靈芝多糖對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能及TLR4/NF-κB通路的影響

黃 晗，李鳳芝，李 楊，張小紅

靈芝多糖對膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能及TLR4/NF-κB通路的影響

黃 晗，李鳳芝，李 楊，張小紅*

鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450000

探究靈芝多糖對盲腸結扎穿孔導致的膿毒癥急性肺損傷大鼠肺功能及肺組織炎癥的影響。SD大鼠隨機分成對照組、模型組及靈芝多糖低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和烏司他丁組，除對照組外，其余各組大鼠均采用盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥模型。給予靈芝多糖和烏司他丁進行干預，采用全自動血氣分析儀檢測大鼠O2分壓[(O2)]和CO2分壓[(CO2)]；取大鼠右肺中葉計算肺組織濕/干質量；采用ELISA法檢測大鼠肺泡灌洗液中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法檢測大鼠肺組織病理變化；采用Western blotting法檢測大鼠肺臟組織中Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）、p65、磷酸化p65（p-p65）蛋白表達水平。與對照組比較，模型組大鼠肺組織結構破壞，肺泡間隔明顯增厚，有大量炎性細胞浸潤，肺組織炎癥評分顯著升高（＜0.05）；肺組織濕質量/干質量顯著升高（＜0.05）；(CO2) 顯著升高（＜0.05），(O2) 顯著降低（＜0.05）；肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著升高（＜0.05）；肺組織TLR4和p-p65/p65蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺組織損傷減輕，肺泡完整性較好，炎癥細胞浸潤減少，肺組織炎癥評分顯著降低（＜0.05）；肺組織濕質量/干質量顯著降低（＜0.05）；(CO2)顯著降低（＜0.05），(O2) 顯著升高（＜0.05）；肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著降低（＜0.05）；肺組織TLR4和p-p65/p65蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。靈芝多糖能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，從而減輕膿毒癥大鼠炎癥反應并保護肺功能。

靈芝多糖；膿毒癥；炎癥反應；Toll樣受體4；核因子-κB

膿毒癥是感染引起的全身性炎癥反應綜合征，患者嚴重時會出現(xiàn)器官功能障礙[1]。肺臟是膿毒癥患者最易受到損傷的器官之一。膿毒癥可以引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI），肺組織中大量炎性細胞浸潤，免疫炎癥反應失衡[2-4]。Toll樣受體4（toll like receptors 4，TLR4）為Toll樣受體亞型之一，可通過促進其下游靶點核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）磷酸化活化，介導炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR4/NF-κB信號通路可減輕炎癥反應，改善膿毒癥肺損傷[5]。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗炎等作用[6-7]。靈芝多糖可通過抑制ApoE?/?動脈粥樣硬化小鼠TLR4/NF-κB信號通路，發(fā)揮調血脂作用[8]。本研究采用盲腸結扎穿孔法制備大鼠膿毒癥模型，觀察靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺功能的影響，并探討其對TLR4/NF-κB信號通路的影響，以期為其治療膿毒癥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，6周齡，體質量200～220 g，購自浙江中醫(yī)藥大學，許可證號SYXK（浙）2019-0024。動物于鄭州大學附屬鄭州市中心醫(yī)院動物房適應性飼養(yǎng)1周，通風良好、溫度25 ℃、相對濕度50%。動物實驗經(jīng)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院動物倫理委員會批準（批準號ZZCH-LL-2020072402）。

1.2 藥品與試劑

烏司他丁注射液（5×104U/mL）購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；靈芝多糖對照品（質量分數(shù)≥90%，批號180516）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒（批號190118）、IL-1β試劑盒（批號180925）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、NF-κB試劑盒購自北京索萊寶生物技術有限公司；TLR4抗體、p65抗體、p-p65抗體、β-actin抗體、羊抗兔IgG抗體購自美國Abcam公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器

GEM3500型全自動血氣分析儀（美國沃芬有限公司）；GL224/224i-1SCN型電子天平（德國賽多利斯公司）；MK3 Multiskan型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-25D型蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）；光學顯微鏡（日本Nikon公司）；無創(chuàng)肺功能儀（法國EMKA公司）。

2 方法

2.1 膿毒癥模型的制備

隨機選取12只SD大鼠作為對照組，其余大鼠采用盲腸結扎穿孔法[9]制備膿毒癥模型。大鼠ip 1.0%戊巴比妥鈉（20 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，腹部消毒脫毛，沿正中腹白線切開皮膚，打開腹腔，找出盲腸，結扎盲腸末端和回盲瓣中間部位，使用18號針頭在盲腸結扎處做2處穿刺，輕輕擠壓盲腸，擠出部分腸內容物至腹腔，盲腸放入腹腔，逐層縫合，關閉腹腔。術后，大鼠sc生理鹽水（30 mL/kg）進行液體復蘇。對照組大鼠僅打開腹腔，游離盲腸，不結扎穿孔。膿毒癥大鼠模型制備成功后，檢測大鼠肺功能相關指標如潮氣量（tidal volume，T）、呼氣峰流量（peak expiratory flow，PET），保證膿毒癥大鼠模型造成了大鼠肺功能損傷。

2.2 分組與給藥

按照文獻方法[10-11]，將膿毒癥模型大鼠隨機分為模型組及靈芝多糖低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組和烏司他丁組，每組12只。靈芝多糖溶于生理鹽水配制成質量濃度為0.5、1.0、2.0 g/mL的溶液。靈芝多糖組大鼠ig相應藥物，烏司他丁組大鼠ip藥物（3 mL/kg），對照組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。

2.3 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織濕質量/干質量的影響

大鼠處死后，完整摘除肺組織。取大鼠右肺中葉，吸干表面水分，稱定濕質量，于60 ℃烘箱中烘干48 h，稱定干質量，計算肺組織濕質量/干質量。

2.4 靈芝多糖對膿毒癥大鼠O2分壓[p(O2)]和CO2分壓[p(CO2)]的影響

末次給藥24 h后，大鼠麻醉處死，頸總動脈取血并加入肝素抗凝，使用全自動血氣分析儀檢測(O2) 和(CO2)。

2.5 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響

大鼠處死后，打開胸腔，結扎右側肺部，在近頭端氣管位置，將預冷生理鹽水緩慢注入大鼠左側肺泡內，然后緩慢抽出，重復3次，將收集的肺泡灌洗液離心取上清，于?80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平。

2.6 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響

取大鼠右肺組織，于4%多聚甲醛中固定，脫水透明、浸蠟包埋、切片后，進行HE染色，于顯微鏡下觀察肺組織病理變化，并對淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤程度進行評分。評分標準：0分為無炎性細胞浸潤；3分為部分炎性細胞浸潤；5分為大量炎性細胞彌漫性浸潤。

2.7 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

取大鼠右肺組織，加入預冷的含蛋白酶抑制劑的裂解液，研磨混勻，離心取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入脫脂牛奶封閉2 h；分別加入TLR4、p65、p-p65、β-actin抗體（1∶1000），孵育過夜，洗滌后加入羊抗兔IgG抗體，室溫孵育2 h，洗滌后加入顯影液，拍照并觀察。

2.8 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織濕質量/干質量的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織濕質量/干質量顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺組織濕質量/干質量明顯降低（＜0.05），呈劑量相關性。

表1 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織濕質量/干質量的影響(, n = 12)

與對照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05；與靈芝多糖50 mg/kg組比較：▲＜0.05；與靈芝多糖100 mg/kg組比較：■＜0.05，下表同

#< 0.05control group;*< 0.05model group;▲< 0.05polysaccharide 50 mg/kg group;■< 0.05polysaccharide 100 mg/kg group, same as below tables

3.2 靈芝多糖對膿毒癥大鼠p(O2) 和p(CO2) 的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組大鼠(O2) 顯著降低（＜0.05）、(CO2) 顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠(O2) 顯著升高（＜0.05）、(CO2) 顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

表2 靈芝多糖對膿毒癥大鼠p(O2)和p(CO2)的影響(, n = 12)

1 mm Hg＝133 Pa

3.3 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

3.4 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠肺組織形態(tài)結構完整，肺泡結構清晰且間隔均一，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠肺組織結構破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質水腫，可見大量炎性細胞浸潤；各給藥組大鼠肺組織損傷較模型組減輕，肺泡完整性較好，炎癥細胞浸潤減少。

表3 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響(, n = 12)

圖1 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響(HE, ×200)

如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織炎癥評分顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織炎癥評分顯著降低（＜0.05）。

表4 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織病理變化的影響(, n = 12)

3.5 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

如圖2和表5所示，與對照組比較，模型組大鼠肺組織TLR4、p-p65/p65蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，靈芝多糖組大鼠肺組織TLR4、p-p65/p65蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關性。

圖2 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響

表5 靈芝多糖對膿毒癥大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的影響(, n = 12)

4 討論

膿毒癥是由感染引起的全身反應，是潛在的致命并發(fā)癥[12-14]。膿毒癥早期表現(xiàn)為大量促炎細胞因子產生全身性炎癥，先天免疫系統(tǒng)對細菌感染產生異常強烈反應[15]。膿毒癥后期存在廣泛的器官功能障礙，肺臟是其主要靶器官[16-17]。本研究采用盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織結構破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質水腫，可見大量炎性細胞浸潤，肺組織炎癥評分、肺組織濕/干質量顯著升高，肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平顯著升高，(CO2) 顯著升高，(O2) 顯著降低，表明模型組大鼠肺組織嚴重破壞，炎癥反應強烈，肺功能障礙，膿毒癥模型建立成功。

靈芝是我國傳統(tǒng)中藥，常用于扶正固本、增強身體抵抗能力[8]。靈芝多糖作為靈芝的主要有效成分，可抑制炎癥反應、緩解機體損傷[18]。靈芝多糖可通過抑制肝臟組織Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎性小體相關蛋白表達，減輕急性酒精性肝損傷小鼠的炎癥反應，有效緩解肝組織損傷并恢復肝功能[19]。本研究結果顯示，靈芝多糖組大鼠肺組織損傷減輕，肺泡完整性較好，炎癥細胞浸潤減少，肺組織濕/干質量、(CO2)降低，(O2) 升高，表明靈芝多糖能夠改善膿毒癥大鼠肺損傷，保護肺功能。靈芝多糖可顯著降低腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，減輕大鼠腦缺血再灌注繼發(fā)的炎癥反應[20]。本研究結果顯示，靈芝多糖組大鼠肺組織炎癥評分顯著降低，肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和NF-κB水平均顯著降低，且呈劑量相關性，表明靈芝多糖可通過抑制炎癥反應，保護膿毒癥大鼠肺組織。

研究表明，TLR4/NF-κB信號通路參與膿毒癥大鼠炎癥反應，姜黃素和升降散可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減輕膿毒癥大鼠的腸損傷炎癥反應和心肌損害[21-22]；紫杉醇可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減輕膿毒癥小鼠的急性肺損傷[23]。本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織中TLR4、p-p65/p65蛋白表達水平顯著升高，表明膿毒癥大鼠肺組織的炎癥反應和肺損傷可能與TLR4/NF-κB信號通路活化有關。羧甲基化靈芝多糖可抑制腦缺血再灌注小鼠腦組織中NF-κB表達，從而減輕炎癥反應[20]。本研究結果顯示，靈芝多糖組大鼠肺組織中TLR4和p-p65/p65蛋白表達水平顯著降低，且呈劑量相關性，表明靈芝多糖可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減輕膿毒癥大鼠炎癥反應。綜上所述，靈芝多糖能夠通過抑制TLR4/ NF-κB信號通路，從而抑制膿毒癥大鼠炎癥反應并保護肺臟功能。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofpolysaccharides on lung function and TLR4/NF-κB pathway in sepsis rats with acute lung injury

HUANG Han, LI Feng-zhi, LI Yang, ZHANG Xiao-hong

Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China

To explore the effect ofpolysaccharides (GLP) on lung function and lung tissue inflammation in rats with septic acute lung injury caused by cecal ligation and perforation.SD rats were randomly divided into control group, model group, low-, medium-, high-dose (50, 100, 200 mg/kg) GLP groups and ulinastatin group. Except for rats in control group, rats in the other groups were used to establish sepsis model by cecal ligation and perforation method. GLP and ulinastatin were given to intervene, and(O2) and(CO2) of rats were detected by automatic blood gas analyzer; Middle lobe of the right lung of rats was taken to calculate the wet/dry weight of lung tissue; Levels of interleukin-6 (IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and nuclear factor-κB (NF-κB) in alveolar lavage fluid of rats were detected by ELISA; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to detect pathological changes in rat lung tissue; Western blotting was used to detect expressions of toll like receptor 4 (TLR4), p65, and phosphorylated p65 (p-p65) in lung tissue of rats.Compared with control group, lung tissue structure of rats in model group was destroyed, the alveolar compartment was significantly thickened, with a large number of inflammatory cells infiltration, and the lung tissue inflammation score was significantly increased (< 0.05); Wet/dry weight of lung tissue was significantly increased (< 0.05);(CO2) was significantly increased (< 0.05),(O2) was significantly decreased (< 0.05); IL-6, IL-1β, TNF-α and NF-κB levels in alveolar lavage fluid were significantly increased (< 0.05); Expressions of TLR4 and p-p65/p65 in lung tissue were significantly increased (< 0.05). Compared with model group, lung tissue damage of rats in GLP group was reduced, alveolar integrity was improved, inflammatory cell infiltration was reduced, lung inflammation scores was significantly reduced (< 0.05); Wet/dry weight of lung tissue was significantly reduced (< 0.05);(CO2) was significantly reduced (< 0.05),(O2) was significantly increased (< 0.05); IL-6, IL-1β, TNF-α and NF-κB levels in alveolar lavage fluid were significant decreased (< 0.05); Expressions of TLR4 and p-p65/p65 in lung tissue were significantly reduced (< 0.05), in a dose-dependent manner.GLP can inhibit TLR4/NF-κB signaling pathway, thereby reducing the inflammatory response in septic rats and protecting lung function.

polysaccharide; sepsis; inflammatory reaction; TLR4; NF-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2021)08 - 2351 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.018

2020-10-20

黃 晗，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事呼吸與危重癥醫(yī)學方面研究。E-mail: hh901238@163.com

張小紅，碩士，副主任醫(yī)師。E-mail: zhangxh1970@126.com

[責任編輯 李亞楠]