瓊脂糖明膠在組織脫水前預(yù)包埋中的應(yīng)用

時(shí)維平，史海磊，付廣明，趙樹超，戚慧陽，付海洋

優(yōu)質(zhì)的HE切片是病理診斷的前提條件，在病理工作中占據(jù)重要地位[1]。HE染色與諸多環(huán)節(jié)有關(guān)，組織包埋質(zhì)量是其中重要的一環(huán)，正確的組織包埋是HE制片及診斷的基礎(chǔ)[2]。在日常工作中，雖然大部分組織均能被正確包埋，但仍會遇到一些問題，如細(xì)小、零碎的標(biāo)本使用紗布或脫水紙進(jìn)行包裹，脫水后易黏附在紗布或脫水紙上，包埋時(shí)無法進(jìn)行完整剝離，造成人為標(biāo)本丟失；特殊標(biāo)本如內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection, ESD)等脫水后需查找正確的包埋面，否則會出現(xiàn)診斷失誤；取材時(shí)某些組織與腫瘤或息肉粘連不緊密，脫水后易發(fā)生剝離或斷裂的現(xiàn)象，對診斷工作造成一定影響[3]。本科室經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用瓊脂糖明膠在脫水前對組織標(biāo)本進(jìn)行預(yù)包埋，脫水后不影響組織原固有形態(tài)，包埋省時(shí)、省力，對HE及免疫組化無影響，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集日常工作中息肉或腫瘤與組織粘連處較小的標(biāo)本，如腫瘤與周圍組織粘連處較小、膽囊息肉等標(biāo)本，以及ESD標(biāo)本、婦科刮宮、腦科手術(shù)室等細(xì)小零碎的標(biāo)本。

1.2 儀器櫻花VP1脫水機(jī)，Leica切片機(jī)，Roche HE 600單獨(dú)滴染染色機(jī)，DAKO全自動(dòng)免疫組化機(jī)Link 48，冰箱，一次性藥碗，電熱恒溫箱，水浴箱。

1.3 試劑瓊脂糖購自上海藍(lán)季公司，明膠購自國藥集團(tuán)，HE染色試劑為Roche HE 600染色套裝，CKpan一抗購自DAKO公司。

1.4 方法(1)配制瓊脂糖明膠：0.5 g瓊脂糖加入100 mL蒸餾水中，加熱至完全融化后放入60 ℃恒溫箱中備用。1 g明膠加入100 mL蒸餾水，加熱至完全融化后放入60 ℃恒溫箱中備用。使用時(shí)將兩者按1 ∶1進(jìn)行混勻。(2)取材：先將一部分凝膠倒入一次性藥碗中，稍冷卻，然后放入組織定型，再倒入瓊脂糖明膠完全包被組織，置于冰箱中冷藏，1～2 min后瓊脂糖明膠冷卻成形，取出后進(jìn)行修整，使其大小及厚度與包埋盒一致(圖1)。(3)包埋：組織脫水，透明，浸蠟。(4)HE染色：石蠟切片3 μm厚，65 ℃烘烤切片15 min，使用Roche HE 600染色機(jī)染色，染色模式設(shè)置為H2A2E4。(5)免疫組化染色：石蠟切片3 μm厚，65 ℃烘烤切片60 min，脫蠟水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，上機(jī)前打開試劑蓋檢查試劑是否充足，采用免疫組化EnVision法染色。

圖1 組織使用瓊脂糖-明膠進(jìn)行預(yù)包埋：A.細(xì)小破碎的腦組織標(biāo)本；B.肝腫瘤與周圍組織粘連的標(biāo)本；C.胃組織的特定切緣面標(biāo)本；D.胃鏡ESD標(biāo)本

2 結(jié)果

本組經(jīng)瓊脂糖明膠包裹的組織，脫水良好，組織原固有狀態(tài)保持完好，未發(fā)現(xiàn)剝離或斷裂現(xiàn)象。細(xì)小破碎的腦組織等標(biāo)本，無需使用易黏附標(biāo)本的紗布等包裹，包埋時(shí)也不會發(fā)生遺失現(xiàn)象，充分保證了組織的完整性。ESD或特定切緣面等標(biāo)本進(jìn)行包裹后，不會在脫水盒中發(fā)生位置偏移(圖2)，包埋時(shí)無需費(fèi)時(shí)費(fèi)力查找特定包埋面，組織-瓊脂糖明膠塊方便易取，可直接放入包埋底模中，省時(shí)、省力。經(jīng)HE及免疫組化染色，組織形態(tài)保持完好，染色效果佳(圖3、4)。

②③④

3 討論

在日常工作中，經(jīng)常遇到組織脫水后破裂或損傷的現(xiàn)象，包埋時(shí)遺失、組織包埋面不易確認(rèn)等現(xiàn)象為后續(xù)的制片及診斷埋下隱患。楊洋等[4]報(bào)道的斜面包埋手法用于解決ESD組織包埋面的問題，其對包埋技巧及速度有一定的要求；曾曉蓓等[5]報(bào)道使用瓊脂作為細(xì)胞蠟塊的凝膠劑，本組將其應(yīng)用于組織預(yù)包埋中，發(fā)現(xiàn)效果不理想，主要原因是瓊脂濃度太高、融化需要較長時(shí)間，太低凝形不成功，且濃度高低均對后續(xù)脫水有影響，不方便操作。

本實(shí)驗(yàn)使用的瓊脂糖明膠較好的解決了上述問題。瓊脂糖與瓊脂相比，其結(jié)構(gòu)和成分更單一，且生物安全性已得到廣泛證實(shí)[6]，其凝膠后具有一定的力學(xué)性能，如硬度、粘彈性等；而明膠作為一種凝膠劑，具有更低的液化點(diǎn)和凝固點(diǎn)。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，兩者單獨(dú)使用效果不佳，配合使用效果較好，一方面為了降低各自的濃度，達(dá)到降低融點(diǎn)、提高融化速度的目的，另一方面兩者配合增加凝固后的硬度，方便后續(xù)操作。經(jīng)過瓊脂糖明膠預(yù)包埋的組織，既維持組織原始固有形態(tài)，又避免了組織在脫水包埋過程中的損傷或損失。對于息肉等細(xì)小的粘連性標(biāo)本，可以維持其與組織的原始位置，不會發(fā)生剝離的現(xiàn)象；臨床送檢的細(xì)小零碎標(biāo)本不會再出現(xiàn)粘連在紗布或脫水紙上，保證了取材標(biāo)本的完整性；對于其他標(biāo)本則節(jié)省了時(shí)間，提高了工作效率。我們對細(xì)胞蠟塊反復(fù)進(jìn)行瓊脂糖明膠包埋實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其效果較好。另外，在對組織進(jìn)行預(yù)包埋時(shí)，可以使用冰袋促使其凝固，便于組織在凝膠中定型。

瓊脂糖明膠在整個(gè)過程中僅僅起支撐作用，與細(xì)胞蠟塊的混合離心不同，未滲透至組織內(nèi)部中，對HE、免疫組化及分子檢測等無影響。在使用瓊脂糖明膠對組織進(jìn)行預(yù)包埋需要注意以下問題：(1)使用前進(jìn)行瓊脂糖和明膠的混合，降低了融點(diǎn)，節(jié)約了時(shí)間；(2)組織固定后、脫水前進(jìn)行預(yù)包埋，然后直接進(jìn)入脫水程序，避免組織固定不佳或瓊脂糖明膠吸水膨脹導(dǎo)致脫水失??；(3)瓊脂糖明膠包埋完成后進(jìn)行適當(dāng)修整，以免無法放入脫水盒中。