多價(jià)流感疫苗及通用型流感疫苗的研究進(jìn)展

謝青昕，劉艷紅 綜述，魯衛(wèi)東 審校

昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500

流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）是一種病毒性傳染性疾病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，季節(jié)性流感每年在全球會(huì)造引起300 萬～500 萬例嚴(yán)重病例，導(dǎo)致30 萬 ～50 萬人死亡，實(shí)際數(shù)字可能更高［1］。流感病毒屬于正黏病毒科，分為甲（A）、乙（B）、丙（C）、?。―）4 型。甲型流感病毒可感染多種不同物種，是導(dǎo)致季節(jié)性流感傳播和致死的主要病原體；乙、丙型流感病毒變異較少［2-3］，丁型流感病毒主要感染牛。甲型流感病毒表面血凝素（haemagglutinin，HA）分為 18 種亞型，神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）有 9 種亞型［4］。乙型流感病毒分為兩個(gè)譜系，即 Victoria 系（BV）和 Yamagata 系（BY）。

接種流感疫苗是目前預(yù)防流感最經(jīng)濟(jì)有效的方法。1942 年，對(duì)流感病毒疫苗進(jìn)行大規(guī)模的研究證明，滅活流感疫苗可有效預(yù)防流感［5］。目前，使用較多的為三價(jià)及四價(jià)流感疫苗，三價(jià)流感疫苗包含2 種甲型流感病毒（H1N1 和 H3N2）和 1 種乙型流感病毒（BV）；四價(jià)流感疫苗是在三價(jià)流感疫苗的基礎(chǔ)上增加了 1 種乙型流感病毒（BY）［6］。

當(dāng)流感疫苗株與當(dāng)年實(shí)際傳播的病毒株匹配時(shí)，多價(jià)流感疫苗有效率可達(dá)70% ～90%，但老年人及免疫低下人群的有效率較低［7］；若疫苗株與當(dāng)年流感病毒匹配度較低，其功效會(huì)降低［8］。同時(shí)，生產(chǎn)與當(dāng)年流感病毒亞型相匹配的多價(jià)流感疫苗需耗時(shí)幾個(gè)月，還需投入較大的財(cái)力及勞動(dòng)力［9］。目前，正在開發(fā)的通用流感疫苗（universal influenza vaccine）采用多種創(chuàng)新技術(shù)，如在疫苗中添加新型佐劑提高疫苗免疫原性、尋找可擴(kuò)大免疫范圍的抗原靶點(diǎn)、利用細(xì)胞免疫等，使其更有效安全。

1 多價(jià)流感疫苗的研究進(jìn)展

目前，已獲批上市的流感疫苗主要分為流感滅活疫苗（inactived influenza vaccine，IIV）及流感減毒活疫苗（live attenuated influenza virus vaccine，LAIV）兩類。LAIV 是使流感病毒喪失大部分致病性，但仍可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫原性的一類疫苗。LAIV 可通過鼻部給藥，與自然感染的方式較接近，不僅可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，還可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫［10］及局部黏膜免疫［11］。兒童對(duì)滅活疫苗的免疫原性較低，LAIV可能更適合保護(hù)這類人群［12］。我國現(xiàn)批準(zhǔn)上市的流感疫苗有三價(jià)滅活流感疫苗（inactived influenza vaccine 3，IIV3）和四價(jià)滅活流感疫苗（live attenuated influenza virus vaccine 4，IIV4）［13］，當(dāng)前使用的 IIV3包括裂解疫苗與亞單位疫苗兩種類型，IIV4 均為裂解疫苗。

1.1 LAIV 有研究對(duì) 1 314 名兒童（15 ～ 74 個(gè)月）進(jìn)行了一項(xiàng)為期2 年的隨機(jī)、安慰劑的對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果證明，LAIV 對(duì)免疫易感兒童有較好的預(yù)防效果［14］。另一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照針對(duì)65 歲以上的社區(qū)居民流動(dòng)成年人的試驗(yàn)表明，LAIV 的整體有效率為42%［15］。2003 年，美國首次批準(zhǔn)使用一價(jià)、二價(jià)及三價(jià)流感減毒活疫苗（LAIV3）；2013 年批準(zhǔn)可接種四價(jià)減毒活疫苗（LAIV4）。雖然LAIV 在多年研究中在成人和兒童中均具有良好的耐受性，但部分小于2 歲的兒童接種LAIV 后出現(xiàn)了增加哮喘的傾向，機(jī)制尚未明確，因此不建議小于3 歲的嬰幼兒接種LAIV。

1.2 IIV

1.2.1 IIV3 最早生產(chǎn)使用的IIV3 是1976 年法國上市的Vaxigrip，經(jīng)長時(shí)間的使用證實(shí)，IIV3 具有良好的有效性和安全性［16］。2009 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（the US Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了高劑量注射用IIV3，該疫苗血凝素含量是普通疫苗的 4 倍（60 μg ／ mL），可用于 65 及 65 歲以上人群，研究證明，與標(biāo)準(zhǔn)劑量比較，高劑量IIV3 對(duì)65歲以上的老年人保護(hù)性更強(qiáng)，不良反應(yīng)未增多［17］。疫苗添加佐劑可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，降低疫苗使用劑量，MF59 是第一種被許可用作人類疫苗佐劑的水包油乳液，可通過多種機(jī)制增強(qiáng)疫苗的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，與非佐劑疫苗比較，三價(jià)MF59 佐劑季節(jié)性流感疫苗對(duì)老年人可誘導(dǎo)更高的免疫反應(yīng)，并可獲得針對(duì)不同型別流感病毒株的交叉免疫反應(yīng)［18］。

1.2.2 IIV4 由于IIV3 中僅包含1 種乙型流感病毒株，其對(duì)另 1 種乙型譜系（BY）的保護(hù)能力較弱［19］，IIV4 增加了乙型譜系（BY），實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該疫苗具有良好的有效性和安全性［20］，有研究表明，IIV4 的免疫原性不低于IIV3，安全性也相當(dāng)，且擴(kuò)大了保護(hù)范圍［21-22］。IIV4 和LAIV 大部分均是采用雞胚制備而成，需在季節(jié)性流感來臨前6 個(gè)月對(duì)毒株進(jìn)行預(yù)測(cè)和選擇，雞蛋過敏的人群不適于接種該類疫苗。2016 年，美國批準(zhǔn)上市的季節(jié)性重組四價(jià)流感疫苗是首個(gè)采用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)生產(chǎn)的流感疫苗［23］，實(shí)驗(yàn)證明，該疫苗的免疫原性與IIV4 相當(dāng)［24］。BAXAK 等［25］發(fā)現(xiàn)，口服低劑量（1 ×106pfu）的重組流感疫苗，可在2 次免疫后誘導(dǎo)全身性和黏膜性IgG 和IgA 抗體應(yīng)答，從而提供全面保護(hù)，但重組流感疫苗的成本較其他季節(jié)性流感疫苗約高40%，在一定程度上限制了其使用。

2 通用流感疫苗的研究進(jìn)展

IIV3 和IIV4 常用作季節(jié)性流感疫苗，雖具有使用安全，便于保存等優(yōu)點(diǎn)，但這類疫苗在相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，其在特定人群（65 歲及65 歲以上老年人、孕婦、24 周內(nèi)的嬰兒）中免疫效果低于健康成年人［26］。因此，研發(fā)一種可對(duì)人體提供廣泛保護(hù)，能夠應(yīng)對(duì)季節(jié)性流感與大流行性流感的疫苗成為研究熱點(diǎn)。2017 年，美國國家過敏和傳染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases，NIAID）召開研討會(huì)［27］，初步制定了通用流感疫苗的標(biāo)準(zhǔn)：通用流感疫苗至少應(yīng)對(duì)75%的流感癥狀有效；能預(yù)防Ⅰ型及Ⅱ型甲型流感病毒（乙型流感是次要目標(biāo)）和免疫效果應(yīng)需至少持續(xù)1 年；最好可保證疫苗能持續(xù)多個(gè)季節(jié)對(duì)接種者進(jìn)行保護(hù)。目前，處于研發(fā)中的通用型流感疫苗見表1。

2.1 基于能引起廣泛反應(yīng)抗原的通用型流感疫苗目前使用的病毒毒株具有較強(qiáng)的特異性，缺乏廣譜性，因此，尋找一種能全面有效的激發(fā)免疫系統(tǒng)，可引發(fā)廣泛反應(yīng)的抗原是通用流感疫苗研究的熱點(diǎn)之一。流感病毒的基因組在8 個(gè)RNA 片段上編碼了11 種蛋白質(zhì)，包括 HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2、PA、PB1、PB1-F2 和PB2，這些蛋白質(zhì)在禽類和人類病毒分離株中變異程度相對(duì)較保守。近年發(fā)現(xiàn)，M2［36］、NA［37］和 HA 的莖稈［38］等能誘導(dǎo)更廣泛的保護(hù)性免疫應(yīng)答。

表1 2019 — 2020 年研發(fā)中的通用流感疫苗Tab.1 Universal influenza vaccines in development from 2019 to 2020

2.1.1 基于M2 的通用型流感疫苗 M2 蛋白是甲型流感病毒上的一種膜蛋白，具有離子通道活性，M2離子通道是病毒感染細(xì)胞所必須的重要組件。甲型流感病毒中，M2 的N-末端9 個(gè)氨基酸是保守的［39］。由于M2 蛋白在甲型流感病毒中具有高度保守性，可誘導(dǎo)針對(duì)不同流感病毒的交叉保護(hù)［40］。自然感染情況下，不會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但將其單獨(dú)分離用作免疫原時(shí)，在某些條件下可引發(fā)保護(hù)性抗體。研究發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)表達(dá)多個(gè)M2 序列可提高免疫原性［41］。M2 以類病毒顆粒（virus-like par-ticles，VLPs）形式配伍CTA1-DD 佐劑制備的疫苗經(jīng)滴鼻免疫后可增強(qiáng)其免疫原性［28］。

目前已有多個(gè)基于M2 的疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。使用 M2e-Hbc VLPs ／ CTA1-DD（ACAM-FLU-A）疫苗進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該疫苗耐受性良好，無嚴(yán)重副作用，多數(shù)受試者均能對(duì)M2 的免疫應(yīng)答［42］。另一種候選疫苗STF2.4 × M2（在臨床試驗(yàn)中稱為VAX102）是M2 與鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，該疫苗也完成了Ⅰ期臨床試驗(yàn)［43］，結(jié)果表明，第2 次免疫后96%受試者檢測(cè)到了M2 特異性IgG 抗體。多數(shù)基于M2 的候選疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可降低動(dòng)物模型的發(fā)病率，具有安全性高、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，但通過M2 疫苗誘導(dǎo)出的抗體是否對(duì)所有甲型流感病毒亞型產(chǎn)生保護(hù)作用需進(jìn)一步研究。

2.1.2 基于HA 的通用型流感疫苗 HA 是流感病毒顆粒上的主要表面蛋白，可與靶細(xì)胞受體唾液酸結(jié)合。HA 是由球狀頭部和莖區(qū)域組成的3 種HA 單體三聚體，受體結(jié)合點(diǎn)存在于在球狀頭部，是蛋白質(zhì)的可變性最高區(qū)域，在不同亞型間的變化較大。HA 球狀頭部存在一些保守區(qū)域，球狀頭部空間位置較桿部更易被抗體接近。有研究顯示，部分抗體可與高度變異的HA 球狀頭部受體結(jié)合點(diǎn)中保守區(qū)域相結(jié)合，如C05 可識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)中的保守區(qū)域，中和不同流感亞型菌株［44］，該結(jié)果為靶向HA 球狀頭部的通用流感疫苗提供了線索。BANGARU 等［45］發(fā)現(xiàn)，天然抗體FluA-20 可識(shí)別HA 頭部一個(gè)易攻擊的靶點(diǎn)，還可與大多數(shù)甲型流感病毒發(fā)生反應(yīng)，抑制病毒在細(xì)胞間的傳播。

HA 莖部免疫區(qū)域相對(duì)保守。目前，大部分基于HA 的通用流感疫苗的研發(fā)是將靶向HA 莖部作為研究重點(diǎn)［46］。在接種疫苗或是自然感染流感病毒時(shí)，HA 莖部常被其頭部所阻礙，因此疫苗的設(shè)計(jì)需增加HA 莖部在宿主免疫系統(tǒng)中的暴露程度，如利用莖結(jié)構(gòu)域中的某些短肽表位與載體蛋白結(jié)合，增加HA 莖部免疫暴露程度，幫助抗原呈遞至莖部結(jié)構(gòu)域中，增強(qiáng)免疫作用，WANG 等［47］研究表明，這種將短肽表位與載體蛋白結(jié)合的方法對(duì)H3 亞型具有較好的保護(hù)作用。LANG 等［48］發(fā)現(xiàn)，VH1-69 抗體 27F3 以獨(dú)特的方向與HA 莖部結(jié)合，可引起廣泛的抗原反應(yīng)。

2.2 基于交叉保護(hù)性T 細(xì)胞反應(yīng)的通用型流感疫苗與HA 比較，流感病毒的內(nèi)部抗原在甲型流感的所有亞型和毒株中高度保守。NP 和基質(zhì)蛋白1（M1）在被病毒感染的細(xì)胞中大量表達(dá)，T 細(xì)胞可殺死被病毒感染的細(xì)胞。ALTENBURG 等［49］發(fā)現(xiàn)，CD8+T 細(xì)胞可與多種甲型流感病毒發(fā)生反應(yīng)，在感染甲型流感病毒后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定水平的保護(hù)性免疫，以抵抗其他亞型甲型流感病毒的攻擊。QUI?ONESPARRA 等［50］發(fā)現(xiàn)，多次感染流感后，體內(nèi)的 CD8+TRM 保護(hù)性細(xì)胞會(huì)進(jìn)行累積，有助于再次感染流感時(shí)對(duì)機(jī)體進(jìn)行保護(hù)，結(jié)果表明，通過使用作用于細(xì)胞毒性T 淋巴的疫苗喚醒機(jī)體T 細(xì)胞反應(yīng)十分可行。

通過疫苗接種增強(qiáng)對(duì)流感保守抗原的T 細(xì)胞應(yīng)答是目前許多通用型流感疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)。BiondVax公司的M-001 疫苗不含任何病毒，是一種肽疫苗，具有9 個(gè)高度保守的病毒表位，這些表位來自3 種不同的病毒蛋白，包括M1（襯在病毒包膜中的基質(zhì)蛋白）、NP（包裹在病毒RNA 周圍的核蛋白）和HA 頭部的保守部分。目前M-001 疫苗正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)，前期試驗(yàn)已證實(shí)，該疫苗具有良好的安全性，疫苗的IgG 滴度最多可增加 50 倍［33］。SEEK 公司生產(chǎn)的多表位疫苗FLU-V，與Montanide ISA 51 佐劑一起使用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的免疫效果［34］。天然獲得T 細(xì)胞介導(dǎo)針對(duì)流感的免疫力是短暫的，因此在確定由疫苗誘導(dǎo)的T 細(xì)胞免疫的持續(xù)時(shí)間仍需要進(jìn)行深入研究，但通過疫苗誘導(dǎo)增強(qiáng)T 細(xì)胞的保護(hù)作用及用單一疫苗可預(yù)防所有甲型流感病毒的可能性使其成為流感疫苗研究的熱點(diǎn)。

2.3 通用型流感疫苗的佐劑及接種方式 鋁佐劑是較常用的人用疫苗佐劑，由于其存在可能會(huì)引起注射部位疼痛、肉芽腫、局部紅斑等不良反應(yīng)，因此，尋求更安全、有效的佐劑在疫苗研發(fā)中十分重要。CaPNP 佐劑可誘導(dǎo)多種病毒和細(xì)菌感染的體液免疫和細(xì)胞免疫，不會(huì)引起不良反應(yīng)［51］。陽離子脂質(zhì)體2，3-二油氧基丙基三甲基氯化銨（2，3-dioleoyloxypropyl-trimethylammonium，DOTAP）也是目前研究較多的佐劑之一，有研究發(fā)現(xiàn)，將DOTAP 作為佐劑應(yīng)用于H5N1 流感疫苗中，可顯著提高疫苗的免疫原性［52］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）激動(dòng)劑可通過促進(jìn)先天免疫反應(yīng)進(jìn)而誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)來提高疫苗效應(yīng)，LAIV 通過滴鼻的方式模擬病毒自然感染模式，可誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫來提高免疫效力，TLR3 激動(dòng)劑可通過滴鼻給藥的方式刺激黏膜免疫，具有作為通用流感疫苗佐劑的潛力。

隨著疫苗的發(fā)展，流感疫苗的使用方式也不局限于肌肉注射，微針及通過鼻黏膜免疫成為新的接種方式。微針可穿透皮膚角質(zhì)層，使疫苗快速進(jìn)入表皮和真皮，而皮膚中包含各種免疫細(xì)胞，因此通過微針導(dǎo)入疫苗也是一種有效的接種方式。有研究證實(shí)，將各種抗原形式如滅活的病毒、VLPs 等通過微針接種可提高免疫原性［53］。

3 小結(jié)與展望

流感仍對(duì)公眾健康產(chǎn)生巨大威脅，注射疫苗是目前應(yīng)對(duì)流感最有效的措施。目前，可通過添加佐劑刺激免疫原性、優(yōu)化病毒株預(yù)測(cè)手段、對(duì)免疫力低下的人群采用注射高劑量疫苗等方式來提高多價(jià)流感疫苗的有效性。針對(duì)流感病毒變異較快，疫苗生產(chǎn)周期長及保護(hù)性不足等缺點(diǎn)，通用型流感疫苗顯示出了廣闊的前景。目前通用型流感疫苗的研究方向主要在流感病毒M2 蛋白、HA 的莖部及T 細(xì)胞反應(yīng)等方向，部分通用型疫苗的研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但仍存在改進(jìn)的空間，如通用流感疫苗被要求對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群（老年人、孕婦、肥胖者）也要有保護(hù)效力。另外，對(duì)通用流感疫苗引起廣泛保護(hù)的病毒靶標(biāo)作用機(jī)制也需進(jìn)一步探索。隨著制劑技術(shù)的提高及對(duì)流感病毒研究的深入，多價(jià)流感疫苗和通用流感疫苗均得到了快速發(fā)展，如對(duì)多價(jià)流感疫苗進(jìn)行修飾改造，可提高多價(jià)流感疫苗的有效性，相信將來也可開發(fā)出廣泛預(yù)防甲型、乙型流感的通用型疫苗。