抗原設計新技術及其在疫苗中的應用和發(fā)展

李興航 綜述，楊曉明 審校

1.國家聯(lián)合疫苗工程技術研究中心，湖北武漢430207；2.武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北武漢430207；3.中國生物技術股份有限責任公司，北京100029

自1798 年首次發(fā)現(xiàn)接種牛痘可以用來防治天花開始，開啟了人類研發(fā)和應用疫苗來預防疾病的時代。過去200 多年來，疫苗的應用降低了多種傳染性疾病的發(fā)病率和死亡率。據(jù)報道，疫苗每年可減少全世界約250 萬人死亡［1］，大大減低了由傳染性疾病所帶來的公共衛(wèi)生負擔。

疫苗發(fā)展初期，是由詹納等人開創(chuàng)的研究疫苗的方法，目前被認為是傳統(tǒng)的疫苗學（也被稱作“疫苗學1.0”）［2］。他們當時并不知道病原體的具體來源及疫苗發(fā)揮作用的機制，而是通過觀察發(fā)現(xiàn)使用奶牛的膿包（牛痘）可以預防天花，并在人群中進行試驗，結果獲得了極好的效果?！耙呙纭睆拇苏Q生，這是人類研究疫苗歷史上的一座里程碑。接下來，巴斯德傳承了詹納對疫苗接種的概念，又進行了創(chuàng)新，于1885 年成功研制出第一款人用狂犬病疫苗。后來，人們總結出巴斯德研究疫苗的3 個定理：分離、滅活、注射，這開始引導研究者更加合理地設計疫苗［2］。第一代疫苗基本遵從了巴斯德的疫苗設計策略，包括天花疫苗、卡介苗（BCG）、鼠疫疫苗、百日咳疫苗等。“疫苗學 2.0”興起于 20 世紀 90 年代［3］，這個轉折點是b 型流感嗜血桿菌（haemophilus influenzae type B，Hib）和肺炎鏈球菌疫苗［4］的問世。第二代疫苗開始對病原體的致病機制有了一定的了解，并結合新的方法和技術（如遺傳學、蛋白質工程、重組DNA技術、多糖化學技術、合成生物學［5］等相關知識）對細菌和病毒成分進行分離和純化。亞單位疫苗和多糖蛋白結合疫苗即為“疫苗學2.0”時期出現(xiàn)的成果。目前的破傷風、流行性感冒、白喉、炭疽、肺炎、乙肝等疫苗均是第二代疫苗的代表。

傳統(tǒng)疫苗設計方法研制的疫苗對于乙肝、狂犬病、破傷風等疾病的控制起了很大作用，大大降低了這些疾病在人群中的感染率。但目前傳統(tǒng)研究方法在某些方面還有待進一步突破，如①無法應用于體外不可培養(yǎng)的微生物［如丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）］［6］；②無法為易發(fā)生突變的病原體［如甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）］提供廣泛的交叉保護［7］；③對于某些疾?。ㄈ绲歉餆?、瘧疾）尚不能提供很好的解決方案［8］；④無法用于機會致病菌（如金黃色葡萄球菌）［9］。

目前，基因組學、免疫組學、蛋白質組學、結構疫苗學等新興科學相繼出現(xiàn)并相互融合，共同推動了對傳統(tǒng)疫苗設計思路的創(chuàng)新［6］。這些新興學科的出現(xiàn)開創(chuàng)了疫苗設計的一個新時代—“疫苗學3.0”時代，為針對如HIV、IAV、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、登革熱病毒（Dengue virus，DENV）等病原體疫苗的設計和開發(fā)開辟了新的思路和對策。本文就抗原設計新技術及其在疫苗中的應用和發(fā)展作一綜述。

1 結構疫苗學設計疫苗的理論基礎及策略

1.1 結構疫苗學的理論基礎 由于抗原特異性所誘導的體液免疫與很多感染性疾病的保護有關［10］，一直以來，人類研發(fā)疫苗的目標之一即是要誘導出對機體具有保護作用的特異性抗體，且能在體內維持較長時間。在疫苗的抗原設計中，要想該抗原在人體內誘導出針對某病原體的特異性抗體，即需對該病原體特定分子的精確結構進行分析。于是，研究者開始將研究方向轉向抗原的結構與疫苗的關系上。

但一些病原體可通過表面殘基多樣化（如HIV）使之前研發(fā)的疫苗失去保護作用；有些病原體的保護性抗原處于一種亞穩(wěn)態(tài)的構象（如RSV），即其結構在感染過程中會發(fā)生改變，逃避由疫苗誘導的免疫應答；此外，還有些病毒的抗原（如DENV、寨卡病毒）經(jīng)免疫應答產生的抗體甚至會加重疾病，出現(xiàn)抗體介導的增強感染（antibody-dependent enhancement，ADE）現(xiàn)象。因此，迄今尚未研究出效果良好的針對RSV、HIV、DENV 等病原體的疫苗。目前研究者開始考慮是否可通過在結構上對抗原進行修飾和改造，設計出有一定理化特性的抗原表位，誘導出針對某病原體的特異性抗體。結構疫苗學（structuralvaccinology，SV）［11］應運而生，蛋白質工程技術開始被應用于疫苗抗原的設計中。

現(xiàn)有的結構生物學方法已能夠確定全病毒、病毒蛋白以及抗原-抗體復合物的結構［12］。對病原體的三維（3D）結構分析能夠分析該病原體上各抗原三級結構的信息和位置。這些結構信息可被用來解決目前阻礙疫苗開發(fā)的一些問題。運用結構疫苗學設計候選疫苗抗原的主要步驟如下［13］：①確定抗原或抗原-抗體復合物的結構；②通過分子生物學手段重新構建抗原或表位；③將重組抗原或表位應用于疫苗平臺上；④測試候選疫苗在動物模型上的安全性和有效性（圖1）。簡而言之，結構疫苗學將基因工程與高分辨率的結構分析技術相結合，使得病原體的保護性抗原成分能夠被選擇性地構建，并應用于疫苗中。

圖1 結構疫苗學中基本的方法和工具Fig.1 Basic methods and tools in structural vaccinology

1.2 結構疫苗學中抗原設計的策略及運用

1.2.1 以表位為中心的疫苗設計策略 病原體上不同的抗原表位對于機體有不同的免疫原性，即不同表位的免疫優(yōu)勢級別也不同，其中一些抗原表位可優(yōu)先激活生發(fā)中心的B 細胞［14-15］。以表位為中心的策略重點在于將免疫原中與保護性抗原成分不相關的抗原表位去除，使得B 細胞能聚焦到識別和提呈可誘導針對病原體產生保護性中和抗體的抗原表位。如流感病毒上至少有10 種病毒蛋白，但只有血凝素（hemagglutinin，HA）對疫苗的設計至關重要，目前流感疫苗所誘導的中和抗體均是針對HA 蛋白的頂部區(qū)域。但運用蛋白質工程技術有3 種方法對抗原進行設計［11］：①表位移植；②結構域最小化；③表面重構。

表位移植［11，16］是將抗原天然構象中能誘導機體產生中和抗體的表位移植至其他異源蛋白上的過程。該方法早期應用于RSV 疫苗的研發(fā)中。CORREIA 等［17］開發(fā)了一種名為 Fold From Loops（FFL）的計算方法，并設計了一種包含RSVF 蛋白抗原位點Ⅱ的蛋白質支架，使其呈現(xiàn)與RSV 晶體結構中觀察到的幾乎相同的構象，最終的結果未能在小鼠中誘導RSV 中和活性，但能在獼猴中誘導大量的中和抗體。雖然未取得理想的結果，但這些嘗試仍為以表位為中心的疫苗設計提供了寶貴的經(jīng)驗。另一個應用的實例是針對B 群腦膜炎球菌（meningococcus，MenB）疫苗的抗原設計。HOLLINGSHEAD 等［18］基于結構設計了一種嵌合抗原（Chimeric antigens，ChAs），用 H 因子結合蛋白（factor H binding protein，fHbp）作為蛋白質支架，在支架上嵌合了來自整合膜蛋白PorA中的VR2 表位。PorA 具有較高的免疫原性，其上的VR2 是一個可在人和動物模型中誘導產生殺菌性抗體的表位［19-20］。最后將這種嵌合抗原免疫小鼠模型，在小鼠體內成功誘導出了針對fHbp 和PorA 蛋白的抗體。

結構域最小化［11］是將含多個結構域的蛋白質改造為僅攜帶中和抗原表位的單一結構域的過程。如運用該原理設計的通用流感疫苗，是將流感病毒表面HA 頭部下面較為保守的的莖部暴露出來，使體液免疫應答能集中于此［21-22］。YASSINE 等［23］首先對流感病毒的HA 在3D 結構上進行分析，借助計算機技術對HA 蛋白通過6 次連續(xù)改造，構建出mini-HA 莖（mini-HA stem）抗原，使得莖部保守區(qū)占整個HA 表面面積的比例由最初的37%顯著提升為94%。在雪貂和小鼠模型上進行免疫，均可檢測到針對流感病毒的廣譜中和抗體。

表面重構［11］是將與能誘導保護性免疫應答不相關的表位改變?yōu)榉莾?yōu)勢表位的過程。如在HIV疫苗開發(fā)遇到的一個問題：HIV 包膜上的許多表位誘導非中和抗體，這些非中和抗體會阻礙中和抗體發(fā)揮作用［24］。WU 等［25］使用 HIV-1 完整包膜結構的信息開發(fā)了一種表面被重新設計的糖蛋白，這些糖蛋白誘導的免疫應答可特異性地針對初始CD4受體結合位點保守位點的抗原。NACHBAGAUER等［26］研究了一種嵌合的 HAs（cHA），將一種不在人體群中循環(huán)的流感病毒的 HA 頭部（H5、H8、H9）與流感流行株的HA 莖部（H1）進行組合（圖2），可選擇性地增強誘導對莖部結構的抗體。并在雪貂動物模型中成功誘導了廣泛的交叉反應性抗體。此外還發(fā)現(xiàn)，用這種嵌合抗原初次免疫，再用裂解流感疫苗進行加強免疫，獲得了比連續(xù)接種兩次裂解疫苗更優(yōu)異的針對H1N1 流感病毒的保護效果。

以表位為中心的設計策略中，表位移植、結構域最小化和表面重構3 種方法可根據(jù)不同病原體的抗原僅使用一種策略，也可聯(lián)合多個策略使用以提高抗原的免疫原性。

圖2 嵌合HA 抗原結構圖Fig.2 Structure of chimeric HA antigen

1.2.2 穩(wěn)定抗原的天然構象 病原體感染人體后，其中的某些蛋白質可能會發(fā)生構象的改變，而構象穩(wěn)定技術可將這類表位固定為可誘導保護性抗體的狀態(tài)。如RSV 的F 蛋白，在感染過程中從亞穩(wěn)定性的融合前構象重新排列成高度穩(wěn)定的融合后構象（圖3［13］）。而融合前 F 蛋白表位被視作 RSV 疫苗及藥物研究的重要靶點，因為該表位能夠誘導人體產生針對RSV 的保護性中和抗體來預防RSV 感染［27-28］。ROSSEY 等［29］、GRAHAM 等［30］和 MCLELLAN 等［31］通過構象穩(wěn)定技術將融合前F 蛋白固定。其大致步驟是將T4-噬菌體纖蛋白三聚化結構域（“foldon”）添加至 RSV F 膜外結構域［32］的 C-末端，并結合融合前特異性D25 抗體。并與其他方法同時運用（包括引入半胱氨酸對、添加二硫鍵、空腔填充）來穩(wěn)定其結構。用該候選抗原免疫動物后，在動物體內檢測到了較高的保護性抗體滴度［33］。

圖3 RSV 融合前（A）后（B）F 蛋白構象示意圖Fig.3 Confirmation of F protein of RSV before（A）and after（B）fusion

1.2.3 構建模擬病原體的B 細胞表位 一些病原體逃避宿主免疫的機制是序列多樣化，如HIV 的包膜蛋白、流感病毒的HA 蛋白。盡管這些位點在疫苗的設計中被非常重視，但由于其多樣性，很難研發(fā)出單一的疫苗來預防這種疾病。為此，可通過設計模擬病原體的B 細胞表位，并在該表位中引入某抗原的共有序列以誘導合成一種廣譜的中和抗體。以A 型流感病毒為例，目前上市的疫苗由于交叉保護水平低，必須每年根據(jù)預測當年流行株進行更新［34］。因此有個假設，在多個亞型的流感病毒HA 蛋白的基因序列中，發(fā)掘出一段相同或相似的序列片段，將這部分序列對應的蛋白作為疫苗候選抗原，就能研究一種通用流感疫苗。LADDY 等［35］在 H5N1 病毒的研究中報道了一種獲取流感病毒表面HA 蛋白的共有序列的方法，并在小鼠、雪貂、非人類的靈長類動物3 種動物模型中得到了針對H5N1 流感亞型不同病毒株的中和抗體。之后，YAN 等［36］也報道了一種微共有序列（micro-consensus）應用于疫苗領域的案例，他們通過對近25 年來流行的H1 流感亞型的HA 基因序列進行分析鑒定，得出4 個主要的基因簇，并基于此設計出包含這4 個主要基因簇的微共有序列的DNA 疫苗。在小鼠、豚鼠和非人類的靈長類動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，該DNA 疫苗能誘導出對近10 年流行的H1 亞型流感病毒具有保護性的廣譜中和抗體。

1.2.4 多價納米顆粒 與單體抗原不同，多價納米顆?？煽焖俅┧笾翞V泡樹突狀細胞（follicle dendritic cell，F(xiàn)DC）網(wǎng)絡，然后觸發(fā)補體的甘露糖結合凝集素（mannose-binding lectin，MBL）途徑和免疫原聚糖依賴性方式在生發(fā)中心集中誘導免疫應答。如針對HIV-1，TOKATLIAN 等［37］檢測了兩種 HIV 包膜抗原作為可溶性“單聚體”或蛋白質納米顆粒在動物模型中的免疫效果，分別為gp120 的種系靶向工程外部結構域（eOD-GT8，簡稱 eOD）和gp140 包膜三聚體（MD39）。與可溶性免疫原相比，納米顆粒形式的eOD 和MD39 免疫小鼠能誘導更高的IgG 滴度（高達90 倍）。應用納米顆粒的其他候選疫苗抗原在動物模型中的研究結果也表明，與單體抗原相比，經(jīng)納米顆粒修飾的免疫原能更有效地激活低親和力的前體 B 細胞［38-40］，增強的濾泡輔助 T 細胞（follicular T-helper-cell，Tfh）誘導與生發(fā)中心（germinalcenter，GC）反應，并增強中和抗體的誘導［41］。總之，使用納米顆粒作為骨架，并以此為基礎對抗原進行裝載和修飾已被證明是一種抗原設計的可行手段。

1.3 結構疫苗學的局限性 目前來看，結構疫苗學具有巨大的潛力，但也有一些局限性。首先，目前研究者尚未完全掌握由病毒誘導的機體免疫應答過程中的結構和免疫學知識，該技術可能會因此受到影響。如在DENV 包膜蛋白的DⅢ結構域上有一個結構保守、對溫度敏感、隱蔽的表位，但該表位在DENV 的包膜蛋白 E 抗原上很難被發(fā)現(xiàn)［42］。LI 等［42］用3E31 抗體阻止了E 抗原介導的膜融合，從而間接證明該抗體識別了DENV 表面E 抗原上尚未了解的中間構象。

其次是X 射線晶體學只能分析抗原-抗體復合物的靜態(tài)結構［43］。但當抗原-抗體相互作用時，它們之間是相互適應的動態(tài)過程。人們無法通過靜態(tài)結構很好地推測其動態(tài)過程中的細節(jié)。因此，通過該技術觀察到的特定表位結構不一定能對應于所設計出的產生抗體的表位，這些表位不一定是應用在疫苗中的最佳表位。VAN 等［44］發(fā)現(xiàn)，病毒的三聚體Env 具有巨大的可塑性和結構靈活性，因此很難確定Env 的哪些結構域是最有可能誘導保護性抗體的最佳候選疫苗免疫原。

最后，結構疫苗學的應用目前局限于重組蛋白疫苗、肽疫苗和病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗的設計，這些疫苗平臺的免疫原性有待提升。因此，將結構疫苗學與其他技術結合運用也是未來可以考慮的發(fā)展方向。目前的結構疫苗學非常重視B細胞介導的體液免疫，但對T 細胞介導的細胞免疫方面尚未深入研究，未來的發(fā)展可考慮對疫苗誘導的細胞免疫進行研究。

2 疫苗組學在候選抗原發(fā)現(xiàn)和篩選中的應用

目前已進入一個大數(shù)據(jù)的時代，支持高通量技術的組學學科（如基因組學和后基因組學［45-46］，包括轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、細胞組學、免疫組學、信息組學等），能生成和處理大量的數(shù)據(jù)和信息。于是，疫苗組學的概念被提出，這為疫苗的候選抗原發(fā)現(xiàn)及篩選開辟了另一條途徑。

反向疫苗學（reverse vaccinology，RV）是其的一個代表，而且已被證明是非常有效的手段。MenB 疫苗的抗原設計就是運用反向疫苗學策略對疫苗候選抗原進行選擇。該策略首先通過對病原體進行全基因測序，并對基因組所編碼的所有蛋白質進行克隆，再對每種蛋白質進行鑒定和篩選。由于該過程涉及動物免疫，待測抗原的數(shù)量越多，整個過程將會非常繁雜。如在MenB 的疫苗抗原篩選中，PIZZA 等［47］首先從MenB 基因組編碼的總計2 000 余種蛋白質中篩選出570 種表面蛋白（因為他們認為只有表面抗原才可能成為保護性抗原），再對這570 種蛋白質逐個進行篩選鑒定，最后確定出3 種蛋白作為疫苗候選抗原。盡管只對570 種蛋白進行了篩選，但整個過程仍非常費時費力。

為了避免這些費時的工作，需要新的生物信息學工具和方法來更好地整合來自組學實驗的大量數(shù)據(jù)，使得從單組學向多組學的轉變成為可能。如計算疫苗學［48］和免疫信息學［49］利用算法，可讓人們僅關注整個病原體中部分篩選過的抗原，縮減整個篩選中耗時和勞動密集的步驟，從而降低成本。

DOROSTI 等［50］運用疫苗組學策略研究了一種肺炎鏈球菌亞單位疫苗，包含了一些保守毒力蛋白的混合物，打破了常規(guī)用莢膜多糖作為抗原的傳統(tǒng)疫苗。該研究分為3 步：首先，檢索了肺炎鏈球菌PspA、CbpA、PhtD 和 PiuA 的氨基酸序列，這些表位來源于不同數(shù)據(jù)庫的篩選（如IED8、PROPRED、RANKPED 和 MHCPRED）。PspA 和 PcbA 用作 CTL 表位刺激劑，PhtD 和PiuA 用作輔助表位，并使用PorB蛋白作為TLR2 激動劑來增加疫苗的免疫原性。然后通過適當?shù)陌被釋⑤o助抗原、靶向抗原和TLR激動劑融合。并對其理化、結構和免疫學特性進行評估。最后，用 Jcat（http：／ ／ www.jcat.de）對輸出DNA 序列進行優(yōu)化和反向翻譯，并在大腸埃希菌中克隆和表達。還可通過大數(shù)據(jù)信息對特定病原體的基因進行分析，以預測其具有跨膜結構域的蛋白質、前導肽、膜錨定結構域等。MASIGNANI 等［51］就是基于此在腦膜炎奈瑟球菌表面發(fā)現(xiàn)了一種新的脂蛋白GNA1870，其可誘導機體產生保護性的殺菌抗體。

為了進一步縮減人力物力成本，使待測候選抗原的范圍再次縮小，ALTINDIS 等［52］提出一種“保護組學分析”的策略。他們不再關注蛋白質定位，而是將其計算分析集中在蛋白質的生物學作用和功能上。他們認為，那些能誘導機體產生保護性抗體的蛋白質抗原在結構或功能上具有某種相同的特性。這種策略可大大減少實驗中候選抗原的數(shù)量，大概僅為某種病原體全部蛋白數(shù)量的3%。不僅如此，由于該策略基于的是抗原的結構與功能進行篩選，而并不局限抗原所在的位置，保護組學分析能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)研究方法關注不到的一些胞內抗原。

3 展 望

傳統(tǒng)研究疫苗的方法是對病原體進行滅活或減毒，后來免疫學和分子生物學等學科的發(fā)展有力地擴充了疫苗的研究策略。目前市獸疫苗均是基于這些策略研究的，有效控制了人類多種傳染病的傳播，具有十分重要的社會效益和經(jīng)濟價值。但針對艾滋病、登革熱、瘧疾等對人類生命安全有重大威脅傳染病的病原體，目前尚未研發(fā)出有效的疫苗。此外，不斷有新的傳染病出現(xiàn)，對疫苗的研發(fā)也是一種挑戰(zhàn)，如之前發(fā)生在中國的SARS 以及最近在非洲暴發(fā)的埃博拉疫情，造成了大量生命和財產損失。因此，在肯定傳統(tǒng)疫苗作用的同時，新型疫苗的研發(fā)也迫在眉睫。

目前，結構疫苗學和疫苗組學等疫苗設計新策略的發(fā)展，對于傳統(tǒng)疫苗設計策略難以解決的問題已有了新的解決思路。針對的病原體也不局限于文中提到的，如最近針對瘧疾［53］、霍亂弧菌［54］、馬爾堡病毒［55］的疫苗設計均用到了上述提到的新的抗原設計策略。

由于目前疫苗開發(fā)的大都是由抗體以及其靶標的結構所驅動的，但不同病原體使用不同的策略來逃避保護性的免疫應答，因此，疫苗設計策略必須根據(jù)對每種疾病中保護性抗體如何發(fā)揮其功能，以及特定抗原如何誘導免疫進行調整［56］。并可能需要結合多種策略來設計針對某一種病原體的疫苗，而不是單獨的依賴某一項技術或策略。另外，在應用新技術對下一代疫苗進行設計的同時，不僅要考慮其抗原的設計，還要考慮抗原的投遞途徑［57-58］，疫苗在運輸中抗原的穩(wěn)定性［13］等問題，在研發(fā)出更穩(wěn)定、高效的新一代疫苗的同時，能夠讓更多的人接種到疫苗。