潰瘍性結(jié)腸炎患者及其配偶的腸道菌群構(gòu)成與多樣性分析

吳佳倩 馬芳笑 吳佩 鐘繼紅 劉英超*

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）主要是以累及直腸和結(jié)腸的慢性非特異性炎癥性腸病。研究表明，UC在歐洲的發(fā)病率已達(dá)0.97～57.9/10萬人，亞洲和中東近幾年發(fā)病率快速上升，達(dá)0.15～6.5/10萬人［1-2］。目前認(rèn)為UC是免疫、遺傳、環(huán)境及腸道菌群等多因素共同作用的結(jié)果。研究表明，某些腸道菌群釋放大量毒素?fù)p傷黏膜，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并刺激細(xì)胞炎癥因子釋放，引起腸道黏膜炎癥反應(yīng)［3-4］。此外，外界環(huán)境同樣是引起UC發(fā)病的因素之一［5］。本文比較UC患者與其同一生活環(huán)境下患者家屬，以及與正常體檢人群腸道菌群的差異性，探討生活環(huán)境與腸道菌群環(huán)境間的相關(guān)性在UC發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至7月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院UC患者8例（UC組）及其配偶8例（UF組），同時招募本院體檢健康者8例（ZC組）。本項目經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～60歲，性別不限；②根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、腸鏡及病理結(jié)果，參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年）》［6］的UC診斷標(biāo)準(zhǔn)，由消化內(nèi)科及病理科醫(yī)師共同確診為UC。③UC配偶組需與UC患者共同生活至少5年、無全身系統(tǒng)性疾病且腸鏡檢查正常；④健康人群組需與UC患者無血緣關(guān)系且不在同一家庭環(huán)境下生活；⑤健康人群組無全身系統(tǒng)性疾病且腸鏡檢查未見腸道病變；⑥所有入選者均簽署知情同意書。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①重度或急性暴發(fā)型UC患者；②近2個月內(nèi)使用抗生素、益生菌制劑及清潔灌腸者；③既往有消化道疾病手術(shù)史；④妊娠及哺乳期女性、兒童及精神病患者；⑤患有嚴(yán)重心、腦、肺、肝、腎疾病或高血壓、心臟病、糖尿病等慢性疾病。

1.2 方法 （1）糞便樣本采集：采集所有入選者自然排出的新鮮糞便（＞2 g），迅速將糞便裝于無菌樣品管中，樣品管冰浴1 h內(nèi)運送至中心實驗室無菌條件下進(jìn)行分裝，液氮冷卻后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。（2）樣本DNA提取、基因組PCR擴增及16S rRNA測序：應(yīng)用QIAamp DNA Stool Extraction Kit試劑盒從糞便樣本中提取腸道微生物基因組DNA后，使用引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）［7］對細(xì)菌16S rRNA基因的V3-4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴增［7］。擴增條件為95℃解鏈3 min，95℃30 s，55℃，30 s，72℃45 s，25個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢并純化。利用Nextera XT Index Kit中的引物在待測DNA的兩端接入adaptor序列，用于后續(xù)MiSeq上機測序。（3）測序數(shù)據(jù)分析：剔除原始序列中不含引物、長度在300～480 bp以外、質(zhì)量評分≤20、含有模糊堿基N及嵌合體的序列，得到最終用于分析的優(yōu)質(zhì)序列。將相似度在97%的優(yōu)質(zhì)序列聚類為一個操作分類單元（OTU），并用SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物學(xué)鑒定。最終得到所有OTU表，采用Qiime 軟件進(jìn)行多樣性指數(shù)分析、主成分分析及菌落組成分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，采用Kruskal-wallis H檢驗。計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組基線資料比較 見表1。

表1 三組基線資料比較（±s）

表1 三組基線資料比較（±s）

組別 n 年齡（歲） 男/女（n） BMI（kg/m2）ZC組 8 36.00±7.31 4/4 20.70±1.99 UC組 8 43.38±11.75 4/4 21.09±0.68 UF組 8 41.89±18.39 4/4 21.11±1.32

2.2 腸道菌群物種多樣性分析 物種多樣性分析采用Alpha多樣性指標(biāo)，Alpha多樣性是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。豐富度即種類數(shù)目；多樣性即群落中個體分配上的均勻性。本研究中群落豐富度的指數(shù)以Chao1指數(shù)表示。群落多樣性的指數(shù)以Shannon指數(shù)表示。（1）Chao1指數(shù)：每條曲線代表一個樣本，末端數(shù)字為實際測序條數(shù)。Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。測序序列從15,000起曲線趨于平坦，表明此時測序已趨于飽和，測序數(shù)據(jù)量合理。三組間Chao1指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。（2）Shannon指數(shù)：每條曲線代表一個樣本，末端數(shù)字為實際測序條數(shù)。Shannon指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。測序序列曲線較早趨于平坦，表明此時測序已趨于飽和，測序數(shù)據(jù)量合理。三組間Shannon指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖1 Chao1指數(shù)曲線

圖2 Shannon指數(shù)曲線

2.3 腸道菌群門分類水平分析 所有樣本共檢出18個細(xì)菌門（見圖3）。其中，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）以及放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度依次遞減，且總量占所有菌群數(shù)量的99.9%。與UC組比較，ZC組及UF組中厚壁菌門與梭桿菌門的相對豐度平均值均增加，厚壁菌門分別增加5.73%和3.74%，梭桿菌門分別增加1.06%和6.09%；而擬桿菌門的相對豐度均值分別減少2.83%和10.87%。與ZC組比較，UC組及UF組中變形菌門的相對豐度均值分別增加2.77%和3.28%；放線菌門分別增加1.21%和1.62%。三組樣本間腸道菌群的相對豐度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 門分類水平上三組樣本腸道菌群的相對豐度

表2 三組腸道菌群門水平的相對豐度比較［%，（±s）］

表2 三組腸道菌群門水平的相對豐度比較［%，（±s）］

組別 厚壁菌門 擬桿菌門 變形桿菌門 梭桿菌門 放線菌門ZC組 53.90±23.64 41.60±22.38 2.31±1.66 1.08±2.64 1.01±0.95 UC組 48.17±12.43 44.43±11.24 5.08±4.63 0.02±0.017 2.22±1.99 UF組 51.91±1.09 33.56±14.40 5.59±4.33 6.11±10.19 2.63±5.26

2.4 腸道菌群屬分類水平分析 所有樣本共檢出240個菌屬，相對豐度前35的菌屬在各組樣本中的構(gòu)成情況見圖4。ZC組優(yōu)勢菌屬：厚壁菌門的糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌門的擬桿菌屬（Bacteroides）及普雷沃菌屬（Prevotella）；UC組及UF組優(yōu)勢菌屬：擬桿菌門的擬桿菌屬、 厚壁菌門的糞桿菌屬及羅斯菌屬（Roseburia）。所有菌屬中共有15個菌屬在屬分類水平上組間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中前5類菌屬差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。與UC組比較，ZC組及UF組的考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）的相對豐度增高（P＜0.05）；與UF組比較，ZC組及UC組的錐形桿菌屬（Pyramidobacter）的相對豐度降低（P＜0.05）；與ZC組比較，UC組及UF組奧爾森菌屬（Olsenella）、霍爾德曼菌屬（Holdemania）、克雷伯菌屬（Klebsiella）的相對豐度增高（P＜0.05）。（見圖5及表3）。

圖4 屬分類水平上三組樣本腸道菌群的相對豐度

表3 三組腸道菌群屬水平相對豐度比較［%，（±s）］

表3 三組腸道菌群屬水平相對豐度比較［%，（±s）］

注：與UC組比較，*P＜0.05；與UF組比較，#P＜0.05；與ZC組比較，△P＜0.05

組別 考拉桿菌屬 奧爾森菌屬 錐形桿菌屬 霍爾德曼菌屬 克雷伯菌屬ZC組 1.58±0.75*0.0005±0.001 0.00±0.00# 6.64±4.83 0.02±0.03 UC組 0.21±0.52 0.006±0.007△0.00±0.00# 8.59±8.47△1.74±3.24△UF組 2.23±2.86*0.006±0.016△0.004±0.005 8.00±7.52△1.04±1.74△

圖5 屬分類水平上三組樣本差異性腸道菌群的相對豐度Image圖

3 討論

腸道菌群與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制密切相關(guān)，在正常生理狀態(tài)下，腸腔內(nèi)有益菌群及有害菌群相互制約、相互依存，共同維持腸道穩(wěn)態(tài)。一旦腸道微生態(tài)失衡，有益菌減少而致病菌繁殖增加，侵襲、破壞腸黏膜屏障進(jìn)而引發(fā)腸黏膜免疫反應(yīng)，導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷［8-10］從而引起UC發(fā)病。

本研究顯示，三組間Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)的差異無統(tǒng)計意義。表明三組間菌群豐富度及群落物種多樣性存在相似性，但每個菌種具體相對豐度的差異還需進(jìn)一步的分析。比較健康人群、UC患者及其配偶的差異性菌屬，發(fā)現(xiàn)UC患者腸道內(nèi)考拉桿菌屬的相對豐度明顯降低?？祭瓧U菌屬是短鏈脂肪酸——丁酸及丙酸的生產(chǎn)者，后者可經(jīng)SCFA / GPCR途徑抑制NLRP3炎癥小體激活及炎癥因子分泌；同時誘導(dǎo)結(jié)腸調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）的分化，維持結(jié)腸免疫耐受及應(yīng)答間的平衡［11-12］。LUKAS等［13］研究發(fā)現(xiàn)，考拉桿菌屬在UC腸道中明顯減少。本研究結(jié)果與上述研究相一致，提示考拉桿菌屬可能是UC患者發(fā)病的標(biāo)志性菌群。

此外，UC組及UF組優(yōu)勢菌屬均為擬桿菌門的擬桿菌屬、 厚壁菌門的糞桿菌屬及羅斯菌屬，而健康人群組的優(yōu)勢菌屬為厚壁菌門的糞桿菌屬、擬桿菌門的擬桿菌屬及普雷沃菌屬。與ZC組比較，UC患者組及其配偶組腸道內(nèi)奧爾森菌屬、霍爾德曼菌屬及克雷伯菌屬的相對豐度升高。奧爾森菌屬歸屬于放線菌門，是一種條件性致病菌［13］。研究報道奧爾森菌屬的減少有助于減輕腸黏膜炎癥損傷［14］。霍爾德曼菌屬歸屬于厚壁菌門，有研究表明飲酒會引起此菌屬豐度的上升［15］，其可能參與一些疾病的發(fā)生發(fā)展過程?？死撞鷮贇w屬于變形桿菌門，是一種寄居機體腸道的條件致病菌。機體健康狀態(tài)下保持沉默，但當(dāng)機體抵抗力下降、腸道菌群失調(diào)時，其將迅速繁殖、破壞腸黏膜屏障，從而引發(fā)遺傳易感人群嚴(yán)重的腸道炎癥反應(yīng)［16］。本研究已排除血緣關(guān)系等其他混雜因素后，發(fā)現(xiàn)UC組與UF組腸道內(nèi)霍爾德曼菌屬、克雷伯菌屬及奧爾森菌屬的相對豐度較健康人群顯著升高。因此，作者推測以上2種菌屬可能隨著生活環(huán)境或日常飲食改變而變化，在一定條件下可能促發(fā)UC易感人群發(fā)病。相比傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，16S rRNA基因測序技術(shù)對菌群構(gòu)成的分類準(zhǔn)確率更高。本研究從UC患者及其配偶腸道中檢測到可能與UC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異菌群：如考拉桿菌屬、奧爾森菌屬及克雷伯菌屬。上述菌群的發(fā)現(xiàn)將為針對腸道菌群靶點的UC精準(zhǔn)治療提供新思路。

綜上所述，考拉桿菌屬、奧爾森菌屬及克雷伯菌屬可作為UC腸道菌群失調(diào)預(yù)后及治療的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。此外，人體腸道菌群結(jié)構(gòu)與數(shù)量因生活環(huán)境的不同會產(chǎn)生一定差異，但這種差異不一定會引起機體發(fā)病，多種因素共同作用導(dǎo)致UC易感人群的腸道微環(huán)境失衡是UC的重要發(fā)病機制。