第三代測(cè)序技術(shù)在遺傳性耳聾基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)的臨床應(yīng)用

王秋權(quán) 黃莎莎 袁永一 康東洋 吳婕 張昕 戴樸

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)學(xué)部，國(guó)家耳鼻咽喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，聾病防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100853）

拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)廣泛存在于人類基因組中，是遺傳變異的重要來(lái)源。其遺傳致病機(jī)制包括基因劑量效應(yīng)、位置效應(yīng)等多種分子機(jī)制[1-4]。已有研究表明，CNVs也是遺傳性耳聾的一個(gè)重要原因，占所有非綜合征性耳聾分子病因的五分之一[5-8]，已成為遺傳性耳聾分子診斷的主要檢測(cè)內(nèi)容之一。

過(guò)去研究人員提出的通過(guò)比較CNVs與標(biāo)準(zhǔn)參照基因之間相對(duì)值的檢測(cè)技術(shù)，如多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA），染色體微陣列分析技術(shù)（Chromosomal Microarray Analysis,CMA），下一代測(cè)序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS），盡管已經(jīng)大幅提高了基因組的研究能力，但在分析CNVs等大片段結(jié)構(gòu)性變異方面仍存在技術(shù)局限性。近年來(lái)出現(xiàn)的第三代測(cè)序技術(shù)(Third-Generation Sequencing，TGS)具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)，快速，實(shí)時(shí)，高通量的優(yōu)點(diǎn)，可以更直接有效準(zhǔn)確地檢測(cè)CNVs，確定CNVs片段長(zhǎng)度等參考數(shù)據(jù)，精確定位CNVs位置，找到確切斷點(diǎn)信息[9-11]。

本研究應(yīng)用基于納米孔（Nanopore）測(cè)序技術(shù)原理的TGS平臺(tái)對(duì)1例耳聾伴有耳蝸分隔不全I(xiàn)II型（Incomplete Partition type III，IP-III）的患者進(jìn)行全基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)并定位了一段位于Xq21.1（chrX:81079396-84457540）區(qū) 域 且 包 含POU3F4基因的半合子缺失變異，明確了該患兒遺傳性耳聾的分子病因，為進(jìn)一步遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

先證者為一個(gè)3歲男童，父母聽(tīng)力正常，非近親婚配，自然懷孕，足月生產(chǎn)，孕期正常。出生后雙耳聽(tīng)力篩查未通過(guò)。其父母提供相關(guān)病史，家族史等信息，對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)臨床評(píng)估，診斷性聽(tīng)力學(xué)檢查，包括穩(wěn)態(tài)聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位(Auditory Steady State Potential Response,ASSR)、雙側(cè)畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(Distortion Product Otoacoustic Emission,DPOAE)、聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值及潛伏期（Auditory Brainstem Response,ABR），及顳骨CT等。對(duì)患兒進(jìn)行全外顯子組測(cè)序后未檢測(cè)到與臨床表型相關(guān)的具有可能臨床意義的變異，僅通過(guò)XHMM CNV軟件預(yù)測(cè)到一段位于Xq21.1區(qū)域的半合子缺失變異,由于全外顯子組測(cè)序的局限性及軟件預(yù)測(cè)存在假陽(yáng)性，并不能直接輔助臨床診斷，因此我們對(duì)該患兒進(jìn)行了TGS測(cè)序。該研究得到中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：S2106-120-01）。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取及文庫(kù)制備

簽署知情同意書后，抽取先證者及父母外周血各2mL(EDTA抗凝)，采用Genomic DNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)并根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品基因組DNA抽提，所得DNA使用NanoDrop One UV-Vis spectrophotometer(Thermo,USA)檢測(cè)DNA純度。樣本質(zhì)檢合格后，使用BluePippin全自動(dòng)核酸回收儀(Sage Science,USA)將大片段進(jìn)行切膠回收，對(duì)DNA進(jìn)行損傷修復(fù)，純化后在DNA片段兩端進(jìn)行末端修復(fù)并進(jìn)行加“A”反應(yīng)，使用LSK109連接試劑盒(Oxford Nanopore Technologies,UK)中的接頭進(jìn)行連接反應(yīng)，最后用Qubit 3.0 Fluorometer(Invitrogen,USA)對(duì)建好的DNA文庫(kù)進(jìn)行精確定量檢測(cè)。

1.2.2 對(duì)先證者進(jìn)行Nanopore測(cè)序

建庫(kù)完成后將一定濃度和體積的DNA文庫(kù)加入到1個(gè)Flow cell中，并將Flow cell轉(zhuǎn)移到PromethION(Oxford Nanopore Technologies,UK)進(jìn)行實(shí)時(shí)納米孔單分子測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)Nanopore測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并進(jìn)行過(guò)濾。對(duì)獲取的數(shù)據(jù)用NGMLR-Sniffles流程進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)。用ANNOVAR進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異注釋。應(yīng)用1000 genome phase3、DGV gold standard CNV、dbVar nstd37和DESPICHER結(jié)構(gòu)變異注釋。根據(jù)疾病的表型調(diào)研OMIM、HPO和Clinvar等數(shù)據(jù)庫(kù)，閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，確定疾病相關(guān)基因。

1.2.4 結(jié)果驗(yàn)證

對(duì)患兒父母親分別進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證CNVs的準(zhǔn)確斷點(diǎn)位置信息。

2.資源配置是改革發(fā)展的基石。供給側(cè)改革就是對(duì)有限的資源配置進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而有高質(zhì)量的產(chǎn)出，繼續(xù)教育供給側(cè)改革的資源配置首先要有制度的保障?，F(xiàn)階段，各地政府陸續(xù)出臺(tái)了地方性的終身教育條例。在這些終身教育條例中，經(jīng)費(fèi)保障被寫入條例中來(lái)。比如廣東省的經(jīng)費(fèi)保障是常住人口每人每年不低于2元，上海市經(jīng)費(fèi)保障稍高些，達(dá)到了每人每年不低于5元的保障。有了必要的制度、經(jīng)費(fèi)、人員保障，繼續(xù)教育項(xiàng)目的開(kāi)發(fā)等要緊扣當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)的需求。比如，廣東省將先進(jìn)制造業(yè)等作為十大支柱產(chǎn)業(yè)，那么繼續(xù)教育就要統(tǒng)籌好有限的資源，圍繞這些支柱產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)教育資源，為當(dāng)?shù)厣鐣?huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供智力支持。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

先證者ASSR顯示雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性耳聾(圖1a)；雙耳鼓室導(dǎo)抗圖均為A型；雙側(cè)DPOAE在正常范圍內(nèi)均未引出；ABR閾值及潛伏期示雙耳分別給與click聲刺激，雙耳在90dB（nHL)下見(jiàn)V波分化，均未見(jiàn)CM波分化。

顳骨CT顯示雙側(cè)耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)與中轉(zhuǎn)融合，體積較小，蝸軸缺如，內(nèi)聽(tīng)道與耳蝸相通，雙側(cè)內(nèi)聽(tīng)道擴(kuò)大，按照Sennaroglu分類[12]，為 IP-III型，雙側(cè)前庭略擴(kuò)大，雙側(cè)面神經(jīng)管迷路段與鼓室段夾角增大(圖 1b)。

圖1 a.ASSR檢查示示雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性耳聾；b.顳骨CT示雙側(cè)內(nèi)耳畸形，蝸軸缺失并與內(nèi)聽(tīng)道相通，為耳蝸分隔不全I(xiàn)II型（IP-III）。Fig.1 a.ASSR examination showed bilateral severe sensorineural hearing loss;b.CT of the temporal bone showed bilateral inner ear malformation,cochlear axis missing and communicating with the internal auditory canal,which belonged to incomplete partition type III(IP-III).

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 生物信息學(xué)分析

檢測(cè)到先證者攜帶一段位于Xq21.1（chrX:81079396-84457540）區(qū)域的3.38Mb左右的半合子缺失變異，由于該變異缺失片段較長(zhǎng)，無(wú)法同時(shí)得到正常DNA片段和發(fā)生變異DNA片段，故分別在缺失變異后的融合位點(diǎn)兩側(cè)（chrX:81078896-81079395，chrX:84457541-844578，圖 2c中F-R引物）和斷點(diǎn)兩側(cè)（chrX:84457254-84458046,圖2c中f-r引物）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該家系樣品后進(jìn)行瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)。瓊脂糖電泳顯示患兒只擴(kuò)增出突變型序列條帶，其父親只擴(kuò)增出野生型序列條帶，其受檢者母親既擴(kuò)增出突變型序列條帶也擴(kuò)增出野生型序列條帶(圖2d)。一代驗(yàn)證結(jié)果表明該缺失變異來(lái)自于患兒母親(圖2e)。

圖2 a.家系圖譜；b.Nanopore測(cè)序結(jié)果顯示先證者攜帶一段位于Xq21.1（chrX:81079396-84457540）區(qū)域的3.38Mb左右缺失變異；c.缺失變異后的融合位點(diǎn)兩側(cè)和斷點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物；d.瓊脂糖電泳顯示受檢者只擴(kuò)增出突變型序列條帶，其父親只擴(kuò)增出野生型序列條帶，其母親既擴(kuò)增出突變型序列條帶也擴(kuò)增出野生型序列條帶；e.Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明該缺失變異來(lái)自于母親。Fig.2 a.The pedigre;b.Nanopore sequencing results showed that the proband carry a 3.38 Mb deletion variant in theXq21.1(chrX:81079396-84457540);c.Primers were designed on both sides of fusion site and breakpoints after deletion of mutation;d.Agarose electrophoresis showed that the proband amplified only mutant sequence bands,father amplified only wild-type sequence bands,and mother amplified both mutant and wild-type sequence bands;e.Sanger sequencing validation results indicated that the deletion variant was derived from the mother.

2.2.2 致病性分析

該缺失變異覆蓋了 APOOL、CYLC1、HDX、POU3F4、RPS6KA6、SATL1基因。除SATL1基因未被收錄，APOOL、CYLC1、HDX、RPS6KA6基因在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄相關(guān)疾病，因此排除上述基因致病性。此外，并未發(fā)現(xiàn)其他致病性單核苷酸變異。

該段缺失CNVs覆蓋的POU3F4基因(OMIM:#300039)在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中明確記錄為X-連鎖耳聾2型(OMIM:#304400；DFNX2）的致病基因，該變異使POU3F4基因編碼序列完全缺失，影響編碼蛋白正常功能（PVS1）。通過(guò)查詢DGV數(shù)據(jù)庫(kù)和gnomADSVs數(shù)據(jù)庫(kù)中均未見(jiàn)該變異的收錄（PM2）。但在DESPICHER、ISCA及ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)中均有覆蓋該變異區(qū)段或大部分重疊的缺失變異，并被定義為致病性或疑似致病性變異，相關(guān)臨床表型均有聽(tīng)力障礙（PM3）?；诟改赣H驗(yàn)證結(jié)果及以上證據(jù)，根據(jù)ACMG指南[13]，判定該變異為致病性變異（PVS1+PM2+PM3），POU3F4基因?yàn)橹虏』颉?/p>

3 討論

在多個(gè)耳聾患者中通過(guò)NGS等測(cè)序技術(shù)檢出僅包含POU3F4基因全部序列的缺失變異，均位于本研究檢測(cè)到的變異區(qū)間范圍內(nèi)，且本患者的臨床特征與其中報(bào)道的耳聾男性患者表型一致[19-23]。該變異導(dǎo)致POU3F4基因序列全部丟失，使功能性POU3F4蛋白缺乏，從而破壞中耳和內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育，導(dǎo)致聽(tīng)力障礙。

此外，也有多例Xq21區(qū)域的大片段缺失使POU3F4基因與相鄰基因組成綜合征型聽(tīng)力障礙的報(bào)道，具體表型取決于其CNVs大小和致病基因含量，主要為DFNX2、注意力缺陷、智力障礙和脈絡(luò)膜出血等[24-28]。盡管本研究病例的缺失范圍也覆蓋其他基因，但該患者并未出現(xiàn)其他特殊的表型，且覆蓋的其他基因目前并無(wú)明確的致病性證據(jù)，因此排除該患者為綜合征型聽(tīng)力障礙。然而，并不能排除其他基因編碼的蛋白質(zhì)與已知致病基因可能存在相互作用，并產(chǎn)生與觀察到的表型相關(guān)的功能變化，這需要我們進(jìn)一步通過(guò)全基因組分析來(lái)鑒定。

POU3F4基因位于X染色體上的基因沙漠中，該區(qū)域并未覆蓋有許多重要功能基因，且富含高度保守的非編碼區(qū)，這可能導(dǎo)致POU3F4基因或相應(yīng)區(qū)域較頻繁發(fā)生CNVs[29]。而要闡明POU3F4基因CNVs發(fā)生的確切機(jī)制，需進(jìn)一步對(duì)CNVs斷點(diǎn)周圍重復(fù)序列等分析，因此，斷點(diǎn)的精確定位對(duì)探索POU3F4基因CNVs的發(fā)生機(jī)制并評(píng)估其功能影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)于CNVs斷點(diǎn)的精確定位均有一定的局限性，需面對(duì)如斷點(diǎn)所在區(qū)域富含復(fù)雜重復(fù)元件，高GC率或存在假基因、測(cè)序讀長(zhǎng)短，不能準(zhǔn)確映射回正確基因組位置等問(wèn)題[30,31]。本研究應(yīng)用的Oxford Nanopor平臺(tái)是一種基于納米孔測(cè)序的第三代單分子基因測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)不僅具有高通量特點(diǎn)，同時(shí)可以得到CNVs兩端序列，即使斷點(diǎn)出現(xiàn)在高度重復(fù)和復(fù)雜區(qū)域中，也可進(jìn)行更精確的映射與基因組比較；而該技術(shù)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)短讀長(zhǎng)的諸多局限，使獲得更大無(wú)間隙的全長(zhǎng)基因組并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)序列分析成為可能[32,33]。

明確先證者CNVs致病性可對(duì)先證者母親再次妊娠前準(zhǔn)確的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供有力支持。本研究中先證者母親再次妊娠，在孕19周通過(guò)采集羊水檢查與超聲檢查對(duì)胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前診斷及性別鑒定，結(jié)果顯示胎兒性別為女性，其攜帶該片段的雜合變異。對(duì)于X連鎖隱性遺傳疾病來(lái)說(shuō)，單個(gè)致病性變異的女性攜帶者并不會(huì)發(fā)展為患者，只有當(dāng)男性基因型為半合子，女性基因型為純合子或攜帶復(fù)合雜合致病性變異（如反式）時(shí)才會(huì)導(dǎo)致耳聾的發(fā)生。因此，胎兒同其母親一樣均為該缺失變異的攜帶者，并不會(huì)重復(fù)其哥哥的表型。出生后經(jīng)隨訪，該女嬰聽(tīng)力正常。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)TGS檢測(cè)及Sanger測(cè)序驗(yàn)證的方法明確了一名伴有內(nèi)耳畸形的遺傳性耳聾患者的分子病因，并對(duì)先證者母親再次妊娠胎兒進(jìn)行了遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。本研究證明TGS用于遺傳性耳聾基因中CNVs的臨床應(yīng)用是可行的，但仍面臨著諸多問(wèn)題，如單讀長(zhǎng)的錯(cuò)誤率偏高，需重復(fù)測(cè)序以糾錯(cuò)；生物信息學(xué)分析軟件不夠豐富、數(shù)據(jù)積累少；價(jià)格成本高等，其有效性和準(zhǔn)確度仍需大量數(shù)據(jù)的評(píng)估和驗(yàn)證。