乳香、沒藥揮發(fā)油促九分散方中生物堿類成分的HaCaT細(xì)胞攝取及其機(jī)制研究

高 玲，黃詩雨，陳麗華，李瑛瑛，管詠梅，劉麗麗，朱衛(wèi)豐

乳香、沒藥揮發(fā)油促九分散方中生物堿類成分的HaCaT細(xì)胞攝取及其機(jī)制研究

高 玲，黃詩雨，陳麗華*，李瑛瑛，管詠梅，劉麗麗，朱衛(wèi)豐

江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

研究九分散中乳香、沒藥揮發(fā)油促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT攝取馬錢子堿、士的寧及鹽酸麻黃堿的作用及其機(jī)制。采用CCK-8法檢測乳香、沒藥揮發(fā)油單用/藥對(duì)與九分散方中馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿配伍對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響；采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）定量分析法結(jié)合BCA蛋白試劑盒測定在乳香、沒藥揮發(fā)油作用下HaCaT細(xì)胞對(duì)3種生物堿（馬錢子堿、士的寧及鹽酸麻黃堿）細(xì)胞攝取的影響；以DiBAC4（3）為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀測定乳香、沒藥揮發(fā)油對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位的影響。不同乳香、沒藥揮發(fā)油均對(duì)3種生物堿有一定促透作用，且對(duì)脂溶性成分馬錢子堿、士的寧的促透效果較水溶性成分鹽酸麻黃堿好。乳香、沒藥揮發(fā)油分別作用于DiBAC4（3）標(biāo)記的HaCaT細(xì)胞后，可降低HaCaT細(xì)胞膜電位，隨著乳香、沒藥揮發(fā)油濃度增加，細(xì)胞膜電位熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，具有濃度相關(guān)性，表現(xiàn)出類似氮酮的作用方式。九分散中乳香、沒藥揮發(fā)油均可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞攝取3種生物堿，促進(jìn)機(jī)制可能通過影響皮膚表面負(fù)電荷而改變皮膚活性表皮屏障作用，從而有利于藥物透過皮膚活性表皮層，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探明。

九分散；乳香揮發(fā)油；沒藥揮發(fā)油；馬錢子堿；士的寧；鹽酸麻黃堿；細(xì)胞膜電位

九分散出自清代費(fèi)山壽《急救應(yīng)驗(yàn)良方》，歷版《中國藥典》均有收載，其處方由馬錢子、麻黃、乳香、沒藥以1∶1∶1∶1配比組成[1]，具有活血散瘀、消腫止痛之功效，內(nèi)服或外用治療跌打損傷、瘀血腫痛。臨床研究表明，九分散用于治療痹癥療效顯著[2-4]，但由于處方中馬錢子有毒性，用量較大，且久服易引起中毒，而外用則可降低毒性，且藥物不經(jīng)胃、腸、肝可直接到達(dá)病灶部位而發(fā)揮療效，但九分散外用時(shí)以酒調(diào)敷于患處，其有效成分不易溶出且不易透過皮膚被吸收[5]。為了將九分散處方制成合適的經(jīng)皮給藥制劑，需對(duì)其透皮吸收機(jī)制進(jìn)行深入研究，以選擇適合的劑型。

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT是由成人表皮細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化而來的細(xì)胞系，具有永生性，并與角質(zhì)形成細(xì)胞具有相似的增殖、分化特性，遺傳特性穩(wěn)定[6]，常被用于構(gòu)建組織工程皮膚進(jìn)行皮膚屏障功能的評(píng)價(jià)，同時(shí)已成為研究外用透皮用藥經(jīng)皮滲透能力的一種重要的細(xì)胞模型。

現(xiàn)代研究表明乳香、沒藥中的揮發(fā)油類成分具有一定的促滲作用[7]。課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)乳香、沒藥揮發(fā)油對(duì)川芎中阿魏酸成分具有一定的透皮促滲作用[8]，且體外Franz擴(kuò)散池法及在體微透析透皮實(shí)驗(yàn)均表明乳香、沒藥揮發(fā)油對(duì)于馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿的經(jīng)皮滲透確實(shí)存在良好的促透作用，且在體給藥時(shí)，其促透作用表現(xiàn)得更加明顯。本實(shí)驗(yàn)以表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT為皮膚活性表皮模型，選擇馬錢子中馬錢子堿、士的寧與麻黃中鹽酸麻黃堿作為研究對(duì)象，從細(xì)胞和分子水平多層次系統(tǒng)探討乳香、沒藥揮發(fā)油與3種生物堿配伍的透皮作用及其機(jī)制，為九分散經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及新劑型的深入研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人永生化人永生滑角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT（上海富衡生物科技有限公司）。

1.2 藥材

乳香、沒藥藥材購于江西江中中藥飲片有限公司（批號(hào)分別為181028、181217，于2019年3月20日購買），由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳志瑰副教授分別鑒定為橄欖科植物乳香樹Birdw.樹皮滲出的樹脂及橄欖科植物地丁樹Engl.的干燥樹脂。

1.3 藥品與試劑

無水硫酸鈉（分析純，批號(hào)20180322，西隴化工股份有限公司）；馬錢子堿對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)17121401）、士的寧對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)19032003），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；鹽酸麻黃堿對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，批號(hào)7U9X-XPOG，中國食品藥品檢定研究院）；氮酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，批號(hào)RH137670，上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；CCK-8溶液（批號(hào)MAO218-L- Apr-25E，大連美侖生物科技有限公司）；胎牛血清（批號(hào)11G187，上海伊科賽生物制品有限公司）；0.25% EDTA-胰蛋白酶、DMEM高糖培養(yǎng)基、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、無鈣鎂HBSS、非必需氨基酸購于北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白分析試劑盒（批號(hào)20200602，北京索萊寶科技有限公司）；TritonX-100（批號(hào)20190723H，范德北京生物科技有限公司）；DiBAC4（3）熒光探針（批號(hào)519A0101，金克隆北京生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜純，批號(hào)75-05-8，上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；甲酸（色譜純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)LR40U51，北京百靈威科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（6孔板、96孔板）、T-25培養(yǎng)瓶。

1.4 儀器

SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Forma3111二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；TS100-F倒置顯微鏡，日本Nikon公司；BD FACSVerse高速分選型流式細(xì)胞儀，美國BD公司；MK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；AB Sciex Triple Quad? 4500液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB Sciex公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；十萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；KQ3200E超聲波清洗器，昆明市超聲儀器有限公司；TDZ4A-WS低速臺(tái)式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)有限公司；3-18K高速冷凍離心機(jī)，德國SIGMA公司。

2 方法

2.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)

將HaCaT細(xì)胞接種于T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）的高糖型DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37 ℃、相對(duì)濕度95%，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代數(shù)在50代以內(nèi)。

2.2 揮發(fā)油的提取

乳香、沒藥揮發(fā)油均采用《中國藥典》2020年版四部揮發(fā)油提取甲法[9]提取，得淡黃油狀溶液，無水硫酸鈉脫水后密封避光保存?；旌蠐]發(fā)油為等體積乳香、沒藥揮發(fā)油物理混合物；藥對(duì)揮發(fā)油為等質(zhì)量乳香、沒藥生藥材混合后采用上述方法提取，得淡黃油狀溶液，無水硫酸鈉脫水后密封避光保存，備用。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿對(duì)照品1 mg于1.5 mL離心管中，加入0.1% DMSO超聲溶解，再加入適量DMEM潤洗轉(zhuǎn)移至量瓶中，并用DMEM定容，混勻，分別配制成40、100、40 μg/mL的儲(chǔ)備液，使用0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌，4 ℃避光保存。用DMEM培養(yǎng)基將馬錢子堿儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度依次為36、18、9、4.5、2.25、1.125 μg/mL的溶液，將士的寧儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度依次為48、24、12、6、3、1.5 μg/mL的溶液，將鹽酸麻黃堿儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度依次為40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的溶液，備用。

2.3.2 乳香、沒藥揮發(fā)油溶液的配制 分別精密稱取乳香、沒藥揮發(fā)油10 mg于1.5 mL離心管中，加入1% DMSO超聲溶解，再加入適量DMEM潤洗轉(zhuǎn)移至量瓶中，并用DMEM定容，混勻配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，使用0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌，4 ℃避光保存。用DMEM培養(yǎng)基將乳香、沒藥揮發(fā)油儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度依次為0.80、0.40、0.20、0.10、0.05、0.02 mg/mL的溶液，備用。

2.3.3 乳香、沒藥藥對(duì)/混合揮發(fā)油溶液的配制 精密稱取乳香、沒藥藥對(duì)/混合揮發(fā)油10 mg于1.5 mL離心管中，加入1%DMSO超聲溶解，再加入適量DMEM潤洗轉(zhuǎn)移至量瓶中，并用DMEM定容，混勻配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液，使用0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌，4 ℃避光保存。用DMEM培養(yǎng)基將乳香、沒藥藥對(duì)/混合揮發(fā)油儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度依次為0.32、0.16、0.10、0.08、0.04、0.02 mg/mL的溶液，備用。

2.3.4 氮酮溶液的配制 精密稱取氮酮1 mg于1.5 mL離心管中，加入1% DMSO超聲溶解，再加入適量DMEM潤洗轉(zhuǎn)移至量瓶中，并用DMEM定容，混勻配制成0.1 mg/mL的儲(chǔ)備液，使用0.22 μm的微孔濾膜濾過除菌，4 ℃避光保存。用DMEM培養(yǎng)基將氮酮儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度依次為96、48、24、12、6、3 μg/mL的溶液，備用。

2.3.5 混合生物堿溶液的配制 根據(jù)馬錢子堿、士的寧經(jīng)皮中毒劑量及九分散中馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿這3種成分的比例[1]，設(shè)置混合生物堿中馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿的比例為1∶2∶1。取“2.3.1”項(xiàng)下馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿儲(chǔ)備液按照1∶2∶1比例，以士的寧的安全濃度為參比，用DMEM培養(yǎng)基將混合生物堿稀釋成質(zhì)量濃度依次為12、6、3、1.5、0.75、0.375 μg/mL的溶液，備用。

2.3.6 不同揮發(fā)油及氮酮與3種生物堿混合溶液的配制 乳香含揮發(fā)油3%～8%，沒藥含揮發(fā)油2.5%～9%[10]，按照九分散中馬錢子、麻黃、乳香、沒藥的比例，設(shè)置乳香/沒藥、馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿的比例為3∶1∶2∶1。精密稱取不同揮發(fā)油及氮酮3 mg于1.5 mL離心管中，加入0.1% DMSO超聲溶解，再加入適量DMEM潤洗轉(zhuǎn)移至量瓶中，并用DMEM定容，混勻配制成120 μg/mL的儲(chǔ)備液。按照3∶1∶2∶1的比例與3種生物堿混合，再用DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成“2.3.1”“2.3.5”項(xiàng)下含生物堿質(zhì)量濃度溶液，備用。

2.4 CCK-8法測定HaCaT細(xì)胞存活率

待T-25培養(yǎng)瓶中HaCaT細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，除去上層培養(yǎng)液，用無鈣鎂HBSS清洗2次，待1 mL 0.25%胰酶消化后加入4 mL完全培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞并加入新鮮完全培養(yǎng)液制成HaCaT細(xì)胞懸浮液，以10×104/mL細(xì)胞密度S型接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，并設(shè)置不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液空白組和含細(xì)胞懸液對(duì)照組，待細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，HBSS溶液清洗2次后，給藥組分別加入“2.3”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度及種類的藥物溶液200 μL，空白組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組加入含0.1%（生物堿與揮發(fā)油混合配制）或1%（單獨(dú)的揮發(fā)油及氮酮）DMSO的DMEM培養(yǎng)基。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液后，每孔再加入100 μL的10% CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度（），計(jì)算細(xì)胞存活率，當(dāng)存活率大于90%時(shí)，可認(rèn)為該藥物濃度對(duì)細(xì)胞無毒性作用。

細(xì)胞存活率＝(給藥－空白)/(對(duì)照－空白)

2.5 LC-MS/MS結(jié)合BCA蛋白試劑盒測定HaCaT細(xì)胞對(duì)3種生物堿的攝取量[11]

LC-MS/MS定量分析法色譜條件：色譜柱為ACE UltraCore Super C18100A（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序：0～1 min，6% B；1.0～2.5 min，6%～15% B；2.5～3.5 min，15%～17% B；3.5～3.6 min，17%～95% B；3.6～4.5 min，95% B；4.5～4.6 min，95%～6% B ；4.6～6 min，6% B。進(jìn)樣量為2 μL，體積流量0.3 mL/min，柱溫30 ℃。

分別精密稱取3種生物堿1 mg，置于離心管中，加入0.1% DMSO助溶，用甲醇定容至10 mL，即得100 μg/mL各對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液用HBSS進(jìn)行稀釋，加入內(nèi)標(biāo)（甲硝唑，1 ng/mL）得質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 ng/mL的馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿溶液；進(jìn)樣量為2 μL。以馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿和甲硝唑峰面積之比（）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，加權(quán)后得其回歸方程：馬錢子堿＝0.150 2－0.108（2＝0.999 6），士的寧＝0.356 5－0.137 9（2＝0.999 9），鹽酸麻黃堿＝4.798＋0.248 9（2＝0.998 0）。結(jié)果表明，馬錢子堿在0.39～200 ng/mL、士的寧在0.2～200 ng/mL、鹽酸麻黃堿在0.2～100 ng/mL與峰面積之比呈良好的線性關(guān)系。

以細(xì)胞攝取的馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿為指標(biāo)，設(shè)置不同揮發(fā)油組、溶劑對(duì)照組（不含揮發(fā)油的等濃度的生物堿溶液），定量研究在不同揮發(fā)油作用下單獨(dú)給藥（含單一生物堿）、共同給藥（3種生物堿混合）時(shí)馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿的細(xì)胞攝取量。調(diào)整HaCaT細(xì)胞密度為4×105/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，用無鈣鎂的HBSS清洗2次，分別加入3 μg/mL馬錢子堿及其與9 μg/mL不同揮發(fā)油的混合溶液、6 μg/mL士的寧及其與9 μg/mL不同揮發(fā)油的混合溶液、3 μg/mL鹽酸麻黃堿及其與9 μg/mL不同揮發(fā)油的混合溶液，以及3種生物堿混合溶液與9 μg/mL不同揮發(fā)油的混合溶液各2 mL，同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組，給藥4 h后，吸去藥液，用無鈣鎂的HBSS清洗2次，加入1 mL HBSS，冰上操作，用細(xì)胞刮刀輕輕刮下細(xì)胞，再加0.5 mL HBSS清洗至1.5 mL離心管中，2500 r/min離心5 min，除去上清液，加入200 μL含0.1% TritonX-100的HBSS溶液裂解細(xì)胞，冰上裂解20 min，13 000 r/min高速離心10 min后，取上清液。一部分細(xì)胞裂解液用BCA蛋白試劑盒測定細(xì)胞蛋白含量；另外一部分采用LC-MS/MS測生物堿含量，精密吸取100 μL細(xì)胞裂解液于1.5 mL離心管中，加入2 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，置于混合器中渦旋30 s混勻，16 000 r/min離心10 min，吸取100 μL上清液測定。計(jì)算單位蛋白中藥物攝取量，結(jié)果以ng藥物/mg蛋白表示。

2.6 細(xì)胞膜電位的測定[12]

采用流式細(xì)胞儀測定乳香、沒藥揮發(fā)油及陽性促透劑氮酮對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位的影響。將密度為4×105/mL細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，設(shè)置空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)基）、對(duì)照組（含1% DMSO培養(yǎng)基）及低、中、高（0.05、0.10、0.20 mg/mL）質(zhì)量濃度乳香揮發(fā)油組、沒藥揮發(fā)油組、藥對(duì)揮發(fā)油組及混合揮發(fā)油組和氮酮（0.001 5、0.003、0.006 mg/mL）組，待細(xì)胞貼壁24 h后分別加入2 mL對(duì)應(yīng)藥物，置CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，用HBSS清洗2次，用0.5 mL胰蛋白酶消化、離心，用HBSS稀釋并調(diào)整細(xì)胞密度1×106/mL，離心去除上清液后加入500 μL DiBAC4（3）（5 μg/mL）熒光探針溶液，避光37 ℃水浴孵育0.5 h，離心后棄上清液，用HBSS清洗2次后再用0.5 mL HBSS分散，吹勻過細(xì)胞濾網(wǎng)，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞膜電位測定，參數(shù)設(shè)置：激發(fā)光波長488 nm，接收波長530 nm，用未經(jīng)熒光物質(zhì)孵育的HaCaT細(xì)胞調(diào)零。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 乳香、沒藥揮發(fā)油對(duì)HaCaT細(xì)胞存活率的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～3所示。乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、藥對(duì)揮發(fā)油、混合揮發(fā)油、氮酮、3種生物堿均對(duì)HaCaT細(xì)胞存在明顯細(xì)胞毒作用，且呈濃度相關(guān)性，對(duì)細(xì)胞無毒的質(zhì)量濃度范圍：乳香揮發(fā)油為0～0.1 mg/mL，沒藥揮發(fā)油為0～0.2 mg/mL，藥對(duì)揮發(fā)油為0～0.1 mg/mL，混合揮發(fā)油為0～0.1 mg/mL，氮酮為0～0.003 mg/mL，馬錢子堿為0～18 μg/mL，士的寧為0～12 μg/mL，鹽酸麻黃堿為0～20 μg/mL。在揮發(fā)油的安全濃度下，3種生物堿與不同揮發(fā)油無論是單獨(dú)給藥還是混合給藥，乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、藥對(duì)揮發(fā)油、混合揮發(fā)油均使3種生物堿的無毒范圍呈不同程度地下降。根據(jù)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合九分散的配伍，設(shè)置馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿的質(zhì)量濃度分別為3、6、3 μg/mL，乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、藥對(duì)揮發(fā)油、混合揮發(fā)油的質(zhì)量濃度為9 μg/mL對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生毒性，以此質(zhì)量濃度進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。

3.2 不同揮發(fā)油對(duì)單獨(dú)給藥及共同給藥時(shí)馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿在體外細(xì)胞攝取的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4～6所示，單獨(dú)給藥時(shí)，與溶劑組比較，乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、藥對(duì)揮發(fā)油及混合揮發(fā)油組細(xì)胞中3種生物堿的量均明顯增加（＜0.01），說明不同揮發(fā)油均對(duì)3種生物堿有一定促透作用，促透倍數(shù)均大于2。共同給藥時(shí)，與溶劑組比較，乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油、藥對(duì)揮發(fā)油及混合揮發(fā)油組細(xì)胞中3種生物堿的量均明顯增加（＜0.01），促透倍數(shù)均大于1。與單獨(dú)給藥比較，共同給藥各揮發(fā)油促透倍數(shù)顯著性下降（＜0.01），這與課題組前期體外擴(kuò)散池、在體微透析的結(jié)果一致，說明3種生物堿共存時(shí)確實(shí)彼此間存在一定的影響。

圖1 不同揮發(fā)油及氮酮對(duì)HaCaT細(xì)胞的毒性 (n= 6)

圖2 3種生物堿單獨(dú)與不同揮發(fā)油混合對(duì)HaCaT細(xì)胞的毒性(n= 6)

圖3 混合生物堿與不同揮發(fā)油混合對(duì)HaCaT細(xì)胞的毒性(n= 6)

與溶劑組比較：**P＜0.01，圖5同

圖5 3種生物堿共同給藥時(shí)不同揮發(fā)油對(duì)其細(xì)胞攝取量的影響(n= 6)

與乳香組比較：aP＜0.05 aaP＜0.01；與沒藥組比較：bP＜0.05 bbP＜0.01；與藥對(duì)組比較：cP＜0.05 ccP＜0.01；與混合組比較：dP＜0.05 ddP＜0.01；與單獨(dú)給藥方式比較：**P＜0.01

3.3 不同揮發(fā)油對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位的影響

結(jié)果如圖7所示，空白組與對(duì)照組之間熒光強(qiáng)度未表現(xiàn)出明顯差異，說明1% DMSO（對(duì)照組）作為乳香揮發(fā)油、沒藥揮發(fā)油和氮酮的溶劑對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位沒有顯著影響。值得注意的是，角質(zhì)細(xì)胞緊密連接外具有類似于上皮細(xì)胞的固定負(fù)電位，相關(guān)經(jīng)皮促透劑可與這些負(fù)電荷發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)藥物向皮膚深層部位轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。乳香低濃度組對(duì)HaCaT細(xì)胞膜電位沒有顯著性影響，但隨著濃度增加，細(xì)胞膜電位熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)并表現(xiàn)出顯著性差異（＜0.01），表明氮酮及乳香揮發(fā)油可以降低HaCaT細(xì)胞的膜電位。沒藥、藥對(duì)、混合的低、中、高濃度組均能顯著降低HaCaT細(xì)胞的膜電位（＜0.01）。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

4 討論

九分散是一種用于治療痹癥的中成藥，目前廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等，具有確切療效，但久服易中毒，外敷透皮性差。將九分散處方制成合適的透皮制劑，可以直接用于局部發(fā)揮藥效，避免口服給藥發(fā)生的肝首過效應(yīng)和胃腸道的影響，減少用藥次數(shù)以及靈活調(diào)節(jié)給藥劑量，從而降低藥物毒性作用[14]，使其發(fā)揮出更好的療效，但方中各藥味相互作用機(jī)制和作用方式尚待探明。本研究選擇馬錢子中馬錢子堿、士的寧生物堿與麻黃中鹽酸麻黃堿生物堿作為研究對(duì)象，探討乳香、沒藥揮發(fā)油對(duì)這3種生物堿的HaCaT細(xì)胞攝取促進(jìn)作用及其相關(guān)機(jī)制，從而為九分散外用制劑的開發(fā)提供參考。同時(shí)對(duì)乳香沒藥揮發(fā)油的促透機(jī)制進(jìn)行了探討，為乳香、沒藥揮發(fā)油的使用提供依據(jù)。

揮發(fā)油類成分是乳香、沒藥的主要有效成分，乳香、沒藥含有烯類、醛類、酸類等揮發(fā)油，其主要揮發(fā)油成分乙酸辛酯具有顯著的促透作用[15]。揮發(fā)油屬天然物質(zhì)，其毒性低于化學(xué)促透劑，對(duì)親水性和親脂性藥物均有較好的促滲效果，CCK-8毒性實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，乳香、沒藥揮發(fā)油單用及配伍的毒性均低于氮酮，對(duì)馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿均具有一定的促滲透作用，且對(duì)脂溶性的馬錢子堿、士的寧促透效果好于水溶性的鹽酸麻黃堿，考慮乳香、沒藥揮發(fā)油為兩親性天然促透劑。對(duì)比生物堿單獨(dú)給藥與按處方比例共同給藥2種方式的揮發(fā)油促透倍數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同揮發(fā)油對(duì)馬錢子堿、士的寧、鹽酸麻黃堿的單獨(dú)給藥的促透倍數(shù)均在共同給藥時(shí)出現(xiàn)顯著性下降，推測這3種生物堿在共同經(jīng)皮促透過程中或存在互相干擾。

皮膚角質(zhì)細(xì)胞間連結(jié)處具有固定負(fù)電荷，文獻(xiàn)研究顯示[12]，當(dāng)一些經(jīng)皮促透劑與這些負(fù)電荷發(fā)生相互作用時(shí)，可促進(jìn)藥物向皮膚深層部位轉(zhuǎn)運(yùn)而利于藥物的透皮吸收。乳香、沒藥揮發(fā)油單用及藥對(duì)混合均可降低HaCaT細(xì)胞的膜電位，表現(xiàn)出類似化學(xué)促透劑氮酮的作用方式，乳香、沒藥揮發(fā)油對(duì)3種生物堿的促透作用可能通過影響皮膚細(xì)胞表面負(fù)電荷而改變皮膚活性表皮屏障作用，從而有利于生物堿透過皮膚活性表皮層。研究表明乳香、沒藥混合組及藥對(duì)組呈現(xiàn)出的作用并不是乳香、沒藥揮發(fā)油作用的加和，有文獻(xiàn)報(bào)道乳香、沒藥配伍后的揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量均有一定變化[16]，具體涉及哪種化學(xué)成分的增減還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，本研究采用HaCaT細(xì)胞模型，證實(shí)了九分散方中乳香、沒藥揮發(fā)油均能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞攝取九分散中馬錢子活性成分馬錢子堿、士的寧與麻黃活性成分鹽酸麻黃堿，同時(shí)利用流式細(xì)胞儀比較了乳香、沒藥揮發(fā)油作用前后細(xì)胞膜電位的變化，表明乳香、沒藥揮發(fā)油通過提高HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞膜流動(dòng)性促進(jìn)3種生物堿透膜入胞，該機(jī)制為乳香、沒藥揮發(fā)油促進(jìn)方中有效成分經(jīng)皮滲透和皮膚滯留的機(jī)制之一。九分散經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究，可為更好地尋找作用強(qiáng)、毒性低的促透劑及設(shè)計(jì)促透劑復(fù)方提供理論依據(jù)，研究和開發(fā)出更多經(jīng)皮給藥產(chǎn)品，滿足臨床對(duì)多種疾病治療的需要。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 52-498.

[2] 王坤山. 推薦一個(gè)治痹良方“九分散” [J]. 河南中醫(yī), 1984, 4(5): 49-50.

[3] 周世明. 九分散治療痛痹 [J]. 四川中醫(yī), 1986, 4(2): 45.

[4] 張?jiān)氯A, 伊春錦, 陸霞, 等. 古方九分散加味治療痹病的觀察與實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 福建醫(yī)藥雜志, 1994, 16(5): 34.

[5] 孫亦群. 九分散經(jīng)皮給藥制劑的研究 [D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學(xué), 2001.

[6] Boukamp P, Petrussevska R T, Breitkreutz D,. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line [J]., 1988, 106(3): 761-771.

[7] 朱小芳, 羅晶, 管詠梅, 等. 乳香沒藥揮發(fā)油對(duì)川芎體外透皮吸收的影響及其皮膚血流促透機(jī)制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(4): 680-685.

[8] 管詠梅, 陶玲, 朱小芳, 等. 乳香沒藥揮發(fā)油對(duì)川芎中阿魏酸促透機(jī)制的研究 [J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(17): 3350-3355.

[9] 中國藥典 [S]. 四部. 2020: 233.

[10] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典(上冊) [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1991: 1167.

[11] 張馨, 王莉芳, 陳佳琪, 等. 龍血竭酚類提取物主要成分在Caco-2細(xì)胞中吸收機(jī)制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(20): 4889-4895.

[12] 蘭頤, 李輝, 陳巖巖, 等. 花椒油對(duì)HaCaT細(xì)胞膜流動(dòng)性及膜電位的影響及其機(jī)制研究 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2015, 17(1): 44-51.

[13] 蘭頤, 王景雁, 劉艷, 等. 萜烯類經(jīng)皮促透劑對(duì)皮膚活性表皮層的影響及其機(jī)制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(4): 643-648.

[14] 熊璐琪, 李國鋒, 蘇碧雅, 等. 醋酸地塞米松和地塞米松磷酸鈉的油水分配系數(shù)與其經(jīng)皮滲透行為之間的相關(guān)性研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 2011, 46(6): 439-446.

[15] 趙金鳳. 乳香和沒藥揮發(fā)性成分的分析及其經(jīng)皮吸收研究 [D]. 濟(jì)南: 山東中醫(yī)藥大學(xué), 2011.

[16] 王艷艷, 王團(tuán)結(jié), 宿樹蘭, 等. 乳香、沒藥藥對(duì)配伍揮發(fā)油成分的GC-MS分析 [J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2011, 25(2): 31-34.

A preliminary study on promoting effect of frankincense and myrrh volatile oil on HaCaT cell uptake of alkaloids in Jiufen Powder and its mechanism

GAO Ling, HUANG Shi-yu, CHEN Li-hua, LI Ying-ying, GUAN Yong-mei, LIU Li-li, ZHU Wei-feng

Key Laboratory of Modern Preparation of Chinese Materia Medica, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To study the effect and mechanism of the volatile oil of frankincense and myrrh in Jiufen Powder (九分散) in promoting keratinocyte HaCaT uptake of brucine, strychnine and ephedrine hydrochloride.The CCK-8 method was used to detect the effect of frankincense and myrrh volatile oil single use/drug pair on the survival rate of HaCaT cells when combined with brucine, strychnine, and ephedrine hydrochloride in Jiufen Powder prescriptions; LC-MS/MS quantified analytical method combined with BCA protein kit was used to determine the influence of the volatile oil of frankincense and myrrh on the uptake of HaCaT cells to three alkaloid cells; DiBAC4 (3) was used as a fluorescent probe to determine the effect of the volatile oil of frankincense and myrrh on HaCaT cell membrane potential.The volatile oils of different frankincense and myrrh all had a certain penetration promoting effect on the three alkaloids, and the penetration promoting effect on the lipid-soluble brucine and strychnine was better than the water-soluble ephedrine hydrochloride. After the volatile oil of frankincense and myrrh acted on the HaCaT cells labeled with DiBAC4(3), the volatile oil of frankincense and myrrh could reduce the membrane potential of HaCaT cells. As the concentration increased, the fluorescence intensity of the cell membrane potential increased and showed a significant concentration dependence, showing a similar mode of azone action.Both frankincense and myrrh volatile oil can promote the uptake of three alkaloids by HaCaT cells. The promotion mechanism may change the active epidermal barrier function of the skin by affecting the negative charge on the skin surface, thereby facilitating the penetration of the drug through the active epidermal layer. The mechanism needs to be further explored.

Jiufen Powder; frankincense volatile oil; myrrh volatile oil; brucine; strychnine; ephedrine hydrochloride; cell membrane potential

R285

A

0253 - 2670(2021)08 - 2357 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.019

2020-12-19

江西省主要學(xué)科學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃（20204BCJL22048）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20181BAB205078）；江西省重大科技研發(fā)專項(xiàng)（S2019ZDYFB0027）；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（202010412182）

高 玲（1996—），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┡c新技術(shù)研究。E-mail: 857728223@qq.com

陳麗華（1972—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┡c新技術(shù)研究。E-mail: Chlly98@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]