大動物節(jié)段性骨缺損模型的研究進展

陳胡貴 覃建國 李理 石展英 潘浩波 李兵 崔旭

0 引言

四肢節(jié)段性骨缺損，尤其是臨界尺寸節(jié)段性骨缺損的修復(fù)仍然是骨科最具挑戰(zhàn)性的難題之一。一般認為，臨界尺寸骨缺損(critical size defect，CSD)是指在其生長周期內(nèi)不能憑借自身再生能力修復(fù)或者骨再生少于10% 的最小骨缺損[1]。節(jié)段性骨缺損過大，即節(jié)段性CSD的發(fā)生，會導(dǎo)致創(chuàng)面環(huán)境不良和缺損部位生物力學(xué)不穩(wěn)定。若再受到代謝性疾病、激素分泌異常、手術(shù)技術(shù)不佳、體內(nèi)營養(yǎng)不良等因素的影響，CSD往往無法自愈并易發(fā)生骨不連[2]。若得不到有效的骨移植替代治療，患者很可能會面臨截肢的結(jié)局。

目前主流的骨移植替代材料主要包括自體骨、同種異體骨，以及人工骨材料等。自體骨及同種異體骨移植雖然成骨效果確切，但各自存在諸多缺陷使其臨床應(yīng)用受到一定的局限[3]。此外，現(xiàn)有的再生治療方案，如帶蒂血管化的骨移植、Masqulet技術(shù)或Ilizarov牽張成骨技術(shù)，都有特定的適應(yīng)證和明顯的局限性[4-5]。因此臨床對于人工骨材料的需求日益迫切，開發(fā)兼具合適力學(xué)性能和骨誘導(dǎo)活性的人工骨材料具有重大意義。

為有效評價人工骨材料作為骨缺損修復(fù)替代物的發(fā)展前景，加速人工骨材料的轉(zhuǎn)化和擴展相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用，有必要構(gòu)建可重復(fù)且有效的大動物節(jié)段性骨缺損模型。大動物節(jié)段性骨缺損模型是通過動物實驗?zāi)７氯祟惞侨睋p體內(nèi)環(huán)境及骨力學(xué)特性，從而測定人工骨材料的骨誘導(dǎo)活性及其他生物學(xué)特性。理想的動物模型應(yīng)具有以下幾個特點：(1)與人骨結(jié)構(gòu)相似度高；(2)建模管理可行性強；(3)來源成本低；(4)社會倫理接受度大。目前最常用于構(gòu)建節(jié)段性骨缺損模型的大動物包括狗、豬、山羊、綿羊等。而最常用的固定方式則包括：支架外固定、髓內(nèi)釘固定、鋼板內(nèi)固定。盡管眾多學(xué)者都致力于該領(lǐng)域的研究，但目前尚無一種理想的大動物節(jié)段性骨缺損模型能完美模擬人類骨結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征。因此本文將重點介紹用于評價人工骨材料常用和有效的大動物節(jié)段性骨缺損模型的研究進展，對臨界尺寸骨缺損大小的取值、常用建模動物的優(yōu)缺點、節(jié)段性骨缺損模型的建立、不同固定方式等方面進行綜述，以促進大動物節(jié)段性骨缺損模型的優(yōu)化改進。

1 節(jié)段性CSD的特征考量

大動物節(jié)段性CSD的具體數(shù)值，取決于諸多因素，如動物的年齡和種類、物種系統(tǒng)發(fā)育狀況、缺損解剖位置、臨近軟組織及生物力學(xué)條件、骨膜是否存在、固定方法、肢體機械負荷和應(yīng)力等[6]。CSD動物模型被認為是評價人工植骨材料促進骨組織修復(fù)重建的標準模型。鑒于影響CSD的因素眾多，常需要一個對照組來確認所評估的缺陷尺寸在研究期間不能自愈。

通過文獻檢索，檢索到近5年內(nèi)關(guān)于采用大動物節(jié)段性骨缺損模型評估人工植骨材料骨修復(fù)性能研究的文獻共7篇(詳見表1)。其中，綿羊在大動物節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建實驗中的使用頻率最高。值得注意的是，即使使用相同的模型動物，關(guān)于CSD大小的取值也未達到共識。例如，有研究認為，綿羊節(jié)段性CSD大約是相應(yīng)骨干直徑的3倍[7]。但也有研究顯示[8]，在平均中軸直徑為22 cm的綿羊品種中，脛骨骨干5 cm結(jié)合骨膜缺損即可引起CSD。Lammens等[9]認為，基于綿羊脛骨節(jié)段性骨缺損模型研究聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的骨缺損修復(fù)性能，4.5 cm的骨缺損比3 cm更為合適。除了在節(jié)段性CSD大小上的較大差異外，在不同研究中也選擇了不同的固定方法，包括支架外固定、髓內(nèi)釘固定和鋼板內(nèi)固定等，這些差異使得對不同研究進行比較變得困難。同時，許多研究中缺少部分重要信息(如動物年齡、種類、性別等)，導(dǎo)致研究結(jié)果存在歧義，甚至無法驗證。模型的多樣性使得比較不同研究的結(jié)果非常困難。所以，很有必要減少動物模型的可變性，并對幾個描述良好、轉(zhuǎn)化能力強的模型達成一致認識。

2 節(jié)段性骨缺損模型常用的大動物

不同動物物種在體型、骨骼解剖和骨骼力學(xué)性能上存在顯著差異。同種實驗動物的個體差異和植入部位也會對修復(fù)效果和再生速度產(chǎn)生較大影響[15]。尚無一種理想的大動物節(jié)段性骨缺損模型能完美模擬人類骨結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征。因此，在選擇合適的動物物種時，理解其特定骨骼特征(如骨的微觀結(jié)構(gòu)、組成及骨重建的特點)、力學(xué)特征(如骨的載荷-變形曲線、骨截面慣狀矩、骨韌度、骨強度、骨彈性以及疲勞性等特點)以及與人類臨床情況的相似性和差異性，有助于研究材料與骨組織的相互作用，尤其是有助于深入探討人工骨材料的安全性和有效性。

表1 近5年各種大動物節(jié)段性骨缺損模型研究Table 1 Study on various animal models of segmental bone defects in recent 5 years

骨骼成熟的大型動物，如狗、豬、山羊和綿羊等，是用于評估植骨材料在節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建效果中最具臨床相關(guān)性的模型動物。大型動物具有與人體類似的骨微結(jié)構(gòu)、生理和生物力學(xué)特性[6]。此外，大型動物的骨骼表面和體積也相對較大，因而能更好地模擬臨床常用植入物手術(shù)入路方案和內(nèi)外固定裝置。

2.1 犬類

一直以來，犬類就是用于研究人工植骨材料骨修復(fù)重建效果的常用大型動物。雖然在微觀結(jié)構(gòu)和重塑方面與人類骨組織存在一定的差異，但犬類骨組織卻具有與人類骨組織相似的重量、密度、有機和無機成分等特性[16]。而且從實用角度看，犬類在長時間的研究期間相對比較容易飼養(yǎng)和安置。生物學(xué)上的相似性、成本和飼養(yǎng)方面的實用簡便性，使犬科動物可用于承重部位的節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建研究。然而，基于犬類作為寵物和處于“人類最好的朋友”的特殊地位，在醫(yī)學(xué)研究中使用犬類作為實驗對象時的動物福利和倫理問題逐漸凸顯，因此犬科動物在骨缺損特別是節(jié)段性骨缺損的修復(fù)重建模型中的使用已經(jīng)明顯減少。

2.2 豬

豬也是一種常用于節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建效果評估的大型動物。豬在骨骼解剖學(xué)、形態(tài)、愈合能力、重塑過程和礦物質(zhì)密度等方面與人類的骨骼相似[17]。豬股骨的直徑和截面面積與人類大致相等，骨再生速率與人類相近，還具有與人類相似的板層骨結(jié)構(gòu)[18]，因而豬成為人工植骨材料體內(nèi)生物安全性和骨修復(fù)性能研究的可選大型動物。但是，豬的脛骨和股骨的長度相對較小，不能應(yīng)用于為人類設(shè)計的大尺寸植入物的骨修復(fù)性能評估，在選擇固定裝置時也會受限。再加上豬體重大、生長速度快，許多學(xué)者認為其并不適合用于人工植骨材料的骨修復(fù)性能研究。

2.3 山羊

山羊是中等大小的反芻動物。盡管山羊的骨骼結(jié)構(gòu)與人類不同，且由于易受驚嚇的原因，在實驗中容易產(chǎn)生較大的接骨失敗風險，難以建立術(shù)后局部負重。但因為成年山羊與成年人類體重相似，有類似的骨骼形成率、骨骼大小和生物力學(xué)等特性，其長骨尺寸也相對更加適用于人類成年個體植骨材料的植入和固定[13]，部分學(xué)者仍將山羊視為植骨材料臨床前生物安全性和有效性研究中頗有價值的模型動物。

2.4 綿羊

綿羊是特別溫順的動物，綿羊的身體形態(tài)(體質(zhì)量、大小)可與成年人相媲美，且長骨尺寸相似，可以使用專為成年人設(shè)計的植骨材料。與人類相比，綿羊雖然在骨重建方面存在延遲，但在骨礦物組成、骨再生率、重塑能力等方面與人類極其相似[6]。此外，綿羊后肢的生物力學(xué)負荷曲線已經(jīng)得到很好的描述：綿羊后肢的負載大約是成年人正常行走狀態(tài)下所受負重的一半[19]，可以更加客觀地評估人工骨材料在人骨缺損修復(fù)中所體現(xiàn)的力學(xué)特征。Reichert等[20]建議使用平均年齡為7～9歲的綿羊來研究節(jié)段性骨缺損，因為綿羊達到這個年齡后才會發(fā)生繼發(fā)性骨重建，而繼發(fā)性骨重建能使綿羊的骨組織在結(jié)構(gòu)上與人類更加相似。基于上述原因，越來越多的學(xué)者在節(jié)段性骨缺損模型研究中傾向于選用綿羊作為建模動物。

3 大動物節(jié)段性骨缺損模型的構(gòu)建

在構(gòu)建大動物節(jié)段性骨缺損研究模型之前，需認真考慮影響實驗結(jié)果從骨科研究轉(zhuǎn)化到臨床實踐的因素[6]。除前文所述，需選擇與人類相似的骨骼結(jié)構(gòu)、生理病理及力學(xué)特征的動物模型外，動物的年齡、缺損解剖位置、缺損大小、骨膜是否存在、骨材料固定方式、肢體機械負荷和應(yīng)力等因素也需考慮在內(nèi)；同時，還要注意獲取實驗動物的成本及社會可接受度，如動物的可得性、照顧成本以及動物實驗倫理等。建立大動物骨缺損模型的步驟主要包括術(shù)前計劃和準備、手術(shù)過程、術(shù)后管理等3個階段，每個階段對手術(shù)的成功都相當重要[21]。

3.1 術(shù)前計劃和準備

術(shù)前需制定詳細計劃以明確植骨材料的結(jié)構(gòu)和大小、模型動物的基本特征(物種、年齡、性別、體質(zhì)量、數(shù)量)以及合理完善的人員配置。術(shù)前準備階段則主要包括：禁飲禁食、預(yù)防感染、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、全身麻醉、麻醉評估等方面。體格較小的反芻動物建議采取氣管內(nèi)插管，提供安全的氣道，防止唾液和胃內(nèi)容物的反流及吸入性肺炎。

3.2 手術(shù)過程

外科手術(shù)建立節(jié)段性骨缺損的過程需要注意的問題及存在的困難：(1)術(shù)中要有效建立統(tǒng)一標準骨缺損的解剖位置；(2)考慮CSD的具體長度，同時應(yīng)建立空白對照組以明確其不可自愈值；(3)手術(shù)入路要接近缺損部位且軟組織和肌肉較少，能夠充分暴露截骨所需要的范圍，同時要避免損傷血管、神經(jīng)及軟組織；(4)綜合考慮骨膜剝離缺損近端與遠端的距離，以減少自愈的可能；(5)截骨過程中用生理鹽水沖洗降溫是有效防止骨壞死的關(guān)鍵；(6)選擇合適有效的內(nèi)/外固定裝置。

3.3 術(shù)后管理

術(shù)后管理包括以下幾個內(nèi)容。(1)術(shù)后懸吊：手術(shù)后將動物進行懸吊，可以避免手術(shù)肢體負重，允許動物有一個漸進期來適應(yīng)手術(shù)的肢體。(2)術(shù)后X線觀察：術(shù)后需立即進行X線檢查，以便發(fā)現(xiàn)和及時解決如接骨螺釘松動、螺釘過長、假體周圍骨折等問題。(3)術(shù)后需進行充分的鎮(zhèn)痛。(4)術(shù)后抗感染：在術(shù)后給動物提供適當?shù)目股?，如短效廣譜抗生素，1次/d，連續(xù)3 d，并根據(jù)實際情況需要繼續(xù)給藥。(5)術(shù)后隨訪：對于大動物模型的隨訪時間而言，由于構(gòu)建模型的方案不同，手術(shù)后對動物進行隨訪的時間也不盡相同，但在臨床上，節(jié)段性骨缺損首次手術(shù)后12個月內(nèi)極少取出內(nèi)固定裝置，因此，選擇12個月作為時間節(jié)點是很有必要的。為縮短研究時間，也有學(xué)者選擇6個月作為時間節(jié)點。選擇6個月的時間點具有實際優(yōu)勢，同時仍然能夠?qū)窃偕M行強有力的評估，并及早評估生物力學(xué)強度[21]。

4 節(jié)段性骨缺損大動物模型常用的固定方法

影響節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建效果的另一個重要因素就是所使用的固定方式和固定器械類型[22]。固定方式的選擇不僅要能模擬臨床環(huán)境，還要能提供合適的剛性來支持骨愈合，不充分和過于僵硬的固定都可能延遲骨愈合[23]。由于大多數(shù)研究使用的固定器械最初并不是專門為動物而設(shè)計的，因此尚不清楚在研究過程中固定器械是否能夠有效負荷，以及固定器械是否會對臨床轉(zhuǎn)化產(chǎn)生不利影響。目前在節(jié)段性骨缺損大動物模型研究中使用的多種固定技術(shù)各有其優(yōu)缺點。

4.1 支架外固定

從臨床角度來看，支架外固定是一種臨時固定措施，尤其適用于下肢創(chuàng)傷同時發(fā)生軟組織缺損的情況[24]。支架外固定對軟組織損傷程度較小，手術(shù)相對容易，不會妨礙植骨材料的植入，所以被視為常用的固定技術(shù)，在節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建研究中得到運用[25-26]。但外固定支架技術(shù)容易發(fā)生釘孔感染，進而導(dǎo)致螺釘松動，最終出現(xiàn)植骨失敗。此外，另一個限制外固定支架應(yīng)用的重要因素就是其骨愈合所需時間通常比內(nèi)固定更長[27]。

4.2 髓內(nèi)釘固定

目前臨床對于下肢骨干中部的骨折治療，髓內(nèi)釘內(nèi)固定是最常見的方案。髓內(nèi)釘是一種中心負荷載體，對外力有很高的耐受性。為了使骨髓腔能夠提供足夠的空間將髓內(nèi)釘植入骨中，通常需要先進行擴髓。而這一過程本身會顯著提高髓內(nèi)的溫度，髓內(nèi)高溫與皮質(zhì)骨微循環(huán)的損傷會導(dǎo)致骨組織壞死及骨內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和血運的改變。此外，擴髓的過程中髓內(nèi)壓力明顯升高，可能會引起空氣栓塞或脂肪栓塞及相關(guān)組織器官的梗死[28]。臨床上也有非擴髓內(nèi)釘，其具有產(chǎn)生熱量少、能夠保障骨內(nèi)膜血運通暢等優(yōu)點。但使用這些髓內(nèi)釘卻有很高的接骨失敗率，因為其存在髓內(nèi)釘直徑較小，容易出現(xiàn)固定不牢、不愈合幾率高等問題。髓內(nèi)釘固定最大的缺點就是會嚴重影響植骨材料的骨缺損填充空間。盡管有上述許多缺陷，仍有部分關(guān)于綿羊脛骨的節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建研究中使用了髓內(nèi)釘固定技術(shù)[29]。

4.3 鋼板內(nèi)固定

鋼板內(nèi)固定是臨床治療中骨干節(jié)段性骨缺損的主要方法。鋼板內(nèi)固定是一種偏心載荷載體，有低到中等的植入物軸向偏移率，伴隨植骨失敗的風險。在鋼板固定的絕對剛性應(yīng)力下，骨膜有可能因骨表面壓迫而受損，從而影響骨吸收或延遲愈合。但與其他固定方法對比，鋼板內(nèi)固定優(yōu)勢明顯，主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，使用鋼板內(nèi)固定實現(xiàn)穩(wěn)定骨折的同時，植入材料可完整填充整個缺損，這在節(jié)段性骨缺損修復(fù)重建中至關(guān)重要的。其次，鋼板可以準確彎曲，使其與長骨骨干輪廓一致，易實現(xiàn)骨缺損部位的剛性固定。最后，脛骨骨干主要由位于脛骨近端和外側(cè)的營養(yǎng)血管供應(yīng)。沿脛骨前內(nèi)側(cè)放置鋼板能避開這些血管，保留了殘余脛骨的血液供應(yīng)，有助于骨再生愈合。近年來，除標準鋼板外，越來越多大動物節(jié)段性骨缺損模型的采用了動力加壓鋼板(dynamic compression plate，DCP)固定裝置[30]。相關(guān)研究表明，DCP能促進周圍骨痂的早期形成，顯示出比標準鋼板更強更快的骨愈合能力[31]。因此，DCP應(yīng)是大動物節(jié)段性骨缺損修復(fù)模型首選的固定裝置之一。

5 總結(jié)與展望

大動物節(jié)段性骨缺損模型的構(gòu)建，有利于對人工骨材料的骨誘導(dǎo)活性及其他生物學(xué)特性進行長期觀察和深入研究，獲得更加接近臨床實際的證據(jù)，從而加速人工骨材料的轉(zhuǎn)化和擴展相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。目前模型的多樣性使得比較不同研究的結(jié)果非常困難，不利于人工骨材料的科學(xué)評價。如何構(gòu)建規(guī)范的大動物節(jié)段性骨缺損模型標準將會是備受關(guān)注的研究方向。本文對臨界尺寸骨缺損大小取值、常用建模動物的優(yōu)缺點、節(jié)段性骨缺損模型的建立、骨材料的不同固定方法等方面進行詳細介紹，有助于研究者對大動物節(jié)段性骨缺損模型的全面認識，為進一步研究提供了方法與思路。