保加利亞乳桿菌的篩選及其發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)

李 婷，田佳樂(lè)，劉 洋，陳海燕，丹 彤，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

乳酸菌是指發(fā)酵乳糖主要產(chǎn)物為乳酸的一類無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。其廣泛分布于自然界中，一般主要存在于人體、動(dòng)物體及各種發(fā)酵食品中。1905年，Grigoroff 首次從酸奶中分離出保加利亞乳桿菌 （Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）[1]。該菌株是酸奶發(fā)酵劑中重要的菌種之一，具有清腸、整腸、提高機(jī)體免疫力、抗癌及抗腫瘤等重要的生物學(xué)功能[2]。

Kataoka 等[3]研發(fā)出一種樣品前處理技術(shù)-固相微萃?。⊿olid-phase microextraction，SPME）。SPME 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在風(fēng)味檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。武士美等[4]采用SPME-GC/MS 技術(shù)對(duì)保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，鑒定了乙酸、乙醛、雙乙酰、乙偶姻、乙酸乙烯酯等多種風(fēng)味化合物，并篩選出具有優(yōu)良風(fēng)味的菌株。Bao 等[5]采用該技術(shù)分析干酪乳桿菌（Lactobacills casei）發(fā)酵乳中的揮發(fā)性化合物，檢測(cè)出的主要風(fēng)味化合物有乙酸、丁酸、雙乙酰和己酸乙酯等。任為一等[6]采用該技術(shù)分析發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)雙乙酰、乙偶姻、乙醛、2-壬酮等化合物對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

酸奶是一種受消費(fèi)者喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，然而，關(guān)于保加利亞乳桿菌在牛乳發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味及其發(fā)酵特性的報(bào)道較少。本研究以來(lái)自蒙古國(guó)和西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的7 株保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象，系統(tǒng)考察貯藏12 h 時(shí)發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)的多樣性，并測(cè)定發(fā)酵和貯藏12 h 時(shí)的pH 值、滴定酸度（TA）、活菌數(shù)和黏度，旨在為傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

內(nèi)標(biāo) （Internal Standard，ISTD）1，2-二氯苯，Sigma 公司；全脂奶粉，美國(guó)Fonterra 公司；MRS 液體培養(yǎng)基（MRS BROTH），英國(guó)Oxoid 公司。

試驗(yàn)菌株：7 株保加利亞乳桿菌由實(shí)驗(yàn)室提供。菌株詳細(xì)信息見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將真空冷凍干燥保藏的保加利亞乳桿菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳3代，使菌株活力達(dá)最大。在50 mL 和200 mL MRS液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體，將菌體重懸于無(wú)菌PBS 保護(hù)劑中制備菌懸液。取適量蒸餾水加熱至50 ℃，加入11.5%全脂乳粉攪拌溶解，當(dāng)水溫升至60 ℃時(shí)加入6.5%蔗糖，水合30 min，且溫度始終保持在60 ℃，連續(xù)均質(zhì)2 次（65 ℃，15 MPa 和35 MPa），得到的均質(zhì)乳在95 ℃處理5 min 后快速冷卻至42 ℃。將制備好的菌懸液以5×107CFU/mL 的量接種到均質(zhì)化的全脂乳中，分裝至樣品瓶，并在42 ℃發(fā)酵。待樣品的pH 值達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)4.5，TA 在70～90 °T 時(shí)，將樣品移至4 ℃貯藏12 h，待測(cè)。

表1 保加利亞乳桿菌的來(lái)源信息Table 1 Information of L.delbrueckii subsp.bulgaricus

1.2.2 發(fā)酵乳的理化特性

1.2.2.1 pH 值和滴定酸度的測(cè)定 發(fā)酵乳樣品用雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)測(cè)量，調(diào)整溫度在20～22℃范圍，平行測(cè)量發(fā)酵乳的pH 值。

使用電子天平精確稱量5 g 發(fā)酵乳樣品，置于100 mL 錐形瓶中，向錐形瓶中加入40 mL 蒸餾水和3 滴酚酞指示劑，充分搖動(dòng)。加入0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至出現(xiàn)微紅色且30 s 內(nèi)不退色。記錄加入的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。每個(gè)發(fā)酵乳樣品測(cè)定3 個(gè)平行。計(jì)算滴定酸度（TA）的公式（1）如下：

式中：X——發(fā)酵乳樣品的酸度，°T；c——NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；v——滴定時(shí)消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；m——發(fā)酵乳樣品的質(zhì)量，g；0.1——酸度理論定義NaOH 溶液的濃度，mol/L。

1.2.2.2 黏度的測(cè)定 取40 g 發(fā)酵乳樣品，用黏度儀的4#轉(zhuǎn)子測(cè)定其黏度，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速100 r/min，扭矩20%～100%，測(cè)定時(shí)間30 s，每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)平行，取平均值。

1.2.2.3 乳酸菌活菌計(jì)數(shù) 采用稀釋平皿傾注法檢測(cè)保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中活菌數(shù)的變化。用0.85%無(wú)菌NaCl 對(duì)樣品進(jìn)行10 倍梯度稀釋，分別取10-5，10-6，10-7的稀釋液各1 mL 于無(wú)菌培養(yǎng)皿上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 使用Agilent 7890B 氣相色譜儀和5977A 質(zhì)譜儀測(cè)定發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。將萃取頭（50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）在Agilent 7890B氣相色譜儀進(jìn)樣口（250 ℃）老化5 min，插入氣相瓶上方，萃取樣品中的風(fēng)味化合物。萃取條件：溫度50 ℃，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速300 r/min，萃取時(shí)間60 min。柱溫：采用程序升溫，初始溫度35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min 后以10℃/min 速率升至250 ℃。試驗(yàn)用載氣為高純氦氣，載氣流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。汽化室溫度250 ℃。電離方式EI 離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500，發(fā)射電流100 μA，檢測(cè)電壓1.4 kV，無(wú)溶劑延遲。

1.2.4 定性與定量分析 利用隨機(jī)攜帶Masshunter 工作站NIST 11 標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜結(jié)果，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算揮發(fā)性風(fēng)味化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）。參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的RI 值鑒定發(fā)酵乳樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。保留指數(shù)（RI）值代入公式（2）計(jì)算：

式中：RT——保留時(shí)間（min）；RT（Z）、RT（Z＋1）和RT（X）分別為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)為Z、Z＋1 和待測(cè)物X 的保留時(shí)間，且正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)的保留時(shí)間遵循RT（Z）

將1，2-二氯苯溶液作為ISTD 加入發(fā)酵樣品中，采用峰面積歸一化法計(jì)算所有組分的相對(duì)峰面積比。樣品中各組分風(fēng)味物質(zhì)的濃度代入公式（3）計(jì)算：

式中ci——試驗(yàn)樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；cs——1，2-二氯苯的質(zhì)量濃度，μg/L；Ai——樣品中待測(cè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰面積；As——ISTD 的色譜峰面積。

1.2.5 關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)價(jià) 為確定發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，采用香氣活度值（odor activity value，OAV）準(zhǔn)確評(píng)價(jià)單一香氣成分對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)程度。OAV 是指香氣成分的濃度與其在水中的感覺閾值的比值。OAVi計(jì)算公式（4）：

式中：OAVi——風(fēng)味化合物i 的香氣活度值；Ci——發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；OTi——所測(cè)風(fēng)味化合物在水中的氣味閾值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使 用Microsoft Excel、SIMCA-P、Origin 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌的發(fā)酵特性

7 株保加利亞乳桿菌在發(fā)酵和貯藏12 h 時(shí)pH、TA 的變化情況如圖1a、b 所示。在牛乳發(fā)酵過(guò)程中，所有樣品的pH 值呈緩慢下降的趨勢(shì)。其中，IMAU62115 的發(fā)酵時(shí)間最短，僅用7 h 達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn) （pH 4.5）。IMAU62121 的發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，13 h 達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。從圖1b 看出，滴定酸度與pH 值的變化相反，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，所有發(fā)酵乳樣品的TA 值呈緩慢升高的趨勢(shì)。其中，在貯藏12 h時(shí)，IMAU62115 發(fā)酵乳的TA 值達(dá)到最高值，即95°T，其余6 株菌株發(fā)酵乳的TA 值相對(duì)較低，分別為94，93，92，90，84，74°T。

圖1 各組發(fā)酵乳pH、TA、活菌數(shù)、黏度隨發(fā)酵和貯藏時(shí)間變化曲線Fig.1 The curve of pH, TA, viable count and viscosity of fermented milk with fermented and storage time

7 株保加利亞乳桿菌在牛乳發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化如圖1c 所示。國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（International Dairy Federation，IDF）規(guī)定在貯藏、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中發(fā)酵乳產(chǎn)品的活菌數(shù)應(yīng)達(dá)到107CFU/mL 以上。在本試驗(yàn)中，貯藏12 h 時(shí)，7 株保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)均在108CFU/mL 以上，其中IMAU62115 發(fā)酵乳樣品中活菌數(shù)最高，達(dá)4.95×108CFU/mL。這一結(jié)果說(shuō)明本試驗(yàn)用發(fā)酵劑菌株在發(fā)酵及貯藏過(guò)程中能保持良好的活力，可用于發(fā)酵劑的研發(fā)。

黏度是評(píng)價(jià)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)及口感的一項(xiàng)重要指標(biāo)，圖1d 顯示7 株保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過(guò)程中黏度的變化。由圖1d 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，黏度逐漸升高。特別是在貯藏12 h 時(shí)，IMAU20220 和IMAU62115 發(fā)酵乳的黏度分別達(dá)到966 mPa·s 和820 mPa·s，優(yōu)于其它菌株。

2.2 保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)

貯藏12 h 時(shí)，從7 株保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中共檢測(cè)到54 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括酸、醛、酮、醇及酯類風(fēng)味化合物（表2）。采用香氣活度值（odor activity value，OAV）法鑒定出14 種關(guān)鍵性風(fēng)味化合物（表3）。通常，0.1≤OAV＜1 的風(fēng)味化合物對(duì)發(fā)酵乳總體風(fēng)味的形成起重要修飾作用，OAV≥1 的化合物對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味起主要貢獻(xiàn)作用。

酸類化合物是發(fā)酵乳的主要呈味物質(zhì)，來(lái)源于脂肪分解、蛋白質(zhì)水解等代謝途徑[7]。由表2可知，3 株保加利亞乳桿菌（IMAU20396、IMAU62115、IMAU20220）發(fā)酵乳酸類化合物的種類和含量明顯高于其它菌株，特別是IMAU62115發(fā)酵乳中酸類化合物的總含量最高，達(dá)243.98 μg/L。在保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中檢測(cè)到一些重要的揮發(fā)性酸類物質(zhì)，如乙酸、3-甲基丁酸、己酸等[8]。其中，IMAU62115 發(fā)酵乳中檢測(cè)到的乙酸、3-甲基丁酸、己酸的含量均高于其它菌株。類似的結(jié)果在Pereda 等[9]和Pogacˇic等[10]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。

醛類化合物是發(fā)酵乳中的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)，主要通過(guò)氨基酸降解而產(chǎn)生[11]。由表2和表3可知，3-甲基丁醛和癸醛的OAV 值大于1。貯藏12 h 時(shí)，IMAU20234 和IMAU62115 發(fā)酵乳中3-甲基丁醛含量最高，分別為16.7 μg/L 和14.3 μg/L；僅在IMAU20220 發(fā)酵乳中檢測(cè)到癸醛，含量為1.09 μg/L。此外，有5 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的OAV 大于0.1，分別為乙醛、庚醛、正庚醛、苯甲醛、正壬醛。在醛類化合物中，乙醛是重要的風(fēng)味化合物，對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味影響較大[12]。在IMAU62115、IMAU20227、IMAU20234 和IMAU20403 發(fā)酵乳中均檢出乙醛，其含量分別為6.52，32.91，35.85，36.44 μg/L。苯甲醛是乳制品中常被檢測(cè)到的重要化合物。Chu 等[13]認(rèn)為低濃度的苯甲醛能賦予發(fā)酵乳杏仁香味，而濃度較高時(shí)，能賦予發(fā)酵乳水果香氣。貯藏12 h時(shí)，IMAU20403、IMAU20396、IMAU62115 發(fā)酵乳中苯甲醛含量分別為3.71，3.82，3.19 μg/L，顯著高于其它菌株。庚醛賦予發(fā)酵乳脂肪香味[14]，正壬醛賦予發(fā)酵乳柑橘和脂肪香味[15]。

酮類化合物主要來(lái)源于不飽和脂肪酸降解、氨基酸降解或微生物代謝[16]。保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳被檢出的酮類化合物有12 種（表2，表3），其中，2，3-丁二酮（雙乙酰）和2-壬酮的OAV 值大于1，是關(guān)鍵性風(fēng)味化合物。特別是IMAU62115發(fā)酵乳中雙乙酰的含量為38.54 μg/L，遠(yuǎn)高于其它菌株發(fā)酵乳中雙乙酰的含量。雙乙酰是發(fā)酵乳風(fēng)味形成的關(guān)鍵芳香化合物，賦予發(fā)酵乳醇厚的奶油香味[17]。2-壬酮能賦予發(fā)酵乳奶油味和水果香味[18]。

醇類化合物的生成可能與乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝、亞油酸和亞麻酸降解有關(guān)[19]。本研究中共檢出18 種醇類化合物，其中，關(guān)鍵性（OAV≥1）醇類風(fēng)味物質(zhì)僅有1 種，為3-甲基丁醇。3-甲基丁醇是形成發(fā)酵乳風(fēng)味的重要物質(zhì)，如Galvao 等[20]在水果中檢測(cè)到3-甲基丁醇，認(rèn)為該物質(zhì)可賦予人愉悅的酪香味。Cheng 等[21]也認(rèn)為1-壬醇是發(fā)酵乳中的主要風(fēng)味物質(zhì)。IMAU20403、IMAU20396、IMAU62115 發(fā)酵乳中1-壬醇的含量最高，分別為2.75，2.78，2.57 μg/L。

IMAU 20234-----10.99 1.46-7.71-2.94-35.85-16.7-0.68 1.99 2.96-0.85 6.36-5.21 7.37 10.95果結(jié)定鑒GC-MS的質(zhì)物味風(fēng)性發(fā)揮中乳酵發(fā)菌桿乳亞利加保的12 h藏貯2表Volatile compounds produced from milk fermented by L.delbrueckii subsp.bulgaricus by SPME-GC-MS during 12 h storage Table 2 -1·L/μg度濃量質(zhì)質(zhì)物性發(fā)揮IMAU IMAU IMAU IMAU IMAU IMAU c考參RI b RI a RT式子分稱名文中20227 20220 62115 62121 20396 20403物合化類酸-10.87 26.61-12.29 4.24 638 630.53 2.7 O 2 H 4 C 2酸乙-45.68---18.94-704.5 3.74 O 3 H 4 C 3酸酮丙--18.67-21-767 764.24 5.48 O 2 H 8 C 4酸丁異0.83-5.78---793 802.79 6.74 O 2 H 8 C 4酸丁--3.63-2.81--869.49 9.16 O 4 H 10 C 6酸二丙8.94 50.8 154.96-89.74 42.97 875 875.8 9.4 O 2 H 10 C 5酸丁基甲3-1.97 4.72--8.23 2.39-884.2 9.72 O 2 H 14 C 7酸己基甲2--15.43-----886.77 9.81 O 2 H 10 C 5酸丁基甲2-11.5 11.73 23.63 2.44 14.03 14.22 999 998.1 13.95 O 2 H 12 C 6酸己--2.24 0.35--）（SE-30 1 128.13 1 127 18.21 O 2 H 12 C 7酸羧烷己環(huán)6.83 8.53 8.46 0.44 6.25 7.09 1 188 1 187.24 20.01 O 2 H 16 C 8酸辛-1.04-----1 292.73 23.03 O 2 H 18 C 10酸烯癸3-物合化類醛32.91-6.52--36.44--1.34 O H 4 C 2醛乙7.78 2.84-1.14 5.51 4.31-633.61 2.74 O 2 H 8 C 4醛丁基羥3-13.85 9.05 14.3 0.42 8.16 13.24 689 686.89 3.44 O H 10 C 5醛丁基甲3----5.83--687 687.19 3.45 O H 10 C 5醛戊正0.92 0.58-0.35---774.92 5.79 O H 14 C 7醛庚2.45 1.69 2.51 2.12 6.58 6.09 801 801.84 6.59 O H 12 C 6醛庚正2.8 1.95 3.19 2.11 3.82 3.71 964 963.72 12.68 O H 6 C 7醛甲苯-1.09-----1 109.98 17.65 O H 20 C 10醛癸1.07--0.32-1.59 1 110 1 110.24 17.66 O H 18 C 9醛壬正物合化類酮2.34 7.18-2.72 9.04-1 083 1 076.97 16.58 O H 12 C 8酮-2-醛烯二辛，5--3，反反--38.54-----2.14 O 2 H 6 C 4）酰乙（雙酮二丁，3-2-12.26-2.5 114.38---2.15 O H 10 C 5酮丁-2-基甲3-9.12 4.13 5.86 1.9 8.31 8.98 672 673.01 3.26 O H 10 C 5酮戊2-11.73 61.32 115.9-88.56 72.58-706.75 3.81 O 2 H 8 C 4姻偶乙號(hào)序1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5

IMAU 20234-44.87-5.08 17.1 1.75 1.15 64.44--1.2-7.96--6.78-7.51-1.28----1.52---應(yīng)對(duì)到找查中IMAU 20227 0.55 59.71--19.24 2.21 1.2-5.04--1.5 11.34--7.59 1.62 9.53-1.81-0.77 0.8-1.9--2.18庫(kù)據(jù)數(shù)該在-1/μg·L 度濃量質(zhì)質(zhì)IMAU IMAU 20220 62115--43.3--66.09-9.75 21.47 18.22 2.35 2.22 0.93-35.54 2.56-3.99 3.58-----7.28 5.67 0.87-1.08 2.26----7.11 11.7 1.72-0.48 1.72--0.66------2.57----1.85-未；-.數(shù)指留保考參應(yīng)對(duì)物性發(fā)揮IMAU IMAU IMAU c考參RI b RI 62121 20396 20403--3.26 735 733.21 14.96 83.21 80.69 894 895.78----896.13--12.58 1 076 1 077.09 5.25 39.28 33.29 1 096 1 098.04 0.6 3.57 3.46 1 298 1 300.99 0.48 1.68 2.21 1 504 1 504.82物合化類醇-----0.94 6.7--693.12-2.93--717.64 1.06---719.12 0.39--726 721.87--5.89 760 763.76-4.9--765.21 0.28 2.15--784.4 1.52-9.42 876 876.02---909 907.2 2.91 10.14 12.5 975 976.79----1 106.99-2.05 2.08 1 107.11 1 102（DB-5）0.41---1 107.17 0.2-1.15-1 108.28----1 113.42--1.32-1 132.26 0.84 2.78 2.75 1 176 1 178.34物合化類酯--4.63 870 876.09-3.63--1 701.52-1.55 2.5-1 504.6的到找查）中：//webbook.nist.gov/chemistry（http庫(kù)據(jù)數(shù)數(shù)指留保在；c.數(shù)a RT式子分4.58 O H 8 C 5 10.16 O H 14 C 7 10.17 O H 14 C 7 16.59 O H 12 C 8 17.28 O H 18 C 9 23.26 O H 22 C 11 28.92 O 2 H 18 C 10 2.14 O H 8 C 4 3.52 O H 14 C 7 4.13 O H 12 C 5 4.17 O H 10 C 5 4.25 O H 10 C 5 5.46 O H 12 C 5 5.51 O 2 H 12 C 6 6.06 O H 8 C 5 9.41 O H 14 C 6 10.58 O H 16 C 7 13.16 O H 16 C 7 17.56 O H 20 C 9 17.56 O H 20 C 9 17.57 O H 26 C 12 17.6 O H 22 C 10 17.76 O H 16 C 8 18.33 O H 16 C 9 19.74 O H 20 C 9 9.41 O 2 H 14 C 7 32.8 O 2 H 36 C 18 28.92 O 2 H 16 C 9指留保得所算計(jì)烴烷構(gòu)正）2表（續(xù)稱名文中號(hào)序酮-2-烯戊-3-反6酮庚2-7酮己-2-基甲5-8酮-2-烯二辛，5-3 9酮壬2-10酮一2-十11酮-2-喃吡氫四-2H-基戊6-12醇丁環(huán)1醇己環(huán)基甲-4-反2醇丁-2-基甲3-3醇-1-烯戊4-4-1-醇烯-3-丁基3-甲5醇丁基甲3-6醇己氧環(huán)，3-2 7醇烯戊-2-式反8醇己正9醇庚2-10醇庚1-11醇-2-庚基5-乙12醇2-壬13醇辛基丁2-14醇庚-1-基丙2-15醇己環(huán)基甲二，5 2 16醇炔-3-庚-1-基甲二，6-3 17醇壬1-18酯己酸甲1酯基，壬酸壬2酯內(nèi)壬δ-3列系一～C 25 C 6由）；b.（min間時(shí)留保：a.。數(shù)指留保考參注的

表3 保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)及對(duì)應(yīng)OAV 值Table 3 OAVs for different compounds produced by milk fermented by L.delbrueckii subsp.bulgaricus

酯類物質(zhì)主要通過(guò)脂肪酸和醇酯化產(chǎn)生。本研究中檢測(cè)到的酯類物質(zhì)種類較少，僅在IMAU20403 發(fā)酵乳中檢出甲酸己酯 （4.63 μg/L），該化合物可賦予發(fā)酵乳果香味。類似的研究結(jié)果Mariaca 等[22]也有報(bào)道。

結(jié)合表3中關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)的OAV 值，對(duì)貯藏12 h 發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)（OAV≥0.1）進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明菌株與香氣成分越接近，兩者的相關(guān)性越高。由圖2和圖3可知，左半?yún)^(qū)菌株（IMAU20220、IMAU20227、IMAU20234、IMAU62121）與庚醛、3-甲基丁醇、癸醛（OAV≥0.1）有較強(qiáng)的相關(guān)性，右半?yún)^(qū)菌株（IMAU20396、IMAU20403、IMAU62115）與3-甲基丁酸、乙醛、3-甲基丁醛、3-羥基丁醛、正庚醛、苯甲醛、正壬醛、2，3-丁二酮、乙偶姻、2-庚酮、2-壬酮等11 種OAV≥0.1 的風(fēng)味物質(zhì)有較強(qiáng)的相關(guān)性。這說(shuō)明不同菌株產(chǎn)生的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)不同，使發(fā)酵乳呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味特征。

圖2 貯藏12 h 時(shí)發(fā)酵乳樣品的主成分得分圖Fig.2 Score scatter plot of fermented milk during storage 12 h

圖3 貯藏12 h 時(shí)發(fā)酵乳樣品的風(fēng)味物質(zhì)載荷圖Fig.3 Loading scatter plot of volatile components during storage 12 h

3 結(jié)論

以分離自蒙古國(guó)和我國(guó)西藏傳統(tǒng)自然發(fā)酵乳制品中的7 株保加利亞乳桿菌為對(duì)象，測(cè)定這些菌株的pH 值、滴定酸度、活菌數(shù)和黏度等理化指標(biāo)，用SPME-GC-MS 方法分析7 株保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，IMAU62115 的發(fā)酵時(shí)間最短，僅用7 h 達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（pH 4.5），貯藏12 h 時(shí)，樣品活菌數(shù)達(dá)到最高，4.95×108CFU/mL，滴定酸度95 °T，黏度820 mPa·s。各菌株揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較、OVA 主成分分析結(jié)果顯示：在保加利亞乳桿菌IMAU62115 發(fā)酵乳中共檢測(cè)出26 種風(fēng)味物質(zhì)，包括酸類、醛類、酮類、醇類及酯類化合物等。其中關(guān)鍵性風(fēng)味化合物雙乙酰、乙偶姻、3-甲基丁醛、2-壬酮等濃度較高，OAV 值大于1，說(shuō)明這些化合物對(duì)保加利亞乳桿菌IMAU62115 發(fā)酵乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，使發(fā)酵乳風(fēng)味優(yōu)良。本研究篩選的保加利亞乳桿菌IMAU62115 菌株，具有良好的發(fā)酵特性，IMAU62115 發(fā)酵乳產(chǎn)生的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)使發(fā)酵乳的風(fēng)味優(yōu)良，為酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。