植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及清除機制研究進展

郭明欣 劉佳佳 侯琳琳 張笑天 劉含笑

（洛陽師范學(xué)院<生命科學(xué)學(xué)院>，河南 洛陽 471934）

0 引言

干旱、鹽堿、低溫、重金屬等非生物脅迫會導(dǎo)致植物細胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）增加。由于ROS 的過量積累會產(chǎn)生氧化脅迫，因此，植物為了應(yīng)對復(fù)雜的外界環(huán)境，在進化過程中形成了復(fù)雜的ROS 平衡調(diào)控機制。現(xiàn)有研究表明，植物對非生物脅迫的耐性與自身的抗氧化脅迫能力密切相關(guān)。本文對ROS 的產(chǎn)生、毒害及ROS 的清除進行綜述。

1 植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及毒害

在正常外界環(huán)境條件下，氧分子處于不太活潑的氧化狀態(tài)。但是，當(dāng)植物遭受病蟲、干旱、鹽堿、重金屬、紫外光（UV）等生物或非生物脅迫時，植物體內(nèi)電子傳遞和氧化還原動態(tài)平衡被破壞，細胞內(nèi)產(chǎn)生的電子很容易使氧化態(tài)的氧轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)的氧，產(chǎn)生超氧陰離子、羥自由基（OH-）、單線態(tài)氧（1O2）和過氧化氫（H2O2）等物質(zhì)，這些物質(zhì)被統(tǒng)稱為活性氧。

1.1 活性氧的產(chǎn)生

研究表明，植物細胞的細胞壁、質(zhì)膜、葉綠體、線粒體、 過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位都可產(chǎn)生ROS，其中葉綠體、線粒體、過氧化物酶體是ROS 產(chǎn)生的主要細胞器。

細胞壁： 植物細胞壁上存在多種產(chǎn)生ROS 的氧化酶，如過氧化物酶（Peroxidases， POXs），外界環(huán)境的刺激誘導(dǎo)POXs 產(chǎn)生ROS。ROS 的爆發(fā)在植物防御病原菌中發(fā)揮著重要作用[1]。另外，細胞壁的二胺氧化酶在醌的還原過程中也可以形成ROS。

細胞質(zhì)膜： 植物細胞質(zhì)膜上的還原型輔酶II（NADPH） 氧化酶是H2O2產(chǎn)生的主要來源。 該酶以NADPH 為電子供體催化胞外O2產(chǎn)生。NADPH 氧化酶在植物的生長發(fā)育及生物和非生物脅迫反應(yīng)中起重要作用。

葉綠體：植物的葉綠體是ROS 產(chǎn)生的重要部位。葉綠體光合電子傳遞系統(tǒng)是ROS 的一個重要來源。在光系統(tǒng)I（PS I）中，葉綠素分子吸收能量后由基態(tài)上升到一個不穩(wěn)定的、高能的激發(fā)態(tài)，在從激發(fā)態(tài)向較低能量狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中會發(fā)生電子的漏滲，電子轉(zhuǎn)移到O2產(chǎn)生單線態(tài)氧1O2。在光系統(tǒng)II（PS II）中激發(fā)的三線態(tài)葉綠素分子與O2相互作用也產(chǎn)生。UV 輻射或強光脅迫引起的光抑制作用也會導(dǎo)致葉綠體內(nèi)1O2和的產(chǎn)生。

線粒體：線粒體呼吸作用過程中的電子傳遞鏈?zhǔn)荝OS 產(chǎn)生的主要部位。線粒體呼吸鏈末端氧化酶把底物的電子傳遞到氧分子形成水或H2O2。 在哺乳動物中，大約有1-5% 的氧被消耗于ROS 的產(chǎn)生。在植物中，由于交替氧化酶（Alternative oxidase， AOX）的存在，ROS 在線粒體中處于一個比較低的水平。 在線粒體中，ROS 作為信號分子具有重要的調(diào)節(jié)功能， 調(diào)節(jié)植物的脅迫適應(yīng)性及細胞的程序性死亡。

過氧化物酶體： 過氧化物酶體也是H2O2產(chǎn)生的主要細胞器。 在過氧化物酶體中發(fā)生的β－氧化伴隨有H2O2的產(chǎn)生。另外，過氧化物酶體中的乙醇酸氧化酶能夠把葉綠體光呼吸中產(chǎn)生的乙醇酸氧化生成乙醛酸和H2O2。

1.2 活性氧的毒害

ROS 在植物的生命周期中發(fā)揮著重要作用。ROS作為信號分子調(diào)控著植物的發(fā)育、 細胞程序性死亡、激素信號以及植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)等過程[3]。然而，當(dāng)植物體內(nèi)ROS 積累過量時，就會產(chǎn)生氧化脅迫。過量積累的ROS 會破壞細胞的結(jié)構(gòu)，損傷DNA、脂類、蛋白等生物大分子，并最終導(dǎo)致細胞死亡[4]。

ROS 對DNA 的損傷，主要包括堿基的缺失、修改（烷化，氧化）、嘧啶二聚體化、雙鏈的斷裂等。DNA 受損將影響基因組的穩(wěn)定、蛋白的翻譯、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個方面，并使細胞膜受到破壞，光合功能減弱，最終阻礙植物的正常生長發(fā)育[5]。

ROS 主要通過共價的修飾使蛋白發(fā)生氧化，一般以蛋白的羰基化水平作為蛋白氧化程度的評價指標(biāo)。不同的氨基酸對ROS 敏感程度不同， 其中精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）、色氨酸（Trp）對ROS 比較敏感。ROS 傾向于氧化含硫和巰基的氨基酸，像甲硫氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）。ROS能夠與甲硫氨酸發(fā)生反應(yīng)，形成硫自由基，該自由基與另一個硫自由基發(fā)生反應(yīng)形成二硫鍵。此外，活性氧能夠使甲硫氨酸的殘基發(fā)生反應(yīng)形成硫的衍生物。大部分蛋白發(fā)生氧化后是不能復(fù)性的。Bartoli et al.（2004）的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體中蛋白的羰基化程度要高于葉綠體和過氧化物酶體，這表明線粒體對氧化脅迫更加的敏感[6]。

ROS 對細胞質(zhì)膜的損害可以作為對細胞內(nèi)脂類損害的一個評價指標(biāo)。ROS 對質(zhì)膜的損害可以分為三個步驟，包括起始、發(fā)展和終止。起始是指OH-與不飽和脂肪酸的亞甲基發(fā)生反應(yīng)形成碳自由基（R-），啟動膜質(zhì)過氧化。發(fā)展是指R-沒有配對電子，能夠與基態(tài)氧反應(yīng)，形成過氧化自由基（ROO-）；ROO-再與其他脂肪酸發(fā)生反應(yīng)生成羥過氧化物（ROOH）和R-，該R-又參與下一輪的反應(yīng)。終止則為R- 與自身交聯(lián)形成脂肪酸二聚體，ROO-自身交聯(lián)形成過氧橋聯(lián)二聚體（ROOR）[4]。

2 活性氧的清除

由于體內(nèi)過量ROS 的積累會阻礙植物的生長發(fā)育甚至導(dǎo)致植株死亡，為了應(yīng)對不斷變化的外界環(huán)境，植物進化出一套復(fù)雜的過量ROS 清除機制。植物體內(nèi)ROS 的清除機制分為兩種，一種是酶促清除機制，主要包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S -transferases，GST）。另一種是非酶促清除機制，主要是依賴細胞中抗壞血酸 （VC）、 還原型谷胱甘肽 （Lglutathione，GSH）、α－生育酚（VE）、脯氨酸（Pro）、生物堿（Carotenoids）、類黃酮（Flavonoids）等清除ROS（見圖1）。

圖1 植物體內(nèi)活性氧清除機制[4]

2.1 酶促清除機制

SOD 是一種金屬酶。 根據(jù)金屬的差異，SOD 可分為Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 三種類型。SOD 分布廣泛，存在于線粒體、葉綠體、過氧化物酶體等細胞器以及細胞質(zhì)基質(zhì)中。 高等植物中SOD 以Cu-Zn-SOD 為主。SOD 能催化形成H2O2和O2， 降低ROS對植物的毒害。付暢等（2009）的研究發(fā)現(xiàn)將西伯利亞蓼的PsMnSOD 在酵母中表達提高了酵母在鹽堿脅迫下的SOD 活性，并提高了酵母對鹽堿脅迫的抗性[7]。

CAT 是植物細胞中清除ROS 的主要酶類之一，是唯一不需要能量的ROS 清除酶， 它催化H2O2形成H2O 和O2。CAT 主要存在于植物的過氧化物酶體和乙醛酸循環(huán)中。植物中的CAT 可以分為三類，第一類在光合作用組織中存在， 清除光合作用產(chǎn)生的H2O2；第二類清除乙醛酸循環(huán)中脂肪降解產(chǎn)生的H2O2；第三類存在于微管組織中，參與植物木質(zhì)素的合成。在水稻基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有3 個編碼CAT 基因， 分別是OsCATA、OsCATB、OsCATC（OsNOE1）。水分脅迫和外源ABA 能夠誘導(dǎo)OsCATB 的表達，從而阻止H2O2的過量積累。 研究表明，OsCATC 功能喪失突變體noe1體內(nèi)由于積累了過量的H2O2， 誘導(dǎo)了NO 的產(chǎn)生，而過量的NO 誘導(dǎo)了葉片的細胞死亡，使noe1 突變體表現(xiàn)為葉片早衰[8]。

POX 也能夠?qū)2O2還原成H2O。POX 包括兩類，即APX 和GPX。APX 通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（APX-GSH） 再生系統(tǒng)， 在單脫氫抗壞血酸還原酶（Mono-dehydroaseorbate reductase， MDAR）、脫氫抗壞血酸還原酶 （Dehydroaseothate reductase， DHAR）、谷胱甘肽還原酶 （Glutathione reductase， GR） 等的作用下，利用VC、NADPH、GSH 等抗氧化物，將H2O2還原成H2O。 水稻基因組中有8 個基因 （OsAPX1-OsAPX8）編碼APXs。這8 個APXs 分布于細胞中的不同部位，包括葉綠體、線粒體、過氧化物酶體、細胞質(zhì)。過量表達OsAPX1 增強水稻孕穗期的耐寒性。OsAPX8 的表達受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，而其他幾個APXs的表達不受鹽脅迫的影響。 作為POX 的另外一類，GPX 主要通過谷胱甘肽過氧化物酶循環(huán)體系，直接利用GSH 將H2O2還原為H2O。 生成的氧化型谷胱甘肽（GSSG） 在GR 和NADPH 的共同作用下重新轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH。

谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶 （Glutathione S -transferases，GST） 是一大類多功能的蛋白家族， 在植物中廣泛存在。GST 催化具有親電取代基的外源性化合物， 與內(nèi)源GSH 發(fā)生反應(yīng)。 許多外源化合物在生物轉(zhuǎn)化第一相反應(yīng)中極易形成某些生物活性中間產(chǎn)物，它們可與細胞生物大分子的重要成分發(fā)生共價結(jié)合，由此對機體造成損害。GSH 與其結(jié)合后可以防止這種共價結(jié)合。GST 具有清除ROS、 調(diào)節(jié)脅迫誘導(dǎo)的細胞程序性死亡等功能[4]。水稻基因組中有79 個GST 家族的成員， 分 為 以 下7 類：Tau、Phi、Zeta、DHAR、EF1G、Theta、TCHQD。Tau 家 族中OsGSTU3、OsGSTU4 的 表達受重金屬和PEG 脅迫的誘導(dǎo)[9]。

2.2 非酶促清除機制

Vc 是一種在植物中大量存在的、 可溶性的抗氧化物質(zhì)。所有的植物都能夠合成Vc，其可以作為還原劑，直接與ROS 反應(yīng)后清除ROS。另外，它也作為酶的底物在ROS 清除中扮演重要角色。VC 在葉綠體中含量豐富，是葉綠體中重要的抗氧化物質(zhì)。外源的Vc能緩解鹽脅迫產(chǎn)生的ROS 對小麥的損害。

GSH 是由Glu-Cys-Gyl 組成的三肽，是植物中重要的抗氧化劑，存在于植物的所有組織和細胞。在植物中，GSH 主要通過以下兩種形式清除ROS。 第一，GSH 與1O2、HO-和O2-等直接發(fā)生化學(xué)反應(yīng)， 清除ROS。 第二，GSH 作為供氫體， 通過與DHAR 反應(yīng)使Vc 從氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型，增加細胞中還原型Vc 的含量。

類黃酮（flavonoids）是植物中一類具有多種功能的次級代謝物質(zhì)，主要包括黃酮醇、黃酮類、異黃銅、花色素等，在細胞內(nèi)能夠區(qū)隔化和清除ROS。在水稻中過量表達異黃酮還原酶基因OsIRL，增強了水稻的抗氧化脅迫能力[10]。