不同餌料對海蜇幼體生長、消化酶、抗氧化和免疫酶活力的影響

李世順，喬雁冰，左然濤，常亞青

(大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

海蜇(Rhopilemaesculentum)俗稱水母、石鏡等，隸屬刺胞動物門(Cnidaria)，缽水母綱(Scyphozoa)，根口水母目(Rhizostomeae)，海蜇屬(Rhopilema)[1]。海蜇屬于低等無脊椎動物，消化系統(tǒng)簡單，餌料主要為貝類幼體、枝角類、端足類、介形類和橈足類等浮游動物[2]。海蜇育苗技術(shù)和人工養(yǎng)殖技術(shù)在20世紀(jì)后期得到突破[3]，促進(jìn)海蜇養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)逐年發(fā)展的趨勢。據(jù)2020年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒數(shù)據(jù)顯示，2019年全國海蜇養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到145 794 t，相比2018年降低了9.26%[4]。隨著經(jīng)濟(jì)效益的升高，有關(guān)生物餌料影響海蜇生長發(fā)育的研究陸續(xù)展開。李曉東等[5]研究發(fā)現(xiàn)，輪蟲密度對海蜇幼體的生長影響顯著，以每升5.0×103～1.0×104個為宜。魯男等[6]發(fā)現(xiàn)投喂鹵蟲無節(jié)幼體的頻率為每天4～5次/h，能夠促進(jìn)海蜇的生長。郝振林等[7]認(rèn)為浮游植物作為海蜇的間接餌料，是影響海蜇生長的重要因素。余訓(xùn)凱等[2]研究表明豐年蟲(Artemiasalina)和小球藻(Chlorella vulgaris)混合投喂會顯著提高海蜇的存活率。不同于生物餌料能夠顯著改善海蜇幼體的經(jīng)濟(jì)性狀，配合飼料的效果較差。類比在海水仔稚魚的研究[8]，推測是海蜇幼體胃腔消化酶活力較弱導(dǎo)致的。消化酶活力決定了動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力，從而影響著動物的生長發(fā)育。有關(guān)消化酶活力在魚類[9-12]、對蝦[13]、棘皮動物[14]和貝類[15]等多個種類開展了大量的研究，結(jié)果表明不同餌料組成是影響動物消化酶活力的重要因素[16-18]。

動物體內(nèi)的分子活力氧(ROS)能夠誘導(dǎo)不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生，破壞機(jī)體組織，從而影響動物的正常發(fā)育?？寡趸副蛔C實能夠通過提高生物的防御能力行使免疫機(jī)能[19]。綜上所述，為保證餌料選擇的科學(xué)性，抗氧化酶和免疫酶活力在越來越多的研究中被選為評價指標(biāo)。目前有關(guān)不同餌料對海蜇免疫和抗氧化能力影響的研究甚少，因此，本實驗通過攝食生長實驗比較不同餌料對海蜇的生長、消化酶、抗氧化酶及非特異性免疫酶活力的影響，以期為海蜇的養(yǎng)殖及人工配合飼料開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實驗餌料

實驗設(shè)置4種餌料：小球藻組、蝦片組、混合組(蝦片和鹵蟲無節(jié)幼體等比例混合)和鹵蟲無節(jié)幼體組，營養(yǎng)組成詳見表1。其中，小球藻為實驗室培養(yǎng)的三級藻液；蝦片購買自博尚生技實業(yè)(湛江)有限公司(主要成分：魚粉、烏賊肉粉、南極蝦粉、蝦紅素、卵磷脂、EPA、DHA、綜合氨基酸、綜合維生素和綜合礦物質(zhì))；鹵蟲無節(jié)幼體為孵化24 h的幼體，使用前用海水反復(fù)清洗去殼。

1.2 實驗動物和養(yǎng)殖條件

海蜇購買自遼寧省丹東市某養(yǎng)殖場，選擇個體均勻、無損傷且活力好的海蜇幼體作為實驗材料，在實驗室暫養(yǎng)一周。實驗開始前對海蜇進(jìn)行24 h饑餓處理，并選擇10只暫養(yǎng)海蜇進(jìn)行初始取樣。喂養(yǎng)實驗在300 L的水槽中進(jìn)行，將暫養(yǎng)的海蜇[初始體重為(63.90±2.57) g]隨機(jī)分為12組，每組40只，每種餌料隨機(jī)選擇3組海蜇進(jìn)行投喂，飼料的投喂頻率為4次/d，且每次都進(jìn)行表觀飽食投喂[20]，養(yǎng)殖實驗周期為30 d。實驗期間，光照強(qiáng)度為1 500 Lx[21]，光照周期為14 L∶10 D；水溫為20～25 ℃，鹽度為28～31，pH為7.8～8.2，溶解氧大于6 mg/L，每天吸底換水一次，換水量為50%。

表1 不同餌料的基本營養(yǎng)成分分析Tab.1 Basic nutrition component analysis of different diets %

1.3 指標(biāo)測定和數(shù)據(jù)分析

1.3.1 生長指標(biāo)測定和取樣

實驗結(jié)束后，采用計數(shù)的方法計算海蜇的成活率。海蜇體重的測定(餌料實驗組全部的海蜇，n= 40；初始組為n= 10)方法為將其放置在濕毛巾上，吸取其表面水分后稱重。每組隨機(jī)選取3只用于酶活的測定。分別收集初始組和餌料實驗組海蜇的口腕、棒狀結(jié)構(gòu)、胃絲及體腔液；用1 mL注射器抽取體腔液，在12 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心16 min，分離獲得上清液。所有樣品收集在無菌離心管中，液氮速凍后放置在-80 ℃冰箱冷凍保存待用。

1.3.2 消化酶和抗氧化酶活力的測定

將待檢測的組織樣品在冰上解凍，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，在低溫條件下機(jī)械勻漿，冷凍離心(4 ℃，2 500 r/min，10 min)獲得上清液用于相關(guān)酶活測定。胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、總蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LZM)、丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(T-AOC)的測定均采用試劑盒(南京)，利用Epoch酶標(biāo)儀(美國Biotek公司生產(chǎn))按照相關(guān)說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示，采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及繪圖，分析方法為Duncan法進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為顯著性水平。

海蜇的特定生長率(Specific growth rate，SGR)公式：

SGR(%/d)=(lnW2-lnW1)/t×100

式(1)

海蜇的增重率(Weight growth rate，WGR)公式：

WGR(%)=(W2-W1)/W1×100

式(2)

W1和W2分別為各組海蜇的初始和終末體重的平均值(g)；t為實驗時間(d)。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同餌料對海蜇生長性能的影響

在實驗過程中，各組海蜇的成活率為100%。不同餌料組海蜇的終末體重出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，鹵蟲無節(jié)幼體組的增重率最高，顯著高于小球藻組和蝦片組(P<0.05)，但與混合組差異不顯著(P>0.05)；蝦片組和小球藻組相比無顯著差異(P>0.05)。從特定生長率來看，鹵蟲無節(jié)幼體組最好，與混合組的差異不顯著(P>0.05)，但兩組均顯著高于蝦片組和小球藻組(P<0.05)(表2)。

2.2 不同餌料對海蜇不同部位消化酶活力的影響

如圖1所示，胃蛋白酶在海蜇體內(nèi)的分布有顯著差異(P<0.05)。不同餌料對海蜇口腕和胃絲的胃蛋白酶均產(chǎn)生了顯著影響(P<0.05)，而對棒狀結(jié)構(gòu)和體腔液中的胃蛋白酶未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，其中口腕中胃蛋白酶活力約為體腔液的3倍。在口腕中，初始組海蜇的胃蛋白酶活力顯著低于其他餌料實驗組(P<0.05)，但4個餌料組之間無顯著差異(P>0.05)；在胃絲中，混合組顯著高于小球藻組和蝦片組(P<0.05)，但與鹵蟲無節(jié)幼體組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表2 不同餌料對海蜇生長的影響Tab.2 Effect of different diets on the growth performance of R. esculentum

圖1 不同餌料對海蜇不同組織的蛋白酶活力影響同一組柱狀圖上方字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。Fig.1 Effect of different diets on pepsin activity in different tissues of R. esculentumDifferent letters on the column in the same cluster indicate significant difference(P<0.05). The same below.

如圖2所示，淀粉酶活力在海蜇體內(nèi)不同組織中差異顯著，口腕中活力最高，其次是胃絲和棒狀結(jié)構(gòu)，體腔液中活力最低，其中口腕中淀粉酶活力約為體腔液中的7倍。不同餌料對海蜇口腕淀粉酶活力產(chǎn)生顯著影響，其中蝦片組顯著高于其他各組(P<0.05)，混合組和初始組之間無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于小球藻組和鹵蟲無節(jié)幼體組(P<0.05)。

圖2 不同餌料對海蜇不同組織的淀粉酶活力影響Fig.2 Effect of different diets on amylase activity in different tissues of R. esculentum

如圖3所示，脂肪酶活力在海蜇的胃絲中最高，接近其他組織的2倍。胃絲和棒狀結(jié)構(gòu)中的脂肪酶活力有相同的變化趨勢：各餌料實驗組之間的脂肪酶活力沒有顯著差異，但顯著高于初始組(P<0.05)；在海蜇的體腔液中，小球藻組脂肪酶活力顯著低于鹵蟲無節(jié)幼體組(P<0.05)，但與蝦片組和混合組無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同餌料對海蜇不同組織的脂肪酶活力影響Fig.3 Effect of different diets on lipase activity in different tissues of R. esculentum

2.3 不同餌料對海蜇體腔液中的抗氧化和非特異性免疫酶活力的影響

如表3所示，除SOD外，混合組和鹵蟲無節(jié)幼體組的各抗氧化酶活力顯著高于其他各組(P<0.05)。海蜇體腔液中SOD和CAT的活力在各餌料實驗組顯著高于初始組(P<0.05)，其中鹵蟲無節(jié)幼體組的活力顯著高于小球藻組(P<0.05)。T-AOC活力和MDA在混合組和鹵蟲無節(jié)幼體組之間無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于其他各組(P<0.05)?；旌辖MLZM活力顯著高于蝦片組、小球藻組和初始組(P<0.05)，但和鹵蟲無節(jié)幼體組相比無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同餌料對海蜇體腔液中抗氧化酶活力的影響Tab.3 Effect of different diets on the anti-oxidant enzyme activities in the Coelomic fluid of R. esculentum

3 討論

鹵蟲無節(jié)幼體組和混合組海蜇的特定生長率顯著高于蝦片組和小球藻組，其中鹵蟲無節(jié)幼體組的特定生長率最高。該研究結(jié)果支持了黃權(quán)等[21]的研究，投喂鹵蟲無節(jié)幼體的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)仔稚魚比傳統(tǒng)養(yǎng)殖方式生長更快。雖然鮮活鹵蟲無節(jié)幼體能夠顯著促進(jìn)生物體的生長，但其成本相對較高。人工配合飼料具有營養(yǎng)全面等特點，但其投喂方式是融水混合后直接潑灑，過程中存在營養(yǎng)物質(zhì)的溶失和餌料下沉導(dǎo)致海蜇不能及時攝食等問題，這可能是蝦片組海蜇生長不佳的原因。另外，李旭鵬等[22]指出在生產(chǎn)實踐中，采用生物餌料和人工餌料搭配，可使餌料營養(yǎng)更為全面，能夠促進(jìn)動物生長發(fā)育。綜上所述，建議在海蜇幼體養(yǎng)殖過程中，采用混合生物餌料和人工餌料的方式進(jìn)行投喂。

在本研究中，海蜇的不同組織均檢測到了消化酶活力。餌料實驗組口腕的蛋白酶活力顯著高于初始組(P<0.05)，且小球藻組胃絲的蛋白酶活力顯著低于其他實驗組(P<0.05)，王重剛等[23]研究發(fā)現(xiàn)生物體蛋白酶含量與餌料中蛋白含量和種類息息相關(guān)，和本研究結(jié)果一致，在一定程度上說明不同類型的餌料會顯著影響在生物體內(nèi)的蛋白酶活力。餌料實驗組海蜇胃絲及棒狀結(jié)構(gòu)的脂肪酶活力均顯著高于對照組；在體腔液中，含高脂肪的鹵蟲無節(jié)幼體組脂肪酶活力最高，且顯著高于小球藻組(P<0.05)。這與董云偉等[24]在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)中的研究結(jié)果一致，脂肪酶活力和餌料中脂肪含量呈正相關(guān)[25]。淀粉酶在海蜇各組織中的活力均較低，且餌料的種類對淀粉酶的活力沒有顯著性影響，這說明淀粉酶不是海蜇幼體的主要消化酶。結(jié)合生長指標(biāo)發(fā)現(xiàn)動物餌料組海蜇的生長性能較好，推測消化酶能夠幫助該階段的海蜇有效利用餌料中的蛋白和脂肪促進(jìn)自身生長發(fā)育。

混合組和鹵蟲無節(jié)幼體組SOD、CAT、T-AOC的活力顯著高于其他組，可能與餌料中包含的微量物質(zhì)與營養(yǎng)成分更為全面有關(guān)。蔣琦辰等[26]研究發(fā)現(xiàn)，提高飼料中蛋白含量有助于提高甲殼動物的抗氧化能力。本研究中鹵蟲無節(jié)幼體組體腔液的抗氧化能力最高，這與唐媛媛等[27]在卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)中的研究結(jié)果一致。溶菌酶是一種重要的非特異性免疫因子，廣泛存在于生物體中[28]。本研究中，鹵蟲無節(jié)幼體組和混合組溶菌酶活力均較高，這可能與餌料中含有蛋白質(zhì)的水平較高有關(guān)，說明海蜇的非特異性免疫酶活力在一定程度上受餌料中蛋白質(zhì)水平的影響。該結(jié)果和在尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)中得研究結(jié)果一致，尼羅羅非魚的肝臟溶菌酶含量隨著其飼料蛋白質(zhì)水平的升高而提高[29]。

綜上所述，鹵蟲無節(jié)幼體組和混合組(蝦片和鹵蟲無節(jié)幼體混合投喂)均可顯著提高海蜇的生長，促進(jìn)海蜇的抗氧化能力和非特異性免疫酶活力。此外，混合投喂不僅可以節(jié)省成本，降低勞動量，并能在一定程度上減低生物餌料供應(yīng)不穩(wěn)定、成本較高以及攜帶致病菌的風(fēng)險。