；例如乳果糖(lactulose)、巖藻糖基乳糖(fucosyllactose)、D-塔格糖(D-tagatose)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides)等(表1)。這些產(chǎn)品為大幅提升乳糖的商業(yè)附加值提供了可能，因而具有很大的發(fā)展?jié)摿?，下面就這幾種產(chǎn)品的研發(fā)進展予以綜述。

表1 高附加值乳糖衍生物

1 乳果糖的生物制備

乳果糖(Lactulose)是由D-半乳糖和D-果糖通過β-1,4-糖苷鍵構成的還原型二糖(分子式C12H22O11，分子量342.3)，甜度是乳糖的1.5倍[6]。乳果糖難以被人體消化吸收，因此經(jīng)過胃和小腸后可以到達結腸，被益生菌發(fā)酵為短鏈的有機酸并產(chǎn)生大量二氧化碳；從而顯著降低腸道pH并提高滲透壓，保留腸道水分起到軟化大便的作用，也可以中和肝代謝異常癥產(chǎn)生的血氨[7]。乳果糖的水溶性極好，因此能夠濃縮為糖漿，不易腐敗可作為非處方藥物(OTC)用于慢性便秘和肝性腦病的治療[8]。乳果糖一般是以乳糖為底物在強堿性條件下催化獲得的，常用催化劑包括氫氧化鈣(鈉、鉀)、硼鹽、鋁鹽等[9]。其中前者的轉化率低(～20%)且污染大；后者(硼/鋁鹽)轉化率高，但對人體有害而完全去除成本又很高[10]，這導致生產(chǎn)乳果糖的工藝成本居高不下，企業(yè)利潤率低。歐美國家是乳糖的主要生產(chǎn)國，因此歐美企業(yè)在原料購買上極具優(yōu)勢，乳果糖生產(chǎn)總成本較國內企業(yè)低因而長期壟斷了該產(chǎn)品。

近年來乳果糖的生物法研究獲得突破，使用纖維二糖差向異構酶(Cellobiose 2-epimerase，CE酶，EC 5.1.3.11)能夠直接催化乳糖獲得乳果糖且轉化率較高[11]。KIM和OH使用150 U/mL純化后的解糖熱解纖維素菌Caldicellulosiruptorsaccharolyticus來源CE酶(CSCE)，能夠在80 ℃、pH 7.5的條件下催化700 g/L乳糖獲得408 g/L乳果糖，轉化率58%，產(chǎn)率204 g/L·h；此外還生成了107 g/L的依匹乳糖，因此總計有74%的底物乳糖獲得了轉化[12]。由于乳糖溶解度較低，未轉化的乳糖可以通過濃縮結晶獲得回收得以進一步降低成本[13]。后續(xù)又發(fā)現(xiàn)Dictyoglomusturgidum、Dictyoglomusthermophilum、Caldicellulosiruptorobsidiansis等來源的CE酶適用于乳果糖的生物法制備[14](見表2)。常見的CE酶表達宿主為大腸桿菌，優(yōu)點是酶活高且發(fā)酵周期短，但存在易感染噬菌體、含內毒素等問題。目前已開發(fā)了多種食品級微生物宿主來表達CE酶，包括枯草芽孢桿菌和畢赤酵母菌。其中CE酶在枯草芽孢桿菌中的酶活為7.5 U/mL(胞內)或5.3 U/mL(胞外)，在畢赤酵母中的胞外分泌酶活為0.42 U/mL[15]。以上研究表明，生物法制備乳果糖技術已走向成熟，且轉化率和生產(chǎn)強度均不低于化學法，應用前景良好。

表2 已報道的CE酶酶學性質

2 巖藻糖基乳糖的生物制備

巖藻糖基乳糖(Fucosyllactose)是被L-巖藻糖(L-fucose)基修飾的乳糖三糖，是母乳中含量最高的寡糖，即人乳寡糖HMO的一種。常見的巖藻糖基乳糖如2′-巖藻糖基乳糖(2′-FL)和3-巖藻糖基乳糖(3-FL)[16]。2′-FL在HMO中含量最高，對新生兒具有很強的益生效果，能夠抑制腸道病原菌的生長并促進雙歧桿菌增殖[17]。由于牛、羊奶中均不含有HMO，因此由人工合成并將其添加到奶粉產(chǎn)品中具有迫切的需求[18]。2′-FL和3-FL都可以通過重組大腸桿菌進行生產(chǎn)，方法是強化胞內的GDP-L-巖藻糖合成途徑(包含基因manA、manB、manC、gmd、wcaG)，同時表達巖藻糖基轉移酶(基因fucT2或futA)。再將lacZ、wcaj、lon等不利于產(chǎn)物積累的基因敲除，即可獲得能夠代謝乳糖和葡萄糖(或甘油)合成巖藻糖基乳糖的基因工程菌株，其中2′-FL產(chǎn)量可達20.28 g/L、3-FL可達12.43 g/L[19]。此外，還可以通過外源添加L-巖藻糖的方式來合成巖藻糖基乳糖，在這種情況下產(chǎn)量會有較大幅度提高，例如2′-FL產(chǎn)量可達47 g/L[20](見表3)。構建這種代謝途徑則需要過表達fkp基因，從而直接將外源L-巖藻糖轉化為胞內的GDP-L-巖藻糖，進一步與乳糖縮合為2′-FL或3-FL[21]。然而，L-巖藻糖本身是稀缺的單糖，價格十分昂貴，因此外源添加L-巖藻糖目前看來尚不經(jīng)濟。此外，高密度發(fā)酵技術是獲取巖藻糖基乳糖高產(chǎn)的重要手段之一，這是因為巖藻糖基乳糖的合成量具有與菌株細胞干重(DCW)增長基本一致的特點[22]。除大腸桿菌外，枯草芽孢桿菌和酵母也被用于生物法制備2′-FL。其中解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)所得的最高產(chǎn)量可達到24 g/L，生產(chǎn)強度0.44 g/L·h[23]，具有較好的產(chǎn)業(yè)化前景。國際上能夠生產(chǎn)2′-FL的公司包括丹麥Glycom、德國Jennewein、美國Glycosyn LLC等[24]，國內尚沒有產(chǎn)業(yè)化報道。然而，生物工程技術制備HMO的工藝正獲得迅速發(fā)展，相信在我國將很快進入技術轉化階段。

表3 已報道的2′-FL生物制備技術

3 D-塔格糖的生物制備

糖尿病是我國極為高發(fā)的疾病，2013年的調查研究表明我國11%的成年人患有糖尿病，近36%的人處于糖尿病前期[25]。糖尿病與肥胖有著密切聯(lián)系，如何遏制肥胖成為預防糖尿病的關鍵問題。控制蔗糖或果葡糖漿的過度攝入能夠有效減少肥胖，因此必須開發(fā)代糖產(chǎn)品作為替代品來滿足人們的口感需求。D-塔格糖(D-tagatose)是一種優(yōu)秀的代糖，分子式C6H12O6、分子量180.16；甜度與蔗糖相當，但熱量僅為后者的39%(1.5 kcal/g)[26]。D-塔格糖無法被人體小腸吸收，到達結腸后能夠促進腸道益生菌的生長，起到了益生元的作用[27]。此外，D-塔格糖還可以控制血糖濃度并且不導致齲齒[28]。基于以上優(yōu)點，D-塔格糖已被我國批準為新食品原料(國家衛(wèi)計委2014年10號公告)[13]，國內企業(yè)如無錫甘泉醫(yī)藥科技有限公司等已完成D-塔格糖的生物法生產(chǎn)技術。D-塔格糖可以利用L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase，L-AI酶，EC 5.3.1.4)催化D-半乳糖獲得，而D-半乳糖通過乳糖酶水解乳糖獲得[29]。此類工藝方法已走向成熟，有較為豐富的文獻報道(總結為表4)；例如LIANG等人[30]利用固定化的Thermoanaerobactermathranii(TMAI)酶催化D-半乳糖獲得39.5%的轉化率，轉化液通過釀酒酵母L1菌株可以消耗掉剩余D-半乳糖，獲得純度為95%以上的D-塔格糖液。然而，由于乳糖至D-塔格糖的總轉化率較低，以上工藝的成本較高，這導致D-塔格糖的售價居高不下，限制了其大規(guī)模的應用推廣。最新研究表明，通過在釀酒酵母中構建微生物細胞工廠，能夠將乳糖直接發(fā)酵為D-塔格糖，減化了中間步驟[13]。伊利諾伊大學的LIU等人[31]在釀酒酵母中構建了此類代謝途徑，表達了纖維二糖轉運蛋白Cdt-1、β-葡萄糖苷酶Gh1-1、木糖還原酶XR、半乳糖醇-2-脫氫酶GDH；同時還敲除了D-半乳糖激酶編碼基因gal1以避免D-半乳糖的消耗。經(jīng)過300 h的發(fā)酵后，重組釀酒酵母將乳糖歷經(jīng)水解、D-半乳糖還原為D-半乳糖醇、D-半乳糖醇氧化為D-塔格糖等步驟實現(xiàn)了乳糖一步轉化為D-塔格糖。而乳糖水解產(chǎn)生的D-葡萄糖用于細胞生長，最終的發(fā)酵液中D-塔格糖含量為37.69 g/L，此外還有微量的D-半乳糖(含量為D-塔格糖的10%)。由于終產(chǎn)物中D-半乳糖占比較小，因此D-塔格糖的分離純化步驟較為簡單?？梢灶A見，微生物細胞工廠技術的使用實現(xiàn)了乳糖到D-塔格糖的一步轉化，并且副產(chǎn)物少、有利于產(chǎn)品分離結晶，具有很強的應用潛力。

表4 不同微生物來源L-AI酶的酶學性質比較

4 低聚半乳糖的生物制備

低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，簡稱GOS)是母乳中天然含有的益生元，現(xiàn)有臨床實驗數(shù)據(jù)表明，它能夠改善腸道菌群，強化雙歧桿菌繁殖、提升人體免疫力，還具有降低血脂、抗腫瘤和抗衰老的功效[32]。2018年全球GOS產(chǎn)值達到36.31億元，我國也達到2.42億元，呈現(xiàn)出逐年增長的良好態(tài)勢[33]。GOS的生物制備方法主要利用β-半乳糖苷酶的轉糖苷功能來催化乳糖獲得。例如李美玲等[34]利用Bacilluscirculans來源的β-半乳糖苷酶催化50 g/L乳糖，加酶量6 U/g，反應溫度60 ℃、pH 7.5；在該反應條件下GOS的產(chǎn)率為45.5%。PARK等[35]利用嗜熱型的Sulfolobus solfataricus來源β-半乳糖苷酶催化600 g/L乳糖，用酶量3.6 U/mL，反應溫度80 ℃、pH 6、反應時間56 h，終轉化率52.5%，GOS濃度315 g/L。酶法生產(chǎn)GOS工藝需要解決的瓶頸問題是轉化液成分復雜，包含沒有被酶轉化的D-葡萄糖、乳糖等雜質成分。這樣造成所生產(chǎn)的低聚半乳糖純度不高，因此必須通過下游分離技術來進行純化[36]。常見的分離方法為色譜分離法，馮詠梅等報道用Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱可將GOS純度提高到89.39%[37]。李良玉等[38]利用模擬移動床色譜系統(tǒng)和順序式模擬移動色譜進行GOS分離，進料折光度60%、系統(tǒng)柱溫60 ℃、最終獲得95.1%純度的GOS產(chǎn)品。綜上所述，GOS的生物技術制備工藝已日趨成熟，對乳品添加劑產(chǎn)業(yè)是一種重要的補充。

5 展望

乳糖作為乳制品行業(yè)常見的副產(chǎn)物，深加工渠道較少故需求量有限。直接廢棄又易造成水體污染等問題，通過生物酶法或微生物細胞工廠合成，可以將其高效轉化為高附加值產(chǎn)品。本文介紹的乳果糖、巖藻糖基乳糖、D-塔格糖、低聚半乳糖等分別用作非處方藥和食品添加劑類產(chǎn)品，具有廣闊的市場前景；對于乳糖資源的深加工利用是重要的技術補充，在技術路線上各產(chǎn)品都具有通用性。2014年僅美國的乳糖產(chǎn)量就達到52.6萬噸，隨著全球乳制品行業(yè)的不斷發(fā)展，乳糖產(chǎn)能逐年增長；相信對乳糖資源的挖掘利用能夠為乳品行業(yè)的產(chǎn)業(yè)升級提供新思路。