CD137?CD137L信號(hào)通路通過活化TNF受體相關(guān)因子6促進(jìn)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)血管新生

翁嘉懿，殷云杰，馬雪興，李淵，陳璐，何洪濤，徐桂冬△，孫康云

血管新生是指從原血管以出芽方式形成新生微血管，是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）易損斑塊的特征性病變。微血管新生可增加血管粥樣硬化斑塊負(fù)荷，可能與心腦血管疾病中斑塊不穩(wěn)定相關(guān)［1］，是遠(yuǎn)期心血管事件可靠的獨(dú)立預(yù)測因子［2］。血管新生過程包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化及管腔形成等復(fù)雜過程。CD137 分子屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor recptor，TNFR）超家族成員，在AS 不穩(wěn)定斑塊中高表達(dá)，CD137?CD137L 信號(hào)通路在血管新生及AS 進(jìn)展過程中起著至關(guān)重要的作用［3］。本課題組前期研究表明，急性冠脈綜合征患者斑塊不穩(wěn)定性與CD137?CD137L信號(hào)通路的激活有關(guān)，CD137?CD137L 信號(hào)通路激活可能促進(jìn)AS 新生血管形成并導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定［4］。新近研究表明，T細(xì)胞、平滑肌等細(xì)胞中CD137 分子能夠通過TNF 受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor associated factor 6，TRAF6）調(diào)控下游因子表達(dá)，是連接 CD137?CD137L信號(hào)通路與斑塊形成之間的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。TRAFs 家族成員是一大類胞內(nèi)接頭蛋白，作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通后激活的“銜接蛋白”，是介導(dǎo)腫瘤壞死因子信號(hào)及其他信號(hào)傳遞的重要“分子開關(guān)”［5］。研究表明，TRAF6 蛋白 N 末端 RING 結(jié)構(gòu)域作為 E3 泛素連接酶，結(jié)合相關(guān)受體，起著泛素?蛋白酶體調(diào)節(jié)作用，可磷酸化激活相關(guān)受體胞漿區(qū)的GS 結(jié)構(gòu)域，激活下游信號(hào)通路，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［6］。因此，筆者推測CD137?CD137L 信號(hào)通路可能通過TRAF6調(diào)控AS斑塊內(nèi)血管新生。鑒于此，本研究分別從動(dòng)物離體模型和細(xì)胞水平激活CD137?CD137L信號(hào)通路并沉默TRAF6表達(dá)，觀察其對(duì)新生血管形成的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠20只，體質(zhì)量20～22 g，購自江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。CD137重組蛋白抗體、同型對(duì)照IgG2b 和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）上下游引物購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（DMEM，糖濃度4.5 g/L）、Opti?MEM、青/鏈霉素雙抗、胰酶購自美國Gibco 公司；腫瘤壞死因子?α（TNF?α）購自美國Peprotech 公司；Smad1/5、TRAF6、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、內(nèi)參GAPDH 兔抗鼠單克隆抗體購自德國Cell Signaling Technology（CST）公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗、Lipo?2000購自美國Invitrogen公司；TRAF6小干擾RNA（siRNA）和對(duì)照siRNA購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司；RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司；蛋白提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、氧化低密度脂蛋白（ox?LDL）購自北京索萊寶科技有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自賽默飛世爾生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠購自美國艾美捷公司；小鼠腦微靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（bEnd.3）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；鼠尾Ⅰ型膠原購自德國Milipore公司；眼科手術(shù)器械購自北京中興名業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞及主動(dòng)脈環(huán)的培養(yǎng) 小鼠bEnd.3 細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，以0.25%胰酶消化和離心細(xì)胞，常規(guī)傳代。主動(dòng)脈環(huán)的培養(yǎng)：以頸椎脫臼法處死小鼠，取下胸主動(dòng)脈后，置于Ⅱ型膠原酶（2 g/L）中，放入37 ℃培養(yǎng)箱消化6～7 min 后去除外膜，將血管均勻地剪成約0.5 mm 長的主動(dòng)脈環(huán)，放入無血清培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中饑餓過夜后，將預(yù)處理過的主動(dòng)脈環(huán)包埋入鼠尾Ⅰ型膠原（1 g/L）包被的96 孔板中。96 孔板在室溫平衡10 min 后放入37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，待膠原凝固后加入DMEM+2.5%胎牛血清覆蓋膠原表面（100 μL/孔）；隔天換液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 細(xì)胞分組：將密度為2×105個(gè)/孔的細(xì)胞接種于6孔板，予以10 μg/L TNF?α預(yù)刺激24 h（誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD137L）后，將內(nèi)皮細(xì)胞分為3組：IgG同型對(duì)照組（培養(yǎng)基中加入10 μg/L TNF?α+5 mg/L IgG2b）、CD137 刺激組（培養(yǎng)基中加入10 μg/L TNF?α+5 mg/L CD137 抗體）和對(duì)照組（培養(yǎng)基中加入10 μg/L TNF?α），各組內(nèi)皮細(xì)胞均置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后提取細(xì)胞蛋白或RNA備用。主動(dòng)脈環(huán)分組：以鼠尾Ⅰ型膠原（1 g/L）包被96 孔板后，將主動(dòng)脈環(huán)按1個(gè)/孔包埋入96孔板，分組及干預(yù)措施同內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.3 轉(zhuǎn)染siRNA抑制TRAF6基因表達(dá) 內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將密度為2×105個(gè)/孔的內(nèi)皮細(xì)胞接種于6 孔板中過夜，實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照siRNA 組和TRAF6 siRNA 組，每組3 個(gè)復(fù)孔。TRAF6 siRNA 組：在6 孔板中加入1 600 μL 無血清無雙抗培養(yǎng)基和400 μL TRAF6 siRNA?lipo 2000 混合液，混勻；對(duì)照 siRNA組：加入相同劑量無血清無雙抗培養(yǎng)基和對(duì)照siRNA?lipo 2000混合液，混勻。培養(yǎng)6 h后，將含siRNA?lipo2000的培養(yǎng)基混合液移除，更換新鮮培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。主動(dòng)脈環(huán)轉(zhuǎn)染：將0.5 mm長的主動(dòng)脈環(huán)放入1 600 μL無血清無雙抗培養(yǎng)基中，每組5個(gè)復(fù)孔，后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染步驟同內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4 Western blot 法檢測 TRAF6、VEGF 和 Smad1/5 蛋白的表達(dá) 各組內(nèi)皮細(xì)胞或主動(dòng)脈環(huán)分別按照RIPA裂解液及組織蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，分裝后在?20 ℃保存待用。十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）后，以350 mA 恒流120 min 轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。PVDF 膜置于5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，再分別用相應(yīng)的兔抗鼠TRAF6（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、Smad1/5（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶3 000）4 ℃孵育過夜。次日用TBST 洗滌3次，采用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶7 000）37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3 次，ECL 顯色系統(tǒng)定影顯色，使用LANE?1D 圖像分析軟件掃描灰度值并進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.5 qPCR 檢測主動(dòng)脈環(huán)及內(nèi)皮細(xì)胞中TRAF6、VEGF、Smad1/5mRNA 表達(dá)水平 經(jīng)處理后的細(xì)胞或主動(dòng)脈環(huán)，按照Trizol 法提取總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按以下體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)：20 μL 反應(yīng)體系依次加入TaKaRa Taq Premix 10 μL，上下游引物（10 nmol/L）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。以GAPDH 為內(nèi)參，引物序列見表 1。采用 2?ΔΔCt法計(jì)算TRAF6、VEGF及Smad1/5mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn) 對(duì)照siRNA 組和TRAF6 siRNA組內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h 后，將含siRNA?lipo2000 的培養(yǎng)基混合液移除，更換 2 mL 含10 μg/L TNF?α 新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，胰酶消化收集細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將收獲細(xì)胞調(diào)整為1.5×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，按1×105個(gè)/孔加入小室上室，12 h 后取出小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜上室側(cè)細(xì)胞，下室側(cè)細(xì)胞經(jīng)固定、結(jié)晶紫染色、漂洗和拍照。采用Image?proplus 6.0 軟件計(jì)算每組下室側(cè)細(xì)胞數(shù)量，分別取對(duì)照siRNA組和TRAF6 siRNA組細(xì)胞數(shù)量的平均值，計(jì)算TRAF6 siRNA組與對(duì)照siRNA組細(xì)胞數(shù)量的比值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Tab.1 The primer sequence of TRAF6,VEGF and GAPDH表1 TRAF6、VEGF和GAPDH引物序列

1.2.7 內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn) 對(duì)照siRNA 組和TRAF6 siRNA組內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，將含siRNA?lipo2000的培養(yǎng)基混合液移除，更換2 mL新鮮培養(yǎng)基（含10 μg/L TNF?α）培養(yǎng)24 h 后，胰酶消化收集細(xì)胞后，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞調(diào)整為1.5×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，以1.5×104個(gè)/孔接種于基質(zhì)膠包被的96 孔板，每孔覆蓋100 μL 培養(yǎng)基（10 μg/L TNF?α+50 mg/L ox?LDL+5 g/L CD137L 抗體）［7］。24 h 后拍照，通過 Image?pro plus 6.0軟件分析各組的小管長度及其分支數(shù)量。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn) 以約80 μL/孔鼠尾Ⅰ型膠原（1 g/L）包被預(yù)冷的96 孔板，將對(duì)照siRNA 組和TRAF6 siRNA組預(yù)處理過的主動(dòng)脈環(huán)（主動(dòng)脈環(huán)轉(zhuǎn)染6 h后）包埋入液態(tài)基質(zhì)膠。96 孔板在室溫平衡10 min 后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，待膠原凝固后加入100 μL培養(yǎng)基（10 μg/L TNF?α+50 mg/L ox?LDL+5 g/L CD137L 抗體）覆蓋膠原表面；隔天換液。7 d后在倒置顯微鏡下觀察主動(dòng)脈環(huán)新生微血管的數(shù)量和分支。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD?t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平變化 CD137 刺激組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、VEGF蛋白和mRNA 表達(dá)水平均高于對(duì)照組和IgG 同型對(duì)照組（均P＜0.05）；IgG 同型對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、VEGF蛋白和mRNA水平與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1、表2。

2.2 3組小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平變化 CD137 刺激組主動(dòng)脈環(huán)TRAF6、VEGF 蛋白和mRNA 表達(dá)水平均高于對(duì)照組和IgG同型對(duì)照組（均P＜0.05）；IgG 同型對(duì)照組主動(dòng)脈環(huán)TRAF6、VEGF蛋白和mRNA水平與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表3。

Fig.1 The protein expressions of TRAF6 and VEGF in endothelial cells detected by Western blot assay圖1 Western blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、VEGF蛋白的表達(dá)

Tab.2 Comparison of TRAF6 and VEGF expressions in endothelial cells between the three groups表2 3組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

Tab.2 Comparison of TRAF6 and VEGF expressions in endothelial cells between the three groups表2 3組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與IgG同型對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組IgG同型對(duì)照組CD137刺激組F TRAF6蛋白1.00±0.00 1.07±0.13 3.35±0.29ab 159.802＊mRNA 1.00±0.00 0.95±0.08 4.01±0.57ab 80.143＊VEGF蛋白1.00±0.00 1.10±0.07 3.58±0.37ab 133.921＊mRNA 1.00±0.00 1.12±0.17 4.46±0.38ab 195.934＊

Fig.2 The protein expressions of TRAF6 and VEGF in mouse aortic rings detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6、VEGF蛋白的表達(dá)

Tab.3 Comparison of TRAF6 and VEGF expressions in mouse aortic rings between the three groups表3 3組小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

Tab.3 Comparison of TRAF6 and VEGF expressions in mouse aortic rings between the three groups表3 3組小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6、VEGF蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05；a與對(duì)照組比較，b與IgG同型對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組IgG同型對(duì)照組CD137刺激組F TRAF6蛋白1.00±0.00 1.14±0.07 2.07±0.28ab 24.875＊mRNA 1.00±0.00 0.96±0.01 2.21±0.32ab 38.761＊VEGF蛋白1.00±0.00 1.06±0.03 2.98±0.05ab 103.531＊mRNA 1.00±0.00 1.09±0.08 3.07±0.70ab 101.742＊

2.3 TRAF6 參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞Smad1/5 蛋白及mRNA 表達(dá) TRAF6 siRNA 組內(nèi)皮細(xì)胞 TRAF6、Smad1/5 蛋白和mRNA 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照siRNA組（均P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 The protein expressions of TRAF6 and Smad1/5 in endothelial cells detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TRAF6、Smad1/5蛋白的表達(dá)

Tab.4 Comparison of TRAF6 and Smad1/5 expressions in endothelial cells between the two groups表4 2組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、Smad1/5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

Tab.4 Comparison of TRAF6 and Smad1/5 expressions in endothelial cells between the two groups表4 2組內(nèi)皮細(xì)胞TRAF6、Smad1/5蛋白和mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05

組別對(duì)照siRNA組TRAF6 siRNA組t TRAF6蛋白1.00±0.00 0.18±0.06 517.275＊mRNA 1.00±0.00 0.11±0.02 1251.324＊Smad1/5蛋白1.00±0.00 0.12±0.05 829.768＊mRNA 1.00±0.00 0.08±0.06 906.935＊

2.4 TRAF6 參與主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)Smad1/5 的蛋白表達(dá) TRAF6 siRNA 組主動(dòng)脈環(huán) TRAF6、Smad1/5 蛋白和mRNA 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照siRNA 組（均P＜0.05），見圖4、表5。

Fig.4 The protein expressions of TRAF6 and Smad1/5 in mouse aortic rings detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6和Smad1/5蛋白的表達(dá)

Tab.5 Comparison of TRAF6 and Smad1/5 expressions in mouse aortic rings between the two groups表5 2組小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6和Smad1/5蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

Tab.5 Comparison of TRAF6 and Smad1/5 expressions in mouse aortic rings between the two groups表5 2組小鼠主動(dòng)脈環(huán)TRAF6和Smad1/5蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05

組別對(duì)照siRNA組TRAF6 siRNA組t TRAF6蛋白1.00±0.00 0.32±0.05 660.651＊mRNA 1.00±0.00 0.26±0.04 864.637＊Smad1/5蛋白1.00±0.00 0.15±0.04 667.348＊mRNA 1.00±0.00 0.38±0.07 268.249＊

2.5 抑制TRAF6 表達(dá)減弱內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力 TRAF6 siRNA 組內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量比值低于對(duì)照 siRNA組（0.76±0.09vs.1.00±0.00；n=3，t=7.000，P＜0.05）。

2.6 抑制TRAF6 表達(dá)減弱內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力 TRAF6 siRNA組內(nèi)皮細(xì)胞小管長度和分支數(shù)量均明顯低于對(duì)照siRNA 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5、表6。

Fig.5 Tube formation ability of endothelial cells detected by Matrigel tube formation assay圖5 內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.6 Comparison of tube length and branch points of endothelial cells between the two groups表6 2組內(nèi)皮細(xì)胞小管長度和分支數(shù)量的比較（n=4，）

Tab.6 Comparison of tube length and branch points of endothelial cells between the two groups表6 2組內(nèi)皮細(xì)胞小管長度和分支數(shù)量的比較（n=4，）

＊P＜0.05

組別對(duì)照siRNA組TRAF6 siRNA組t小管長度（mm）5.4±1.5 2.0±1.6 16.047＊分支數(shù)量（個(gè)）26.40±3.85 6.00±2.00 110.742＊

2.7 抑制TRAF6 表達(dá)減弱小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生能力 TRAF6 siRNA組小鼠主動(dòng)脈環(huán)新生微血管數(shù)量 明 顯 少 于 對(duì) 照 siRNA 組［（2.40±1.90）條vs.（21.80±4.6）條］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=5，t=8.000，P＜0.05），見圖6。

Fig.6 The ability of sprouts of aortic rings detected by mouse aortic ring angiogenesis assay圖6 小鼠主動(dòng)脈環(huán)血管新生實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

3 討論

血管新生是AS進(jìn)展的關(guān)鍵病理性改變之一，可增加斑塊破裂風(fēng)險(xiǎn)，是不穩(wěn)定斑塊破裂及影響冠心病患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。早期關(guān)于高膽固醇血癥的小鼠模型及人類尸體解剖的一項(xiàng)回顧性研究結(jié)果顯示，在冠脈易損斑塊內(nèi)檢測到新生微血管密度顯著增加，表明血管新生在不穩(wěn)定斑塊發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［8］。絕大多數(shù)AS 斑塊內(nèi)的新生血管起源于血管外膜滋養(yǎng)血管，主要位于斑塊肩部，在炎癥浸潤、缺氧等因素刺激下，隨著斑塊發(fā)展而數(shù)量增多，為炎癥介質(zhì)浸潤提供了通道，有助于斑塊脂核形成及擴(kuò)大，促進(jìn)斑塊內(nèi)出血，更容易導(dǎo)致斑塊破裂和繼發(fā)臨床急性事件的發(fā)生［9］。這一點(diǎn)也被近期一項(xiàng)關(guān)于人類斑塊血管新生的前瞻性研究［10］所證實(shí)。本課題組前期研究證實(shí)，伴隨著CD137?CD137L 信號(hào)通路激活，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）?β受體直接作用的底物蛋白Smad1及Smad5被磷酸化激活，AS 斑塊內(nèi)新生血管形成數(shù)量增加，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成能力增強(qiáng)［11］，提示CD137?CD137L 信號(hào)通路可能通過調(diào)控Smad 蛋白促進(jìn)AS斑塊內(nèi)血管新生并導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定。但是，CD137?CD137L 信號(hào)通路如何通過激活Smad 蛋白促進(jìn)血管新生的機(jī)制目前尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)，CD137?CD137L 信號(hào)通路的激活及信號(hào)傳遞需要TRAFs 的募集及協(xié)同，進(jìn)而激活下游信號(hào)通路。CD137?CD137L 信號(hào)可激活細(xì)胞磷脂酶信號(hào)通路，且可通過TRAF6/核因子（NF）?κB 調(diào)控活化T 細(xì)胞核因子（NFATc1）的表達(dá)［12?13］。多項(xiàng)研究表明，Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)調(diào)節(jié)因子包括VEPH1、ShcA、TRAFs等。其中TRAF6作為TRAFs家族成員之一，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活的“銜接蛋白”，在Smad信號(hào)通路的激活中起著至關(guān)重要的作用［14?15］。本研究結(jié)果顯示，激活CD137?CD137L信號(hào)通路后，內(nèi)皮細(xì)胞及主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)TRAF6 和VEGF 表達(dá)均上調(diào)，提示CD137?CD137L 信號(hào)通路可能通過TRAF6調(diào)控Smad1/5蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)血管新生。

本研究進(jìn)一步從細(xì)胞和離體實(shí)驗(yàn)兩方面觀察激活 CD137?CD137L 信號(hào)通路并干擾 TRAF6 對(duì) Smad信號(hào)及新生血管形成的影響。結(jié)果顯示，在激活CD137?CD137L 信號(hào)通路的前提下，干擾 TRAF6 基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞Smad1/5蛋白磷酸化水平降低，內(nèi)皮細(xì)胞小管形成長度及分支數(shù)量顯著減少，管腔形成能力明顯減弱。在離體實(shí)驗(yàn)中，激活CD137?CD137L 信號(hào)通路后干擾TRAF6 基因表達(dá)，小鼠主動(dòng)脈環(huán)Smad1/5 表達(dá)水平下降，主動(dòng)脈環(huán)新生微血管數(shù)量顯著減少。以上研究結(jié)果提示雖激活CD137?CD137L 信號(hào)通路，但同時(shí)干擾 TRAF6 基因表達(dá)可下調(diào)Smad1/5表達(dá)，抑制新生血管的形成，表明 CD137?CD137L 信 號(hào) 通 路 通 過 TRAF6 調(diào) 控Smad1/5 蛋白表達(dá)介導(dǎo)新生血管的形成。然而，CD137?CD137L信號(hào)通路與TRAF6之間如何相互作用，是否通過改變TRAF6的活性狀態(tài)影響其與相關(guān)受體的交聯(lián)從而介導(dǎo)Smad1/5 蛋白磷酸化，進(jìn)而調(diào)控血管新生目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，CD137?CD137L 信號(hào)通路可能通過TRAF6 促進(jìn)小鼠AS 斑塊內(nèi)的血管新生。本研究為了解CD137?CD137L信號(hào)通路與新生血管形成的相關(guān)性提供了理論基礎(chǔ)，也為預(yù)防和治療AS提供了新思路。