反復種植失敗人群年齡、BMI與非整倍體的關系分析

羅燕群 李輝斌 黃翠玉 黃莉 朱秀蘭 張曦倩 劉風華

(廣東省婦幼保健院 生殖醫(yī)學中心，廣東 廣州 511442)

隨著年齡增加卵子質量下降，非整倍體率增加[1,2]，故高齡成為胚胎植入前非整倍性基因測試(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)的臨床指征之一。除了高齡是非整倍體發(fā)生的高危因素，另外也有基礎實驗發(fā)現肥胖小鼠的卵母細胞顯示減數分裂異常或延遲[3]，高脂飲食小鼠的卵母細胞表現出紡錘體缺陷，染色體錯位和非整倍性發(fā)生率更高[4]。因此，近年來體重的改變對生殖的影響也備受關注，研究發(fā)現超重和肥胖患者其內分泌以及代謝的改變導致不孕癥、自然流產、體外受精-胚胎移植助孕不良的妊娠結局以及產科并發(fā)癥增加[5-9]。國外研究發(fā)現隨著身體質量指數(body mass index，BMI)增加，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)助孕低反應周期取消率增加，妊娠率降低，但是在接收贈卵的肥胖受體的薈萃分析發(fā)現BMI增加不會影響IVF-ET結局，表明卵母細胞質量是影響肥胖患者IVF/ICSI結局的關鍵因素[10, 11]。但是臨床上婦女體重的異常是否會引起胚胎非整倍體率增加導致妊娠率降低？目前此方面研究尚少，本研究先通過分析反復種植失敗不同年齡組以及不同體重指數組患者的非整倍體率的差異，再進一步在不同年齡段分層分析不同體重指數患者的非整倍體率的情況，希望給反復種植失敗患者PGT-A助孕前的遺傳咨詢提供有用的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年5月至2020年6月在廣東省婦幼保健院診斷為反復種植失敗行PGT-A的79個周期資料。入選標準：①取卵年齡≤39周歲；②診斷為反復種植失敗的患者，即既往至少3次或以上移植周期(包括新鮮或者凍融胚胎)，累積移植大于等于4個優(yōu)質胚胎；③均為新鮮PGT-A周期。排除標準：①男女雙方染色體核型異常；②輸卵管積水；③子宮畸形；④中、重子宮粘連的電切術后；⑤女方抗心磷脂抗體陽性或者凝血功能異常。廣東省婦幼保健院的倫理委員會審核并批準本研究，參與患者均知情并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 分組 按取卵年齡分<35歲組和35～39歲組，按BMI分體重過低組(<18.5kg/m2)、正常組(18.5～23.9kg/m2)和超重組(24.0～27.9kg/m2)[12, 13]。

1.2.2 控制性促排卵以及PGT-A胚胎培養(yǎng)和活檢 采用常規(guī)的促排卵方案，當1個卵泡直徑≥20mm或者3個以上卵泡直徑≥18 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)6000～10 000U誘導排卵，誘發(fā)排卵后36h取卵。取卵后4～6h常規(guī)行卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，然后采用序貫培養(yǎng)(vitrolife G-series)胚胎至第5天或第6天，活檢時間為受精后第5或第6天，活檢部分外胚層細胞(5～10個)送檢?；顧z后的囊胚常規(guī)冷凍保存。

1.2.3 PGT-A檢測 利用胚胎植入前染色體非整倍體檢測的試劑盒(可逆末端終止測序法)進行測序檢測(嘉寶仁和，北京)，再采用SurePlex擴增的試劑盒(Rubicon 公司，美國)對常規(guī)活檢的5～10個滋養(yǎng)外胚層細胞進行全基因組擴增，然后通過基因組拷貝數變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)分析方法對擴增后的產物進行檢測以及數據分析[14]。

1.2.4 PGT-A胚胎檢測數據分析以及判讀標準 整倍體囊胚檢測結果中沒有出現整條染色體異常和片段性異常(>4 Mb)及嵌合情況。非整倍體囊胚：當23對染色體中任意一條染色體檢測結果與參考數據庫中對應的正常染色體存在顯著差異，即該條染色體拷貝數異常(包括嵌合情況)。整倍體數=診斷囊胚數-非整倍體數。

2 結果

2.1 ≤35歲和35～39歲反復種植失敗患者PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 <35歲患者的BMI、腰圍、腰臀比、抗苗勒管激素、成熟卵數、囊胚形成數、活檢囊胚數、嵌合體率均和35～39歲患者間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但胚胎整倍體數、整倍體率明顯高于35～39歲患者(P<0.05)。見表1。

表1 <35歲和35～39歲患者的臨床特征和非整倍體比較

2.2 不同體重指數的反復種植失敗患者行PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 不同BMI組間(<18.5、18.5～23.9和24.0～27.9)患者的年齡、基礎FSH、抗苗勒管激素、獲卵數、成熟卵數、2PN卵裂數、活檢囊胚數間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，體重指數18.5～24.0組患者正常受精率、囊胚形成率明顯高于其他2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是其胚胎整倍體數、整倍體率和嵌合體率三組間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同BMI患者的臨床特征和非整倍體的比較

2.3 小于35歲和35～39歲不同體重指數的反復種植失敗患者PGT-A助孕的臨床特征以及非整倍體的比較 不同年齡段(年齡<35歲和34～39歲)患者分別統(tǒng)計不同體重指數組間(<18.5kg/m2、18.5～23.9kg/m2和24.0～27.9kg/m2)患者的年齡、活檢囊胚數、胚胎整倍體數、整倍體率和嵌合體率3組間差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。35～39歲年齡階段的患者體重正?；颊吣遗咝纬陕矢哂隗w重過低和超重患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 ≤34歲和35～39歲不同BMI患者的臨床特征和非整倍體的比較

3 討論

肥胖不僅導致心血管和腦血管疾病、糖尿病、睡眠呼吸暫停、關節(jié)炎和癌癥等風險增加[15, 16]，而且影響女性的生殖功能，超重同樣產生不良影響。國外研究分析了超重或肥胖對IVF/ICSI助孕結果的影響提示即使 BMI ≥25kg/m2也與IVF/ICSI治療的妊娠率降低和自然流產率增高有關[6][11, 17]，以及超重導致種植率明顯降低[18]。也有針對35歲以下IVF助孕患者的研究發(fā)現肥胖影響胚胎質量[19]。非整倍體是自然流產以及反復種植失敗發(fā)生的主要原因之一[20]。隨著年齡的增加非整倍體率增加，2018版的胚胎植入前遺傳學診斷/篩查技術專家共識提出高齡≥38歲、不明原因反復自然流產以及不明原因反復種植失敗婦女建議行PGS(即PGT-A)助孕篩查整倍體胚胎移植[21]。反復種植失敗患者中年齡和非整倍體的關系如何？BMI的異常與非整倍體的發(fā)生是否相關？本研究針對性先分析了反復種植失敗患者PGT-A助孕<35歲和≥35～39歲患者非整倍體率的差異，再進一步分析不同體重指數患者非整倍體的差異。

3.1 不同年齡段反復種植失敗患者PGT-A助孕非整倍體的分析 由于導致不明原因性反復種植失敗的機制復雜，PGT-A篩選整倍體胚胎移植以及提高子宮內膜容受性均認為是其治療的主要措施，但如何針對予以行之有效的措施尚有爭議,尤其近期對PGT-A的臨床意義提出了新的質疑以及其指征也面臨修改和更新[21-24]。遭遇不明原因性反復種植失敗的患者選擇行PGT-A助孕的利弊如何？國外研究發(fā)現<35歲、35～37歲、38～39歲和40歲以上囊胚非整倍體的概率分別為40.3%、50.8%、56%和78.3%[2, 25]。國內一項針對不同年齡組女性胚胎的非整倍性情況分析發(fā)現>35歲的高齡女性胚胎染色體異常率高于低齡女性[26]，本研究與上述研究一致，我們針對反復種植失敗PGT-A助孕患者研究發(fā)現<35歲和35～39歲組的囊胚形成率相似，但是整倍體率差異具有明顯統(tǒng)計學意義，分別為61.1%和47.0%。因此，遺傳咨詢時，針對性提供患者相應年齡段囊胚可能獲得整倍體胚胎的概率，可給患者選擇是否行胚胎植入前遺傳學篩查提供幫助。

2.2 不同體重指數反復種植失敗患者PGT-A助孕非整倍體的分析 國外研究結果提示超重或肥胖對生殖系統(tǒng)的不良影響可能與胚胎非整倍性無關[12]。由于國外與國內人種的不同，同時肥胖以及超重的診斷標準和發(fā)生概率也有差異，因此我們也針對體重指數與非整倍體的關系進行研究。但由于地理位置關系，本中心就診的中國南方地區(qū)不孕的肥胖婦女比較少，尤其是因反復種植失敗行PGT-A的不孕婦女，因此本研究重點探討體重過低、體重正常和超重的反復種植失敗患者PGT-A助孕周期非整倍體的差異。本研究中無論是否以年齡分層分析得出的結果均與國外研究一致，認為不同BMI組患者的非整倍體率相似。研究證實卵裂期胚胎的整倍體率是33.3%，明顯低于囊胚的整倍體率60.3%[27]，我們研究發(fā)現35～39歲年齡段的體重正?；颊吣遗咝纬陕拭黠@高于體重過低和超重患者，分析認為囊胚培養(yǎng)過程中一些發(fā)育潛能差的胚胎(包括一些非整倍體胚胎)被淘汰[28]，與Goldman等[12]研究結果一致認為超重或肥胖對體外受精-胚胎移植助孕結果的負面影響可能是與胚胎非整倍體以外的因素有關。因此我們研究認為雖然體重指數異?？赡懿挥绊懛钦扼w的發(fā)生，但是35～39歲的反復種植失敗患者行PGT-A助孕前控制體重指數至正常范圍可能會通過提高囊胚形成率增加整倍體胚胎個數。

胚胎非整倍體的發(fā)生與眾多因素相關，例如產婦年齡，精子質量和卵母細胞的體外操作等[24]，另外本研究為回顧性隊列分析且樣本量有限等因素可能會對非整倍體的統(tǒng)計分析產生偏倚，因此尚需要設計良好的前瞻性隨機臨床試驗進行證實。

綜上所述，當反復種植失敗患者年齡增加至35～39歲時整倍體率明顯降低以及體重指數的異?？赡苡绊懩遗咝纬陕省３匾约绑w重過低可能不影響反復種植失敗患者的非整倍體率。