多肽配體R18促進(jìn)水稻弱勢籽粒灌漿的初步研究

張志興 陳 花 敏秀梅 許海龍 宋 果 林文雄,*

多肽配體R18促進(jìn)水稻弱勢籽粒灌漿的初步研究

張志興1,2陳 花1敏秀梅1許海龍1宋 果1林文雄1,2,*

1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建福州, 350002;2福建農(nóng)林大學(xué) / 福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州, 350002

14-3-3蛋白在植物生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用, 其亞型GF14f在水稻弱勢籽粒中高表達(dá)是其灌漿結(jié)實(shí)差的一個(gè)重要的原因。本研究首先通過分子對接的方式, 發(fā)現(xiàn)多肽R18與GF14f蛋白具有潛在的結(jié)合位點(diǎn), 進(jìn)而采用體外競爭性實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)R18能夠競爭性的與GF14f蛋白結(jié)合, 從而導(dǎo)致GF14f與SuS2、SS和AGPS三個(gè)互作靶蛋白間的結(jié)合力減弱, 與此同時(shí), 體外酶活實(shí)驗(yàn)表明, 外源添加R18能夠顯著提高淀粉合成酶(StSase)、蔗糖合成酶(SuSase)和ADPG焦磷酸化酶(AGPase) 3個(gè)酶的活性。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明, R18在水稻籽粒中除了能和GF14f結(jié)合外, 還能與GF14b、GF14c、GF14d及GF14e結(jié)合, BiFC結(jié)果也證實(shí)了上述結(jié)果。籽粒灌漿期, 外源噴施60 mg L–1濃度的R18于弱勢籽粒上, StSase、SuSase及AGPase酶活性顯著提高, 弱勢籽粒千粒重及結(jié)實(shí)率也顯著提高。本研究結(jié)果表明, 多肽配體R18能夠與14-3-3互作靶蛋白競爭性結(jié)合, 減弱14-3-3與靶蛋白間的結(jié)合力, 進(jìn)而釋放籽粒灌漿過程中蔗糖轉(zhuǎn)化及淀粉合成途徑中關(guān)鍵酶的活性, 從而有利于弱勢籽粒灌漿充實(shí)。

水稻; 弱勢籽粒; 灌漿; 14-3-3蛋白; 多肽配體

強(qiáng)弱勢籽粒灌漿差異現(xiàn)象已成為水稻科學(xué)和生產(chǎn)上長期未解決的難題[1], 特別是近些年來選育的水稻大穗型品種, 雖然其增產(chǎn)潛力大, 但弱勢籽粒灌漿差的問題更為突出[2]。楊建昌等[2]通過對12個(gè)超級水稻品種的觀察, 發(fā)現(xiàn)弱勢粒的結(jié)實(shí)率和千粒重分別比強(qiáng)勢粒低20.7%和7.2 g, 而3個(gè)普通高產(chǎn)品種弱勢粒的結(jié)實(shí)率和千粒重分別比強(qiáng)勢粒低6.3%和3.0 g, 可見, 若能有效的促進(jìn)弱勢籽粒的灌漿, 對激發(fā)水稻高產(chǎn)的潛力貢獻(xiàn)巨大。近些年來, 隨著各種高通量遺傳信息分析方法及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 為進(jìn)一步揭示水稻強(qiáng)弱勢籽粒灌漿差異提供了可能。Zhu等[3]、Sekhar等[4]和Sun等[5]所在的團(tuán)隊(duì)分別采用DNA芯片、SSH和RNA-seq技術(shù), 比較分析了強(qiáng)弱勢籽粒之間的基因表達(dá)差異, 鑒定到大量與弱勢籽粒灌漿差相關(guān)的基因。You等[6]發(fā)現(xiàn)移除穗頂端的強(qiáng)勢籽粒后, 底端的弱勢籽粒的大小、千粒重及結(jié)實(shí)率顯著得到提高, 并進(jìn)一步通過差異蛋白組學(xué)的技術(shù)分析了弱勢籽粒灌漿促進(jìn)的機(jī)制, 從中發(fā)現(xiàn)移除頂端強(qiáng)勢籽粒后的弱勢籽粒中14-3-3蛋白的表達(dá)量顯著下降。筆者通過對構(gòu)建的胚乳特異性轉(zhuǎn)基因水稻的研究發(fā)現(xiàn), 在灌漿期特異減少胚乳中14-3-3蛋白亞型GF14f的表達(dá), 能顯著促進(jìn)弱勢籽粒灌漿[7]。由此可見, 弱勢籽粒中14-3-3蛋白的表達(dá)量較高是導(dǎo)致其灌漿相對強(qiáng)勢籽粒差的一個(gè)重要的原因。因此, 如何充分利用這些已發(fā)現(xiàn)的灌漿關(guān)鍵(基因)蛋白, 達(dá)到改良弱勢籽粒灌漿的目的, 是下一步強(qiáng)弱勢籽粒灌漿研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。

眾所周知, 生物體通過復(fù)雜的蛋白–蛋白相互作用從而實(shí)現(xiàn)對生理過程中的多種生物功能, 如信號傳導(dǎo)、新陳代謝、抗逆響應(yīng)、細(xì)胞生長及細(xì)胞增殖等調(diào)控[8], 因此, 若能靶向擾動(dòng)生物體內(nèi)蛋白-蛋白的相互作用關(guān)系, 便可以實(shí)現(xiàn)對相關(guān)生理活動(dòng)的人為調(diào)控。已有研究表明, 植物中的大部分14-3-3蛋白作為調(diào)控因子, 通過蛋白互作調(diào)控其靶蛋白的活性, 在植株生長發(fā)育及其響應(yīng)逆境脅迫的過程中發(fā)揮著重要的功能[9-10]。擬南芥中的研究表明, 14-3-3蛋白能夠負(fù)調(diào)節(jié)植株的耐鹽性, 正常條件下, 14-3-3蛋白能夠與Ser-294位點(diǎn)磷酸化后的SOS2激酶結(jié)合, 進(jìn)而抑制SOS2激酶的活性, 而在鹽脅迫下, 14-3-3蛋白與SOS2激酶的結(jié)合力減弱, 釋放了SOS2激酶活性, 激發(fā)了與抗鹽相關(guān)的SOS1 Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)活性, 因此, 擬南芥14-3-3蛋白突變體材料與野生型相比表現(xiàn)出顯著的耐鹽表型[11]。筆者前期的研究表明, 14-3-3蛋白亞型GF14f能夠與籽粒灌漿過程中的SS、SUS2和AGPS蛋白結(jié)合, 從而抑制StSase、SuSase和AGPase的酶活性, 而特異性減少GF14f蛋白的表達(dá), 卻能夠釋放上述3個(gè)酶的活性[7]。據(jù)此, 筆者猜想若能夠在蛋白互作層面, 靶向改變14-3-3蛋白與其互作靶蛋白間的關(guān)系, 或許能夠?qū)崿F(xiàn)對14-3-3蛋白功能的人為調(diào)節(jié)。

近年來, 隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展, 多肽配體(peptide aptamers, PA, 又名肽適體)等人造小分子已成為直接影響蛋白質(zhì)功能的有效技術(shù)[12-13]。多肽配體是在惰性支架蛋白中展示肽環(huán)的短肽(8~20個(gè)氨基酸), 對給定靶蛋白具有高度特異性結(jié)合親和力, 并失活目標(biāo)蛋白質(zhì), 因此, 作為強(qiáng)競爭性抑制劑, 能特異性地阻斷蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形成, 在不改變蛋白質(zhì)水平或結(jié)構(gòu)的情況下干擾基因功能[12]。針對14-3-3蛋白的多肽配體篩選, 最早是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中開展的。Wang等[14]采用噬菌體展示隨機(jī)肽文庫技術(shù)篩選到14-3-3蛋白的高親和力多肽配體R18, 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)R18作為14-3-3的配體, 能有效阻斷14-3-3與生理學(xué)激酶Raf-1的結(jié)合, 并有效抑制14-3-3蛋白與磷酸化的Bad和ASK1 (凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1)以及未磷酸化的外酶S之間的相互作用, 起到類似干擾的效果。但目前針對植物14-3-3蛋白的靶向多肽配體的篩選未見報(bào)道?；?4-3-3蛋白在真核生物中的高度保守性, 筆者推測多肽配體R18或許能夠與水稻籽粒14-3-3蛋白特異性結(jié)合, 起到干擾14-3-3蛋白與其互作靶蛋白的作用, 進(jìn)而達(dá)到調(diào)控弱勢籽粒灌漿的目的, 但具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與處理方法

本研究所采用的供試材料為, 大穗型水稻品種‘金恢809’, 種植于福建農(nóng)林大學(xué)(福建省福州市)的校內(nèi)農(nóng)場, 3月15日播種, 采用旱育方式育秧, 4月15日移栽至大田, 每個(gè)處理各在田間種植3個(gè)小區(qū), 每個(gè)小區(qū)9 m2, 栽插密度為20 cm′20 cm, 單本栽插。在水稻抽穗開花初期, 在每個(gè)小區(qū)各選擇生長整齊一致、同日抽穗開花的主穗, 掛牌標(biāo)記, 連續(xù)掛牌3 d。選取同一天掛牌的稻穗, 花后7 d, 開始對稻穗的弱勢籽粒(穗的下半部)進(jìn)行涂抹處理, 處理分為實(shí)驗(yàn)組和對照組, 實(shí)驗(yàn)組: 用毛刷涂抹60 mg L–1R18溶液(含0.01% 吐溫-20, v/v), 每穗約1 mL; 對照組: 用毛刷涂抹水溶液(含0.01%吐溫-20, v/v), 每穗約1 mL; 每隔2 d刷一次, 共3次。在籽粒灌漿的前期(花后10 d)、中期(花后20 d)和后期(花后30 d) 3個(gè)時(shí)期, 選取掛牌標(biāo)記的弱勢籽粒, 液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中, 作為后期實(shí)驗(yàn)樣品。強(qiáng)弱勢籽粒劃分參照Ishimaru等[15]的方法。成熟期選取掛牌標(biāo)記的稻穗, 曬干后用于籽粒千粒重及結(jié)實(shí)率的測定。

1.2 分子虛擬對接分析

從NCBI上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載14-3-3蛋白亞型GF14f的氨基酸序列, 并采用protein BLAST工具對目標(biāo)序列進(jìn)行比對, 搜索同源性和得分較好的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)作為建模的模板, 并從Protein Data Bank中下載對應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu), 在Modeller 9.18環(huán)境下進(jìn)行手動(dòng)建模, 獲得GF14f空間結(jié)構(gòu)模型。通過已有文獻(xiàn)獲得R18氨基酸序列(PHCVPRDLSWLDLEANMCLPP)[9], 之后采用Protein-peptide分子對接程序CABS-dock (http:// biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSdock/)進(jìn)行GF14f蛋白與R18多肽docking, Pymol軟件用于分子對接結(jié)果分析。

1.3 R18多肽合成及多克隆抗體制備

依據(jù)R18多肽的氨基酸序列(PHCVPR-DLSWLDLEANMCLPP), 合成純度>95%的R18多肽粉末, 依據(jù)R18堿基序列(5'-CCCCACTGCGT-GCCCAGGGACCTGAGCTGGCTGGACCTGGAGGCCAACATGTGCCTGCCCCCC-3')合成R18堿基全長序列, 之后運(yùn)用SnapGene veiwer軟件選擇載體酶切位點(diǎn):RI、I, 構(gòu)建pet32a_His_R18融合表達(dá)載體, 所用引物序列見表1。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后, 采用鎳柱(Ni Sepharose 6 Fast Flow, 瑞典)純化His_R18融合表達(dá)蛋白, SDS-PAGE檢測后, 進(jìn)行兔子免疫, 4次注射后, 取血清, 親和純化并檢測, 獲得R18多克隆抗體。

1.4 蛋白體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(Pull-down)

筆者前期的研究已證實(shí)GF14f蛋白能與starch synthase (SS)、sucrose synthase 2 (SUS 2)和glucose-1-phosphate adenylyltransferase small subunit (AGPS)這3個(gè)亞基蛋白存在直接的互作關(guān)系[7], 故本研究選取上述3個(gè)互作靶蛋白進(jìn)行GF14f及R18之間的體外競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析。GST標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體pGEX-6P-1_GST_GF14f, His標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體pet32a_His_AGPS, pet32a_His_SS, pet32a_His_SUS2均為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。參考Zhang等[7]的方法, 進(jìn)行GST融合蛋白及His融合蛋白的純化。將純化好的GST標(biāo)簽蛋白用pull-down結(jié)合緩沖液孵育后, 加入純化后的His標(biāo)簽蛋白, 洗脫后, 利用商業(yè)化的His (Abmart, 中國上海)及GST (Abmart, 中國上海)抗體進(jìn)行Western-Blot檢測。

1.5 免疫共沉淀

選用外源涂抹R18的實(shí)驗(yàn)組和清水的對照組弱勢籽粒(花后20 d)各1 g, 參照Zhang等[16]的方法, 進(jìn)行籽粒非變性蛋白提取。分別在實(shí)驗(yàn)組及對照組的籽粒非變性蛋白中加入體積比0.5%的預(yù)洗protein G Agarose (PGS), 4℃孵育1 h后, 離心取上清, 加入體積比1%的R18多克隆抗體, 4℃孵育過夜, PBS緩沖液洗沉淀后, SDS-PAGE電泳檢測。所選蛋白條帶采用胰蛋白酶酶解后, 采用反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS對蛋白樣品進(jìn)行鑒定。液相色譜儀采用EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific, 美國), 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集使用Thermo Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀(Thermo Scientific, 美國)。質(zhì)譜產(chǎn)生的raw文件通過MaxQuant version 1.6.5 (http://www.maxquant.org/)進(jìn)行搜庫, 以RGAP (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下載的水稻蛋白序列為檢索比對數(shù)據(jù)庫。

1.6 BiFC實(shí)驗(yàn)

分別構(gòu)建YFPN-GF14b、YFPN-GF14f和YFPC-R18的BiFC載體, 引物序列見表1, 測序正確后分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105中, 加入到含有卡納霉素和利福平的的YEB液體培養(yǎng)基中, 28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)1~2 d后, 菌液PCR驗(yàn)證; 之后轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中至菌液OD值達(dá)到1.0后, 使用注射緩沖液(10 mmol L–1MES, 150 μmol L–1AS, 10 mmol L–1MgCl2)懸浮菌體, 1︰1注射到五葉期煙草葉片中, 使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8, 德國)觀察滲透1~2 d后的熒光發(fā)光情況。

1.7 酶活測定

稱取去除穎殼的籽粒樣品1 g, 加入5 mL預(yù)冷的酶活提取液(含100 mmol L–1Tricine-NaOH, pH 7.5, 8 mmol L–1MgCl2, 2 mmol L–1EDTA, 12.5% (v/v) Glycerol; 1% (w/v) PV P-40, 50 mmol L–12-mercap-toethanol), 置于預(yù)冷研缽中冰浴快速研磨, 4℃ 10,000轉(zhuǎn)min–1離心10 min, 取上清液為粗酶液備用。StSase、SuSase和AGPase酶活測定參照酶活測定試劑盒說明書(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司, www.cominbio.com)進(jìn)行。

1.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007整理數(shù)據(jù)和制作圖表, DPS V7.05軟件統(tǒng)計(jì)分析, 以LSD (<0.05)檢驗(yàn)平均數(shù)間的差異顯著性。

表1 引物序列及用途

2 結(jié)果與分析

2.1 GF14f蛋白與R18分子對接

采用CABS-dock程序?qū)F14f蛋白與多肽配體R18進(jìn)行分子柔性對接, 結(jié)果如圖1所示, R18經(jīng)對接后位于GF14f蛋白空間結(jié)構(gòu)結(jié)合口袋中, 配體與蛋白具有較好的匹配度(圖1-A), 配體R18與GF14f蛋白互作氫鍵分析表明, 多肽配體R18與GF14f蛋白中殘基R59 、R63、 N53、 E15 、N45、 D218 以及K217形成7個(gè)氫鍵(圖1-B), 說明R18多肽與GF14f蛋白有較高的親和力和結(jié)合穩(wěn)定性, 作為GF14f蛋白靶點(diǎn)抑制劑具有較好的潛力。

2.2 體外競爭性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證R18對14-3-3互作蛋白的影響

分別純化GST-GF14f、His-R18、His-SUS2、His-AGPs及His-SS的融合表達(dá)蛋白, 之后進(jìn)行體外pull-down實(shí)驗(yàn)。為探究R18干擾GF14f與其互作蛋白結(jié)合的臨界值, 本研究先以His-SUS2為例進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn), 結(jié)果如圖2-A所示, 在GST-GF14f和His-SUS2蛋白添加量一致的條件下, 隨著His-R18濃度的增加, His-SUS2的條帶逐漸變淺, R18的條帶逐漸加深, 當(dāng)His-R18的添加量達(dá)到60 mg L–1時(shí), His-SUS2的條帶完全消失, 證明R18完全干擾GF14f與其互作蛋白結(jié)合的臨界值為60 mg L–1(圖2-A), 基于此, 以臨界值60 mg L–1的His-R18添加量進(jìn)一步驗(yàn)證GST-GF14f與His-SS及His-AGPS蛋白的結(jié)合度, 圖2-B和C表明在His-R18濃度為60 mg L–1的條件下, 與陽性對照(未添加R18蛋白)對比, 用His抗體未檢測到His-AGPS和His-SS的條帶, 但能檢測到His-R18的條帶, 再一次證明R18能使GF14f與其互作蛋白的結(jié)合度降低, 甚至完全取代其互作蛋白與GF14f蛋白結(jié)合, 起到干擾GF14f蛋白功能的作用。

A: 隨著His-R18濃度的增加GST-GF14f與His-SUS2之間的結(jié)合力逐漸減弱; B: 60 mg L–1His-R18作用下GF14f與AGPS間的結(jié)合力顯著下降; C: 60 mg L–1His-R18作用下GF14f與SS間的結(jié)合力顯著下降。

A: theinteraction between GST-GF14f and His-SUS2 is gradually weakened with an increase in the concentration of His-R18; B: theinteraction between GST-GF14f and His-AGPS is weakened at 60 mg L–1of His-R18; C: theinteraction between GST-GF14f and His-SS is weakened at 60 mg L–1of His-R18.

2.3 體外競爭性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證R18對淀粉合成過程關(guān)鍵酶活性的作用

通過體外酶活實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證R18對淀粉合成過程中相關(guān)酶活的調(diào)控效應(yīng), 首先選用SuSase, 進(jìn)行濃度梯度分析。將籽粒粗酶液等分為6管, 同時(shí)加入10 μL磷酸酶抑制劑復(fù)合物, 10 μL ATP溶液, 之后其中一管不加任何試劑作為空白對照, 剩余5管依次加入不同劑量的R18多肽, 使提取液中R18的最終濃度分別為0、1、6、12和60 mg L–1, 結(jié)果如圖3-A所示, 與空白對照相比, 隨著R18濃度的升高, SuSase活性逐漸升高, 且在R18濃度達(dá)到60 mg L–1時(shí), 活性最高。在此基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步體外分析了60 mg L–1的R18對StSase及AGPase的酶活性的影響, 結(jié)果如圖3-B和C所示, 60 mg L–1的R18的添加濃度能夠顯著提高上述2個(gè)酶的活性。

A: 隨著R18濃度的增加蔗糖合成酶的活性逐漸提高。B: 60 mg L–1R18作用下ADPG焦磷酸化酶活性顯著提高。C: 60 mg L–1R18作用下淀粉合成酶活性顯著提高。

A: the enzyme activity of SuSase is gradually increased with an increase in the concentration of R18. B: the enzyme activity of AGPase is significantly increase at R18 concentrations of 60 mg L–1. C: the enzyme activity of StSase is significantly increase at R18 concentrations of 60 mg L–1.

2.4 免疫共沉淀分析R18與14-3-3蛋白家族間的互作

為了驗(yàn)證R18與水稻籽粒內(nèi)14-3-3蛋白不同亞型間的互作關(guān)系, 本研究選取外源涂抹R18實(shí)驗(yàn)組的弱勢籽粒, 以涂抹清水的弱勢籽粒樣品為對照, 采用免疫共沉淀技術(shù)分析R18與弱勢籽粒中14-3-3蛋白的結(jié)合情況。為判斷外源涂抹R18進(jìn)入水稻籽粒的情況, 選取灌漿中期(花后20 d)及后期(花后30 d)水稻弱勢籽粒, 去除穎殼后, 提取天然蛋白, 采用R18抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證(圖4), 表明用R18抗體檢測實(shí)驗(yàn)組弱勢籽粒在花后20 d和30 d中均有目的條帶, 而在對照組中未檢測到目的條帶, 證明外源涂抹R18確實(shí)能從穎殼進(jìn)入到籽粒的子房中, 且在灌漿中后期均存在于籽粒中。之后, 分別提取R18和清水涂抹后的花后20 d弱勢籽粒的非變性蛋白, 加入體積比0.5%的預(yù)洗PGS, 及體積比1%的R18多克隆抗體, 4℃孵育過夜, PBS緩沖液洗脫后, SDS-PAGE電泳檢測, 切膠, 胰蛋白酶酶解后, 采用LC-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索后, 將R18處理組與清水對照組的結(jié)果進(jìn)行比較分析, 篩選與R18結(jié)合的14-3-3蛋白亞型, 結(jié)果如表2所示, 共在水稻籽粒中鑒定到5個(gè)14-3-3蛋白亞型與R18存在互作, 分別為GF14b、GF14c、GF14d、GF14e和GF14f。

2.5 雙分子熒光互作實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證R18與14-3-3蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的相互作用

為了進(jìn)一步從植物細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證R18與水稻14-3-3蛋白亞型間的相互作用關(guān)系, 選取14-3-3蛋白2個(gè)亞型GF14b和GF14f, 進(jìn)行BiFC實(shí)驗(yàn)。分別構(gòu)建了YFPN-GF14b、YFPC-R18及YFPN-GF14f表達(dá)重組載體。將構(gòu)建好的載體以及空載體共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉肉細(xì)胞, 避光培養(yǎng)48 h后, 在515 nm黃色激發(fā)光、100×物鏡下激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光信號, 同時(shí)設(shè)置YFPN-GF14b-YFPC、YFPN-GF14f-YFPC、YFPC-R18-YFPN為陰性對照。結(jié)果(圖5)顯示, 在激光共聚焦顯微鏡下, YFPC-R18和YFPN-GF14b、YFPN-GF14f的煙草均檢測到黃色熒光信號, 而陰性對照不發(fā)光, 說明R18與GF14b和GF14f在植物細(xì)胞內(nèi)存在互作關(guān)系。

DAF: 開花后天數(shù); CBB: 考馬斯亮藍(lán)。DAF: days after flowering; CBB: coomassie brilliant blue.

表2 R18與水稻籽粒14-3-3蛋白亞型互作列表

A: R18與GF14b相互作用; B: R18與GF14f相互作用。

A: the interaction between R18 with GF14b; B: the interaction between R18 with GF14f.

2.6 籽粒灌漿期外源涂抹處理驗(yàn)證R18對弱勢籽粒灌漿的影響

通過外源涂抹的方法, 驗(yàn)證籽粒灌漿期外源導(dǎo)入R18對弱勢籽粒灌漿的影響。60 mg L–1的R18溶液涂抹后, 選取灌漿前(花后10 d)、中(花后20 d)和后(花后30 d) 3個(gè)時(shí)期實(shí)驗(yàn)組與對照組弱勢籽粒, 分別測定SuSase、StSase及AGPase的酶活性。由圖6可以看出,籽粒灌漿期外源涂抹R18后, 弱勢籽粒中上述3個(gè)淀粉合成關(guān)鍵酶的活性在整個(gè)灌漿時(shí)期均顯著高于對照組。之后, 在水稻成熟期選取實(shí)驗(yàn)組與對照組的弱勢籽粒, 比較兩者千粒重與結(jié)實(shí)率的變化情況, 結(jié)果如圖7所示, 涂抹R18后, 弱勢籽粒的千粒重和結(jié)實(shí)率都高于涂抹水的對照組, 且有顯著差異, 這進(jìn)一步證明R18對水稻弱勢籽粒灌漿有促進(jìn)作用。

A: 60 mg L–1R18溶液作用下ADPG焦磷酸化酶活性顯著提高; B: 60 mg L–1R18溶液作用下蔗糖合成酶活性顯著提高; C: 60 mg L–1R18溶液作用下淀粉合成酶活性顯著提高。不同小寫字母表示< 0.05差異顯著。

A: the enzyme activity of AGPase is significantly increase with the 60 mg L–1R18 solution; B: the enzyme activity of SuSase is significantly increase with the 60 mg L–1R18 solution; C: the enzyme activity of StSase is significantly increase with the 60 mg L–1R18 solution. Different lowercase letters indicate significant difference at< 0.05 among the treatments.

A: 弱勢籽粒千粒重變化; B: 弱勢籽粒結(jié)實(shí)率變化。不同小寫字母表示< 0.05差異顯著。

A: the change in the 1000-grain weight of rice inferior spikelets; B: the change in the seed setting rate of rice inferior spikelets. Different lowercase letters indicate significant difference at< 0.05 among the treatments.

3 討論

14-3-3蛋白家族在真核生物中是個(gè)高度保守的酸性蛋白家族。在人體細(xì)胞中14-3-3蛋白共有7個(gè)亞型, 涉及癌癥[17-18]和神經(jīng)系統(tǒng)[19]等多種疾病。因此, 14-3-3蛋白在醫(yī)學(xué)上已成為一個(gè)重要的潛在藥物治療靶點(diǎn)。通過噬菌體技術(shù)篩選獲得的14-3-3蛋白靶向多肽R18, 能模擬對接磷酸化的14-3-3配體蛋白, 并與14-3-3互作蛋白競爭相同的結(jié)合位點(diǎn), 從而發(fā)揮抑制效應(yīng)[9]。例如, 由2個(gè)R18序列組裝的特異抑制劑Difopein, 能夠競爭性的抑制腫瘤細(xì)胞中14-3-3蛋白與Bad的結(jié)合, 將Bad釋放出來, 使之與Bcl2結(jié)合, 從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。本研究在水稻中也發(fā)現(xiàn)R18能夠與籽粒中14-3-3蛋白亞型GF14f結(jié)合, 從而導(dǎo)致GF14f與其互作靶蛋白間的結(jié)合力減弱。此外, 本研究還發(fā)現(xiàn)R18除了能夠與籽粒胚乳中GF14f互作, 還與其他4個(gè)14-3-3蛋白亞型成員結(jié)合(GF14b、GF14c、GF14d和GF14e)。哺乳細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)R18能夠與14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)保守槽中的結(jié)合位點(diǎn)Lys-49及Val-176結(jié)合, 故R18能夠無亞型選擇性的與14-3-3蛋白特異結(jié)合[14], 這與本研究的結(jié)果是一致的, 說明R18能夠克服14-3-3蛋白亞型間遺傳功能冗余的難題, 同時(shí)擾動(dòng)14-3-3蛋白不同亞型與互作靶蛋白間的互作, 從而調(diào)控14-3-3蛋白的功能。筆者前期通過qRT-PCR的研究也發(fā)現(xiàn), 在強(qiáng)弱勢籽粒灌漿過程中, 除了GF14f外, 其余幾個(gè)14-3-3蛋白亞型也在強(qiáng)弱勢籽粒間存在著時(shí)空表達(dá)差異。據(jù)此, 筆者推測, 在籽粒中外源導(dǎo)入R18，或許能夠同時(shí)擾動(dòng)籽粒胚乳中14-3-3不同亞型蛋白, 從而達(dá)到調(diào)控弱勢籽粒灌漿的目的。

籽粒中蔗糖轉(zhuǎn)化及淀粉合成代謝途徑關(guān)鍵酶活性低或者基因表達(dá)量低, 被認(rèn)為是弱勢籽粒相對強(qiáng)勢籽粒灌漿結(jié)實(shí)差的一個(gè)重要的原因[3]。StSase、SuSase和 AGPase在弱勢籽粒中的活性顯著低于強(qiáng)勢籽粒[21-22]。筆者前期借助差異蛋白組學(xué)方法, 發(fā)現(xiàn)StSase、AGPase及SuSase的相關(guān)蛋白在弱勢籽粒中的表達(dá)顯著低于強(qiáng)勢籽粒[23]。通過蛋白互作的分析發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白亞型GF14f與上述部分蛋白成員(如SuS2、SS和AGPS)存在直接的互作關(guān)系, 進(jìn)一步借助RNAi轉(zhuǎn)基因材料發(fā)現(xiàn)特異減少GF14f蛋白在胚乳中的表達(dá)能夠顯著提高SuSase、AGPase及StSase酶的活性, 進(jìn)而促進(jìn)弱勢籽粒的淀粉合成[7]。然而, 上述方法是通過反向遺傳學(xué)的方法, 在RNA水平通過改變基因的表達(dá)量, 進(jìn)而降低籽粒胚乳中GF14f蛋白的表達(dá), 減少其與互作靶蛋白間的結(jié)合量, 從而實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)GF14f蛋白功能的目的。本研究發(fā)現(xiàn)外源多肽配體R18能夠在不改變GF14f蛋白表達(dá)量情況下, 競爭性的與GF14f蛋白結(jié)合, 通過改變GF14f蛋白與其互作靶蛋白間的結(jié)合力, 起到調(diào)節(jié)籽粒灌漿過程中GF14f蛋白功能的目的。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究表明, R18作為14-3-3的配體, 能有效阻斷14-3-3與生理學(xué)激酶Raf-1的結(jié)合, 并有效抑制14-3-3蛋白與磷酸化的Bad和ASK1 (凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1)以及未磷酸化的外酶S之間的相互作用[24], 從而達(dá)到調(diào)節(jié)酶活性的作用。本研究結(jié)果也表明, R18能夠靶向擾動(dòng)14-3-3蛋白亞型GF14f與SuS2、SS和AGPS蛋白間的結(jié)合, 進(jìn)而釋放SuSase、AGPase及StSase的酶活性, 起到促進(jìn)弱勢籽粒蔗糖轉(zhuǎn)化及淀粉合成的作用。Gong等[25]針對水稻外顯子結(jié)合體(EJC)的多肽配體研究也有類似的結(jié)果, 該團(tuán)隊(duì)針對EJC的核心 MAGO-Y14復(fù)合體, 獲得了一個(gè)16個(gè)氨基酸的特異性多肽配體PAP, 進(jìn)一步采用過表達(dá)的方法將PAP導(dǎo)入水稻中, 發(fā)現(xiàn)與MAGO和MAGO-Y14 RNAi干擾材料相比, PAP轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出相似或更加明顯的表型特征。由此可見, 多肽配體策略能夠通過擾動(dòng)蛋白間的互作, 進(jìn)而起到調(diào)節(jié)靶標(biāo)蛋白功能的目的, 可作為RNAi技術(shù)的一個(gè)重要的補(bǔ)充策略, 在作物功能蛋白的研究中起到重要的作用。

本研究通過在灌漿初期外源涂抹R18的方法, 發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的R18能夠有效的提高弱勢籽粒的千粒重和結(jié)實(shí)率。以往針對弱勢籽粒調(diào)控技術(shù)研究一般從水肥調(diào)控層面進(jìn)行探討[26], 例如適當(dāng)?shù)那暗笠剖┓始夹g(shù)[27], 灌漿期干濕交替的水分灌溉技術(shù)[28], 均能夠有效的促進(jìn)弱勢籽粒灌漿, 但傳統(tǒng)的水肥栽培管理措施主要是從水稻群體結(jié)構(gòu)層面進(jìn)行調(diào)控。近些年來, 大量與弱勢籽粒灌漿密切相關(guān)的關(guān)鍵基因及蛋白被鑒定到[3-5,29], 逐步揭示了水稻弱勢籽粒灌漿差的內(nèi)在機(jī)制, 為建立弱勢籽粒灌漿精準(zhǔn)調(diào)控技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)。本研究首次運(yùn)用多肽配體策略, 以籽粒灌漿關(guān)鍵的蛋白14-3-3蛋白為靶標(biāo), 篩選能夠靶向結(jié)合14-3-3蛋白的多肽配體R18, 在蛋白互作層面調(diào)控靶標(biāo)蛋白的功能, 從而實(shí)現(xiàn)對弱勢籽粒灌漿的精準(zhǔn)調(diào)控。筆者認(rèn)為, 本研究所采用的策略, 拓寬了作物栽培學(xué)研究的范疇, 證實(shí)了從分子層面探討作物精準(zhǔn)調(diào)控技術(shù)的可能性。接下來, 筆者將進(jìn)一步探討外源R18調(diào)控技術(shù)與水肥調(diào)控的有效結(jié)合, 從微觀和宏觀層面建立能精準(zhǔn)調(diào)控弱勢籽粒灌漿的分子生態(tài)栽培調(diào)控技術(shù)。

4 結(jié)論

多肽配體R18與水稻籽粒中14-3-3蛋白GF14f存在結(jié)合位點(diǎn), 且R18能夠無亞型選擇性的與籽粒14-3-3蛋白不同亞型結(jié)合。R18競爭性的與GF14f蛋白結(jié)合, 導(dǎo)致GF14f與靶蛋白SuS2、SS和AGPS間的結(jié)合力減弱, 進(jìn)而釋放了籽粒灌漿過程中SuSase、StSase和AGPase的酶活性。籽粒灌漿期噴施適當(dāng)濃度的R18能夠有效的促進(jìn)弱勢籽粒的灌漿。

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Preliminary study of the peptide aptamer R18 promotes grain filling of rice inferior spikelets

ZHANG Zhi-Xing1,2, CHEN Hua1, MIN Xiu-Mei1, XU Hai-Long1, SONG Guo1, and LIN Wen-Xiong1,2,*

1College of Life Sciences, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujiang, China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujiang, China

14-3-3 protein plays an important role in plant growth and development. The high expression abundant of 14-3-3 isoform (GF14f) was an important reason for the poor grain-filling of rice inferior spikelets. In the present study, firstly we used molecular docking to study the most possible binding sites between GF14f protein and peptide aptamer R18. Furthermore,competitive experiment showed that the R18 could block GF14f binding to its interaction proteins, in turn, lead to a weakened interaction of GF14f with the SuS2, SS, and AGPS. Meanwhile,enzymatic assays showed that exogenous added R18 significantly increased the activity of sucrose synthase (SuSase), adenosine diphosphate-glucose pyrophosphorylase (AGPase), and starch synthase (StSase). Coimmunoprecipitation (Co-IP) experiments revealed that, in addition to GF14f, R18 could interacted with the other 14-3-3 isoforms, such as GF14b, GF14c, GF14d, and GF14e, which were further confirmed by Bimolecular Fluorescent Complimentary (BiFC) assay. These results also showed that the exogenous application (60 mg L–1) of R18 at grain-filling stage could significantly increase the activity of StSase, SuSase, and AGPase, resulting in the improvement of 1000-grain weight and seed-setting rate of rice inferior spikelets. In the present study, R18 had been investigated to competitively interfere with the interaction of rice 14-3-3 protein with multiple client proteins, weak the binding force, which increased the activity of sucrose conversion and starch synthesis related enzyme, resulting in the improvement of grain filling of rice inferior spikelets.

rice; inferior spikelets; grain filling; 14-3-3 protein; peptide aptamer

10.3724/SP.J.1006.2021.02049

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31871542)和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0301105)資助。

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871542) and the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0301105).

林文雄, E-mail: wenxiong181@163.com

E-mail: zhangzhixingfz@163.com

2020-07-18;

2020-12-01;

2021-01-09.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210108.0908.002.html