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      復(fù)合益生菌發(fā)酵不同基料乳酸菌飲料中揮發(fā)性代謝物差異分析

      2021-04-22 06:25:50韓之皓王月嬌王記成張和平
      中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2021年3期
      關(guān)鍵詞:基料代謝物乳酸菌

      韓之皓,郭 帥,黃 天,鄭 巖,王月嬌,白 梅,王記成,張和平

      (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018)

      乳酸菌飲料是指以乳或乳制品為原料,經(jīng)化料、水合、殺菌,接種發(fā)酵劑所得發(fā)酵基料,按照一定比例混入水、食品添加劑(甜味劑、酸味劑、穩(wěn)定劑)調(diào)配后制得的飲料。乳酸菌飲料作為健康飲品以其獨(dú)特的風(fēng)味和優(yōu)質(zhì)的保健功效贏得廣大消費(fèi)者的追捧。相關(guān)資料顯示,近5年,世界乳酸菌飲料市場(chǎng)份額不斷增加,其市場(chǎng)規(guī)模超過500 億美元[1]。益生菌是一類能夠改善宿主腸道菌群平衡并有效增強(qiáng)食用者身體健康水平的活性有益微生物,其具有改善便秘、緩解腹瀉、抗腫瘤、保護(hù)口腔健康等重要生理功效[2];Buriti 等[3]應(yīng)用L.rhamnosus LR-32 和B.lactis BB12 復(fù)配發(fā)酵山羊乳清飲料,并添加適量的膳食纖維,所得產(chǎn)品在貯藏期(4 ℃、24 d)內(nèi)活菌數(shù)維持在1×108CFU/g 以上,膳食纖維的添加能夠改善山羊乳清飲料的口感、風(fēng)味并增進(jìn)其功能特性,活性乳酸菌飲料將菌株的益生特性與乳制品的健康功效完美結(jié)合,同時(shí)乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種維生素、有機(jī)酸、抗菌肽等生物活性物質(zhì)能夠有效提高產(chǎn)品的功能特性。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要針對(duì)基礎(chǔ)發(fā)酵劑在發(fā)酵乳中的產(chǎn)香機(jī)理進(jìn)行研究,而對(duì)于復(fù)合益生菌在發(fā)酵乳制品中的揮發(fā)性代謝物及產(chǎn)香機(jī)制研究較少。Karacali 等[4]研究開菲爾粒對(duì)雙蛋白乳飲料(按牛奶與豆奶質(zhì)量比17∶3 混合)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),應(yīng)用開菲爾粒發(fā)酵能夠促進(jìn)雙蛋白飲料中雙乙酰、乙偶姻等具有脂肪香、奶油氣息等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生,降低其(E)-2-己烯醛、1-己醇等致豆腥味揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (SPME-GCMS)具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、分析范圍廣等特點(diǎn),目前,該技術(shù)主要用于乳制品、肉制品以及發(fā)酵果蔬中風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)[5]。

      本研究以含有8 株菌株的復(fù)合益生菌發(fā)酵3種基料的乳酸菌飲料為對(duì)象,應(yīng)用SPME-GC-MS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析乳酸菌飲料發(fā)酵及貯藏期內(nèi)揮發(fā)性代謝物的變化,通過OAV 值確定乳酸菌飲料中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),對(duì)3 種基料的乳酸菌飲料整體風(fēng)味進(jìn)行比較預(yù)測(cè),為復(fù)合益生菌的商業(yè)化應(yīng)用及活性乳酸菌飲料的研發(fā)提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料與儀器

      1.1.1 試驗(yàn)菌株 本試驗(yàn)所用益生菌(見表1)直投式發(fā)酵劑由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

      表1 菌株信息Table 1 Information of strains

      1.1.2 儀器與試劑 SRH60-70 高壓均質(zhì)機(jī),上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司;電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B GC system-5977A MSD),賽默飛世爾科技有限公司;色譜柱 (HP-5 毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm,0.25 μm),賽默飛世爾科技有限公司;手動(dòng)固相微萃?。⊿PME)進(jìn)樣手柄(USA,SUP-ELCO),賽默飛世爾科技有限公司;固定搭載裝置及50/30 μm 二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取頭,賽默飛世爾科技有限公司;陶瓷加熱磁力攪拌器 (Corning),美國(guó)Agilent 公司;脫脂乳粉(蛋白質(zhì)含量33%),新西蘭NZMP;濃縮乳清蛋白粉 (蛋白質(zhì)含量80%),美國(guó)HILMAR 公司;大豆分離蛋白粉 (蛋白質(zhì)含量95%,富吉普樂200),吉林不二蛋白有限公司;C3-C9 正構(gòu)烷烴混標(biāo)(AccuStandard,USA)、C10-C25 正構(gòu)烷烴混標(biāo)(AccuStandard,USA)、丙酮(色譜純)、甲醇(色譜純)、1,2-二氯苯(色譜純)等均購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。

      1.2 試驗(yàn)方法

      1.2.1 乳酸菌飲料的制備 分別將脫脂乳粉(12.1%)、乳清蛋白粉(5.0%)、大豆分離蛋白粉(4.2%)與葡萄糖(2%)混合溶解于預(yù)熱至55 ℃的蒸餾水中,水合30 min,85 ℃殺菌15 min,冷卻至37 ℃,將復(fù)合菌株按照總接種量5×106CFU/g 接入3 種不同發(fā)酵基料中,具體接種量如表2所示,3種發(fā)酵基料蛋白質(zhì)含量均為4%,然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵,待到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)得發(fā)酵基料(復(fù)合益生菌在3 種基料中生長(zhǎng)至穩(wěn)定期);將發(fā)酵基料與預(yù)先溶解并冷卻的穩(wěn)定劑、甜味劑混合,調(diào)配,20 MPa 均質(zhì),所得樣品(蛋白質(zhì)含量均為1%)即為發(fā)酵基料不同的3 種乳酸菌飲料。

      表2 樣品中菌株添加量Table 2 The addition of strain in samples

      1.2.2 發(fā)酵前及貯藏期內(nèi)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭,對(duì)發(fā)酵前及發(fā)酵結(jié)束后貯藏0,14,28 d 的脫脂乳飲料、豆乳飲料、乳清飲料進(jìn)行富集,每組3 個(gè)平行,隨后應(yīng)用GC-MS 技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。

      1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件與測(cè)定條件

      1)色譜條件 載氣為He,流速1.0 mL/min;不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度250 ℃。程序升溫方式,起始溫度為35 ℃,保持5 min 后以5 ℃/min 的速率上升至140 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min 的速率上升至250 ℃,保持3 min。

      2)質(zhì)譜條件 全掃描模式;EI 離子源;電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;質(zhì)量掃描范圍m/z 35~500;無(wú)溶劑延遲。

      3)SPME 萃取條件 50 ℃平衡60 min。

      4)解吸附條件 250 ℃條件下解吸附3 min。

      1.2.4 定性、定量分析 定性方法:利用隨機(jī)攜帶Masshunter 工作站NIST 11 標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)比對(duì),挑選匹配率≥85%的物質(zhì)作為鑒定結(jié)果,同時(shí)依據(jù)Vandendool 等[6]的方法測(cè)定保留指數(shù)(retention indices,RI),根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的RI 值對(duì)發(fā)酵乳樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行再次鑒定,RI 值計(jì)算公式如下:

      式中:RT(z)、RT(z+1)和RT(x)分別為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)為Z、Z+1 和待測(cè)物x 的保留時(shí)間,且RT(z)

      定量方法:在5 mL 發(fā)酵樣品中添加質(zhì)量濃度為0.01 μg/L 的內(nèi)標(biāo)物1,2-二氯苯溶液50 μL,樣品中各組分風(fēng)味物質(zhì)的濃度可代入公式(2)計(jì)算:

      式中:Ci——待測(cè)樣品中各風(fēng)味化合物質(zhì)量濃度,μg/L;Cs——1,2-二氯苯質(zhì)量濃度,μg/L;Ai——樣品中待測(cè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰面積;As——內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積。

      1.2.5 香氣活度值評(píng)價(jià)法 在對(duì)乳酸菌飲料中揮發(fā)性風(fēng)味化合物定量的基礎(chǔ)上,以各風(fēng)味化合物在水中的風(fēng)味閾值作為參考,計(jì)算能表征風(fēng)味化合物貢獻(xiàn)率的物理量——香氣活度值(odor activity value,OAV)[7-8]??纱牍剑?)計(jì)算:

      式中:OAVi——風(fēng)味化合物i 的香氣活度值;Ci——乳酸菌飲料中揮發(fā)性風(fēng)味化合物質(zhì)量濃度,μg/L;OTi——所測(cè)風(fēng)味化合物在水中的氣味閾值。

      1.3 數(shù)據(jù)處理

      應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行顯著性、主成分分析處理,使用Origin lab 2017、SIMCA-P 14.1作圖。

      2 結(jié)果分析

      2.1 活性乳酸菌飲料揮發(fā)性代謝物分析

      結(jié)合表3與圖1可知,除了萃取頭帶來(lái)的少量硅氧烷類雜質(zhì),3 種不同基料的乳酸菌飲料在發(fā)酵前、發(fā)酵結(jié)束及貯藏過程中總計(jì)12 組樣品共檢測(cè)出107 種揮發(fā)性物質(zhì),其中包括21 種醛類、17 種酮類、13 種酸類、23 種醇類、5 種酯類、17 種芳香族及烷烴類、7 種含氮化合物、4 種其它化合物。發(fā)酵前的脫脂乳飲料、豆乳飲料、乳清飲料中分別檢測(cè)出31,29,27 種揮發(fā)性物質(zhì),發(fā)酵結(jié)束時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量分別為46,46,41 種,貯藏結(jié)束時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量為43,45,39 種;乳制品在發(fā)酵過程中,乳酸菌及其產(chǎn)生的酶類通過分解代謝碳水化合物、蛋白質(zhì)等一系列生物化學(xué)過程形成揮發(fā)性副產(chǎn)物,其中在糖酵解途徑中,乳酸菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸,進(jìn)而通過檸檬酸代謝等多種代謝途徑產(chǎn)生醛類、酮類、酸類和醇類化合物,在蛋白質(zhì)水解途徑中,其通過蛋白酶分解蛋白質(zhì)形成肽類和氨基酸等多種代謝物,其中部分氨基酸等小分子物質(zhì)進(jìn)一步形成揮發(fā)性芳香化合物,而這一系列揮發(fā)性副產(chǎn)物的形成對(duì)發(fā)酵乳制品的滋氣味和風(fēng)味起到?jīng)Q定性的作用[9-12]。

      以脫脂乳為發(fā)酵基料的乳酸菌飲料經(jīng)發(fā)酵后,酮類化合物、酸類化合物和醇類化合物發(fā)生顯著變化(P<0.05),其中,乙偶姻、雙乙酰、2-壬酮、2-十一酮等酮類化合物在脫脂乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生,貯藏期內(nèi),2-壬酮、2-十一酮含量逐漸降低,乙偶姻含量由4.72 μg/L 增加至8.02 μg/L,雙乙酰由9.26 μg/L 降至3.96 μg/L,在乳糖代謝過程中,α-乙酰乳酸合成酶催化丙酮酸形成α-乙酰乳酸,隨后α-乙酰乳酸脫羧酶作用于α-乙酰乳酸合成乙偶姻,同時(shí)部分α-乙酰乳酸通過化學(xué)氧化脫羧合成雙乙酰,雙乙酰通過雙乙酰還原酶同樣能夠形成乙偶姻[13-14],這可能是貯藏期內(nèi)兩種重要的酮類化合物含量變化的主要原因;乳酸菌在脫脂乳中的生長(zhǎng)過程中,乳酸、乙酸等酸類化合物含量不斷增加,乳酸能夠通過EMP 途徑、HMP 途徑及HK途徑產(chǎn)生,當(dāng)乳酸菌生長(zhǎng)在葡萄糖受限的情況下,通過丙酮酸代謝產(chǎn)生乙酸,在貯藏過程中,隨著活性乳酸菌飲料酸度不斷增加,發(fā)酵菌株產(chǎn)酸活力減弱,后期酸類化合物含量逐漸開始下降;1-庚醇、糠醇、2-十一醇等醇類化合物在脫脂乳發(fā)酵過程中不斷增加,貯藏期間逐漸降低。

      豆乳飲料發(fā)酵前后主要在醛類化合物、酮類化合物、酸類化合物和醇類化合物上存在顯著差異(P<0.05),其中己醛、苯甲醛、(E)-2-己烯醛等揮發(fā)性代謝物在豆乳發(fā)酵及貯藏過程中含量不斷降低,己醛是亞油酸的一級(jí)氧化產(chǎn)物[15],苯甲醛由苯丙氨酸降解形成[16],乙醛、3-甲基丁醛在豆乳發(fā)酵過程中不斷增加,貯藏期間其含量逐漸下降,乳酸菌能夠通過丙酮酸脫羧、蘇氨酸代謝等多條代謝途徑產(chǎn)生乙醛,其中蘇氨酸在蘇氨酸醛縮酶的作用下降解產(chǎn)生乙醛是其主要代謝途徑,豆乳飲料在貯藏過程中乙醛含量逐漸降低可能是因?yàn)椴糠忠胰┰谝胰┻€原酶的作用下形成乙醇引起的[17-18],在氨基酸的分解代謝過程中,亮氨酸的轉(zhuǎn)氨化形成α-酮異己酸,隨后α-酮異己酸在α-酮酸脫氫酶的作用下通過非氧化性脫羧合成3-甲基丁醛[19];乙偶姻、2-羥基-3-戊酮、2-十三烷酮、4-甲基-3-庚酮等酮類化合物于豆乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生,隨著貯藏時(shí)間的增加其含量逐漸下降;辛酸、己酸、正癸酸等酸類化合物及正已醇、正辛醇、2-壬烯-1-醇等醇類化合物在豆乳發(fā)酵及貯藏過程中含量不斷增加。

      圖1 乳酸菌飲料樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量及數(shù)量Fig.1 Content and quantity of volatile flavor compounds in Lactobacillus beverages

      Q28 Q14------7.92 8.71--0.21 0.41 0.76 0.72------------1.34 1.21 1.46 1.42 0.22 0.32--------------3.06 3.21--0.86 0.84果結(jié)析GC-MS 分質(zhì)物味風(fēng)性發(fā)揮中程過藏貯及前酵發(fā)料飲菌酸乳3表Analysis of volatile flavor compounds in Lactobacillus beverages before fermentation and during storage by GC-MS-1·L/μg量含別鑒RI參考RI計(jì)算RT Q0 QW D28 D14 D0 DW T28 T14 T0 TW法方--3.09 3.21 8.92-----MS--2.32--1.36 1.54 2.84 0.52 3.91 4.01 4.98-MS NF 638 2.81-----1.24----MS NF 688 3.45 14.01---------,RI MS 702 702 3.68--1.39 1.48 1.69 0.11----,RI MS 697 704 3.74 0.65---------MS,RI 750 722 5.12 0.41 2.86 0.25 0.32 0.41 8.42 0.20 0.23 0.37 1.07,RI MS 809 808 6.66-----8.72 22.40 21.30 2.03-,RI MS 862 863 8.92----19.17 3.74 0.19 0.28 4.42-,RI MS 910 908 10.60-1.10---3.98---2.70,RI MS 970 970 13.21--0.18 0.21 0.01-----MS,RI 1 139 1 065 16.18--0.13 0.15 0.65-4.86 4.26 3.32-,RI MS 1 067 1 065 16.19-1.61--------MS NF 1 099 17.30 0.63 2.88 0.11 0.14 0.18 4.91---2.13,RI MS 1 119 1 111 17.70 0.09 1.86 0.37 0.43 0.52 2.82---1.65 MS,RI 1 204 1 214 20.79 1.26---------,RI MS 1 181 1 222 21.02------0.92 0.96 1.74-MS NF 1 233 21.35 0.33---------,RI MS 1 242 1 280 22.66--0.71 0.79 0.93 1.36----MS NF 1 372 25.15------0.16 0.19 2.19 3.22 MS NF 1 415 26.34--0.43 0.52 0.86-----MS NF 1 481 28.26------3.96 4.32 9.26-MS--2.26----5.72-----MS NF 641 2.85 3.72 1.23--------,RI MS 685 681 3.37--3.43 3.72 4.80-8.02 7.78 4.72-,RI MS 706 707 3.83 0.76---------,RI MS 733 732 4.55 Table 3 稱名文中物合醛乙醛丁基3-羥醛烯二己,4-)-2,E(E醛戊正醛丁基甲3-醛烯(E)-戊醛己醛烯己)-2-(E醛庚醛甲苯醛烯(E)-2-壬醛烯辛)-2-(E醛一十-基甲2-醛壬醛癸醛甲苯基甲二,4-2醛糠基甲羥5-醛烯癸)-2-(E醛桃醛烷二十醛桂月物合酰乙雙酮-3-庚基4-甲酮戊2-姻偶乙酮丁異基甲號(hào)編化類醛1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21化類酮22 23 24 25 26

      Q28 Q14 Q0 QW D28----2.36----0.28----6.04----0.64-----0.27 0.29 0.35------2.97-----1.21 1.31 2.19-0.65 4.71 4.98 5.23-1.00 5.76 5.97 6.62 1.02 3.96----------2.01 1.98 1.03-2.41-------------------0.41----1.23----11.41 0.23 0.16--0.27 2.25 2.13 1.84-15.62----0.43----0.53--0.24-0.59-1·L/μg量含D14 D0 2.96 3.38 0.32 0.44 6.32 6.51 0.74 0.28----3.84 5.24--0.59 0.42 0.58 0.50 4.32 5.68----2.25 1.43------0.38 0.21 1.02 0.78 10.97 5.30 0.24 0.32 13.96 6.49 0.37-0.45-0.51-DW T28 T14 T0 TW-0.69 0.78 1.21-0.05----5.95 7.01 7.16 8.22 5.32 5.03-----1.48 1.32 1.25 0.72-----0.03---0.37 1.57 2.62 2.78 3.52 1.73 3.61 14.97 15.32 18.03-3.58 13.98 14.56 26.07-------0.34 0.47 0.87----17.18 2.54 0.92 2.69 2.84 31.88-2.32--3.21--3.25 3.56 4.13--28.41 26.32 9.27-------1.42 1.34 0.99--0.25 0.37 1.27--0.11 0.06-----0.94------------0.13 0.21 0.79-別鑒法方,RI MS MS MS,RI MS,RI MS,RI MS MS MS,RI,RI MS MS,RI MS MS MS MS MS MS MS MS,RI MS,RI MS,RI MS MS MS MS MS RI參考RI計(jì)算RT 821 822 7.36 NF 891 9.97 889 889 10.19 NF 897 10.20 962 951 12.21 1 003 999 14.01 NF 1 036 15.21 1 046 1 041 15.41 1 088 1 099 17.32 NF 1 301 23.27 1 491 1 488 28.54 NF 1 688 32.58--1.75--1.97 NF 783 6.02 NF 891 9.98 NF 923 11.16 1 020 1 017 13.64 NF 1 173 19.58 1 178 1 193 20.20 1 226 1 276 22.54 NF 1 380 25.35 NF 1 403 25.99 NF 1 693 32.66 NF 2 176 38.15酸羧-)3表(續(xù)稱名文中號(hào)編酮戊-3-基羥2-27酮丁-2-基甲)-3-(S 28酮2-庚29酮已-基甲5-30酮庚-3-基甲5-31酮辛2-32酮-2-烯庚-3-基甲5-33-2-酮烯3-辛34酮壬2-35酮一十2-36酮烷三十2-37酮烷五十環(huán)38物合化類酸酮醇-3-三,5-,4-1醇己環(huán)39酸乙40酸酮丙41酸乳42酸丁基羥4-43酸己44酸甲苯45酸辛46酸壬47酸癸正48酸辛基7-氧49酸烯四十-9-基甲Z-8-50酸烷八十51

      Q28 23.41-----22.01 0.48-0.33-0.58 3.21 1.14-1.97 14.14-----1.54-----Q14 22.01-----25.40 0.54-0.31-0.62 3.56-1.81 13.62-----1.59-----Q0 QW D28 5.89 7.18 4.99--7.93----0.68---1.48---34.10 15.01 0.51 0.98 4.12----0.28 0.74 0.57---0.87 1.01-4.52--0.93----1.45 0.36 3.05 0.44 11.64 7.84---------1.22---0.71--1.68 3.03 0.56--------1.48--1.13----1·L/μg量含D14 D0 5.04 6.62 8.42 10.38----1.39 1.13--0.62 1.01----0.51 0.39-------0.65 1.23 0.08 0.52 1.40------1.42 3.24----0.63 1.87----1.63 2.34 1.43 3.64--DW T28 T14 T0 TW-2.04 1.93--0.47 0.12 0.19------0.24---4.32 0.82-----7.42-----16.03 18.00 21.00 12.34-0.62 0.75 1.02 0.19 0.23 1.64 1.58 0.12-------1.06 1.12 1.89--0.79 0.84 1.09 1.32------------------1.29 2.00------0.78 0.82 2.23--0.10 0.21 8.24-------0.11 0.23 1.47---------1.56 9.57----6.15-5.68 5.76 6.01---------------3.21別鑒法方MS MS MS,RI MS,RI MS MS,RI,RI MS,RI MS MS,RI MS MS MS MS,RI,RI MS MS MS,RI,RI MS,RI MS MS MS MS MS MS MS,RI MS MS,RI MS,RI MS RI RI 參考計(jì)算RT--2.04 NF 654 3.02 NF 714 4.01 767 763 5.43 880 878 9.42 882 880 9.57 964 962 12.68 980 973 13.02 979 981 13.50 NF 1 079 16.63 NF 866 9.02 NF 1 010 14.38 1 084 1 108 17.58 1 186 1 179 19.77 NF 1 193 20.20 1 277 1 277 22.62 1 279 1 279 22.65 1 303 1 309 23.47 NF 1 479 28.21 NF 1 481 28.26 NF 1 488 28.46 NF 1 715 32.99 NF 1 721 33.08 NF 921 11.08 1 014 1 009 14.11 NF 1 179 19.75 1 204 1 205 20.55 1 244 1 221 21.01)3表(續(xù)稱名文中號(hào)編物合化類醇醇乙)-基氨(甲2-52醇三丁,-,3,2 1 53醇-2-烯庚3-54醇丁基甲3-55醇已正56醇1-己57醇庚1-58醇烯四-庚-順59-3-醇烯1-辛60醇辛正61醇糠62醇己環(huán)基乙4-63醇2-壬64醇壬正65醇-1-烯壬2-66醇-1-辛基2-丁67醇癸-1-基甲2-68醇一十2-69醇癸環(huán)70醇九十1-71醇-1-烯癸)-2-(Z 72醇烷六十-1-基甲2-73醇烷十1-二74物合化類酯酯內(nèi)丁75酯乙酸己76酯壬酸己77酯乙酸辛78酯烯乙酸己79

      -1·L/μg量含Q28 Q14 Q0 QW D28 D14 D0-------------0.53 1.80 1.69 1.47 4.81---0.46 0.52 3.52 1.46---2.82 3.02 3.42 7.19---0.50 0.57 0.58 2.22-------1.18 1.34 2.42--------------0.19 0.23 0.53----0.69 0.87 0.91 1.66---0.09 0.12 0.34 0.68---0.86 0.86 0.87 1.49 0.11 0.13 0.30 1.82 1.89 2.43 3.03 0.54 0.65 0.90----------5.60-----------------19.01 19.84 19.84----15.02 15.52 19.24 16.17 1.11 1.32 3.53 0.29 0.34 3.98--------0.09 0.11 0.50-------0.44 0.57 0.61 1.79 2.03 2.56 1.88-------0.15 0.19 0.27------------------,28 d,14 0藏貯及前酵發(fā)示表別分、Q28、Q14、Q0;QW料飲乳考參對(duì)比過通指;RI質(zhì)物該性定庫(kù)譜NIST 11過通指;MS數(shù)DW T28 T14 T0 0.78---0.12---------------------------1.55----------------0.19 0.24 3.36-0.60 0.67 9.97--------0.09----0.23 0.32 2.32----3.06 2.32 2.43 4.25-----0.11 0.14 1.54-0.14 0.21 1.57 25.77 0.80 0.71 11.30 0.62--------0.37 0.34 0.42-0.35 0.38 0.43豆的,28 d,14 0藏貯及前酵發(fā)示表指留??紖⒌膽?yīng)對(duì)到找查中庫(kù)據(jù)數(shù))3表(續(xù)別鑒RI參考RI計(jì)算RT稱名文中號(hào)編TW法方物合化烴烷及族香芳-MS-1.84烷戊80-MS NF 872 9.25苯甲二對(duì)81 0.87 MS NF 1 022 14.77酚苯)-基乙基甲二,1-(1,4-bis 2 82-MS NF 1 034 15.14烯D-苧83-,RI MS 1164 1 107 17.55烷一十基甲2-84-MS NF 1 207 20.60烷二十85-MS NF 1 280 22.67烯壬)-5-(Z 86 0.73 MS NF 1 288 22.90烷一十-基甲2-87 1.17 MS NF 1 316 23.65烷四十二基甲2-88-MS NF 1 335 24.16烯壬-1-基甲三,8-,6 4 89 0.19 MS NF 1 407 26.09烷四十正90 1.13 MS NF 1 505 28.93烷癸基甲四,8-,5,3 2 91 1.33 MS NF 1 509 29.03烷五十正92 5.01 MS NF 1 520 29.27烷七十基甲四,14-,10,6 2 93 3.46 MS NF 1 608 31.24烯六十1-94 1.28 MS NF 1 722 33.08烷碳四十正-基甲三,10-,6 2 95-MS NF 1 732 33.23烷十二基7-己96物合化氮含5.47 MS--1.05酸氨丙D-97-MS--1.28酸氨丙98 3.66 MS--1.35胺基乙基己環(huán))-1-(+)-(S 99-MS NF 811 6.92胺基乙基己100 R-(-)-環(huán)-MS NF 891 9.96胺甲二101-MS NF 924 11.21烷戊基氨-2-基甲102 4-7.96 MS NF 926 11.27肟苯基氧甲103-MS NF 898 10.23烷丁基甲-3-它氯104 1-其-MS NF 1 296 23.13醚乙-烯乙基庚甲105 6--,RI MS 702 697 3.58烷戊氯106 2--MS NF 1 746 33.42醚基烯乙基烷八十107別分、D28、D14、D0;DW料飲乳脂脫的,28 d,14 0藏貯及前酵發(fā)示表別分、T28、T14、T0:TW注該在未指;NF數(shù)指留保的得所算計(jì)烴烷構(gòu)正列系一-C 25 C 6由;RI間時(shí)留保指;RT料飲清乳的。質(zhì)物該出測(cè)檢未”指;“-質(zhì)物該性定數(shù)指留保

      乳清飲料發(fā)酵前后主要在酮類化合物、醇類化合物、芳香族及烷烴化合物和含氮化合物上存在顯著差異(P<0.05);2-戊酮、2-辛酮、2-壬酮、2-十一酮、2-十三烷酮等酮類化合物及1-庚醇、2-壬醇等醇類化合物在乳清發(fā)酵過程中不斷增加,在貯藏過程中,隨著貯藏時(shí)間的推移其含量逐漸降低,其中,2-壬酮由辛酸的β-氧化和癸酸的脫羧反應(yīng)生成[20];2-甲基十一烷、十二烷、正十四烷、正十五烷等烷烴化合物及丙氨酸、甲氧基苯肟等含氮化合物在乳清發(fā)酵及貯藏過程中其含量逐漸降低。

      2.2 活性乳酸菌飲料揮發(fā)性代謝物主成分分析

      對(duì)發(fā)酵前,發(fā)酵結(jié)束及貯藏期間乳酸菌飲料中所檢測(cè)到的8 類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析,結(jié)果如圖2所示:3 種不同基料的乳酸菌飲料區(qū)分明顯,而相同基料的乳酸菌飲料在貯藏期內(nèi)分布接近,以上結(jié)果表明:不同基料的乳酸菌飲料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后,揮發(fā)性代謝物明顯不同,而相同基料的乳酸菌飲料在貯藏期間 (T14-T28、D14-D28、Q14-Q28)揮發(fā)性代謝物變化較小;以脫脂乳為發(fā)酵基料的乳酸菌飲料中,酮類化合物、醛類化合物、酸類化合物聚集在第一,二主成分正向端,且貢獻(xiàn)較大,酮類化合物通過糖酵解、部分氨基酸的降解、脂肪酸的氧化以及相關(guān)微生物的代謝形成,具有甜香、清香和脂肪的油膩氣息[21-22],醛類化合物多為中間體化合物,化學(xué)性質(zhì)活潑,是發(fā)酵乳制品中重要的呈味物質(zhì)[23],酸類化合物一般為C2-C10的飽和脂肪酸,主要形成于蛋白質(zhì)和脂肪的水解代謝途徑,對(duì)乳酸菌飲料的滋味產(chǎn)生影響并賦予其清爽口感[24-25]。以豆乳為發(fā)酵基料的乳酸菌飲料中,酯類化合物聚集在第一主成分正向端,且貢獻(xiàn)較大,發(fā)酵乳制品中的酯類物質(zhì)是由酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)或環(huán)化反應(yīng)形成的,由于其閾值較低,對(duì)發(fā)酵乳制品的風(fēng)味影響較為明顯,能夠賦予其奶酪香和花香[26-28];以乳清為發(fā)酵基料的乳酸菌飲料中,醇類化合物、含氮化合物聚集在第二主成分正向端,且貢獻(xiàn)較大,醇類化合物的形成與甲基酮還原、亞油酸降解及碳水化合物的代謝有關(guān),其能夠與乳香平衡,更好地改善發(fā)酵乳制品的口感[29],含氮化合物閾值較高,對(duì)發(fā)酵乳制品的整體風(fēng)味影響相對(duì)較小[30]。

      圖2 乳酸菌飲料主成分得分圖和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖Fig.2 Score scatter plot and loading scatter plot of volatile flavor components in Lactobacillus beverages

      2.3 活性乳酸菌飲料主要揮發(fā)性代謝物的主成分分析

      活性乳酸菌飲料中各揮發(fā)性物質(zhì)的種類、含量及閾值共同決定其整體風(fēng)味,香氣活性值(OAV)是指香氣組分濃度與其在水中香味閾值的比值,能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)單一香氣組分對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度[31]。不同基料乳酸菌飲料發(fā)酵前、發(fā)酵結(jié)束及貯藏期間主要風(fēng)味物質(zhì)的OAV 值見表4。通常將OAV≥1 的物質(zhì)認(rèn)定為樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物,對(duì)整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)作用,而0.1≤OAV<1 的組分對(duì)樣品的整體風(fēng)味有重要修飾作用[32]。本研究對(duì)OAV≥0.1 的24 種主要揮發(fā)性代謝物進(jìn)行主成分分析,由圖4可知,3 種不同基料的乳酸菌飲料區(qū)別明顯,而相同基料的乳酸菌飲料在貯藏期間分布接近,以上結(jié)果表明,不同基料的乳飲料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后,主要揮發(fā)性代謝物明顯不同而相同基料的乳酸菌飲料在貯藏期間主要揮發(fā)性代謝物變化較小。

      脫脂乳飲料在發(fā)酵后及貯藏期與乙偶姻、3-羥基丁醛、雙乙酰、2-壬酮、2-十一酮、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-己烯醛、4-羥基丁酸、3-甲基-1-丁醇、己酸乙酯等10 種OAV≥0.1 的揮發(fā)性物質(zhì)有較強(qiáng)相關(guān)性。乙偶姻作為發(fā)酵乳制品中常見的風(fēng)味物質(zhì)具有令人愉快的弱奶油香味,略帶甜味,雙乙酰賦予發(fā)酵乳制品較重的奶油香味、類似堅(jiān)果仁的風(fēng)味[13-14],3-羥基丁醛、庚醛、2-壬酮、2-十一酮等具有果香、脂肪香、奶甜味,(E)-2-辛烯醛、(E)-2-己烯醛等烯醛類化合物具有類似橘子皮的風(fēng)味[33],3-甲基-1-丁醇能夠賦予發(fā)酵乳制品麥芽香、花香的風(fēng)味[34]。

      圖3 乳酸菌飲料主成分得分圖和關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分載荷圖Fig.3 Score scatter plot and loading scatter plot of key volatile flavor components in Lactobacillus beverages

      Q28 Q14 Q0------0.66 0.73 1.17---0.18 0.34 0.54 0.17 0.16 0.09---------------1.34 1.21 0.63 1.46 1.42 0.09--1.08------0.0014 0.0015 0.0017------0.0054 0.006 0.007值OAV應(yīng)對(duì)及質(zhì)物味風(fēng)性鍵關(guān)中料飲菌酸乳4表Key flavor substances and corresponding OAV values in lactic acid bacteria beverages Table 4 OAV覺感QW D28 D14 D0 DW T28 T14 T0 TW a值閾-0.36 0.37 1.03-----8.7-0.05 0.06 0.11 0.02 0.14 0.15 0.18-27---------12-1.16 1.23 1.41 0.09----1.2---------1.2 0.63 0.06 0.07 0.09 1.87 0.04 0.05 0.08 0.24 4.5----0.05 0.12 0.11 0.01-190---6.39 1.25 0.06 0.09 1.47-3 0.37---1.33---0.90 3-2.22 2.63 0.06-----0.08-0.04 0.05 0.22-1.62 1.42 1.11-3 2.88 0.11 0.14 0.18 4.91---2.13 1 1.86 0.37 0.43 0.52 2.82---1.65 1---------0.3-----1.72 1.88 4.03-2.3---1.06-----5.4 0.0006--------2150-0.06 0.07 0.09-0.15 0.14 0.09-55-0.04 0.05 0.05 0.04 0.05 0.05 0.06 0.04 140---------50稱名文中物合化類醛醛乙醛丁基羥3-醛戊正醛丁基甲3-醛烯戊)-(E醛己醛烯己)-2-(E醛庚醛甲苯醛烯壬)-2-(E醛烯(E)-2-辛醛壬醛癸醛烯癸)-2-(E物合化類酮酰乙雙酮庚-3-基甲4-酮戊2-姻偶乙酮庚2-酮辛2-

      Q28 Q14 Q0 QW D28 0.24 0.26 0.44-0.13 0.02 0.02 0.02-0.003 0.00009 0.00009 0.00005-0.0001---------0.0001----0.02 0.00007 0.00005--0.00009 0.0008 0.0007 0.0006-0.05---0.17------0.07 0.08 0.10 0.05 0.002----------0.13 0.14 0.18------1.45 0.002 0.001 0.0003 0.002 0.0003----------OAV D14 D0 0.12 0.08 0.002 0.002 0.0001 0.00007--0.0001 0.00007 0.02 0.01 0.00008 0.0001 0.005 0.002----0.002 0.003------1.23 0.08 0.0004 0.001---0.002 DW T28 T14 T0 0.72 2.99 3.06 3.61 0.01 0.05 0.06 0.10 0.00004 0.0001 0.0001 0.001-0.12 0.11 0.04-----0.0005 0.0007 0.003-0.00004 0.00002----0.0003---1.08 0.03----0.05 0.05 0.06 0.15 1.09 1.05 0.08-0.0002 0.0002 0.0004-----------0.0009-0.41 0.41 0.43 0.0006---。TW--------0.21-0.04----0.002--質(zhì)物的出測(cè)覺感a值閾5 255 22 000 240 3 000 500 3 000 3 000 4 250 330 1.5 5 000 25 1 1 300 14 200檢未分部;“-”指值)4表(續(xù)稱名文中酮壬2-酮一十2-物合化類酸酸乙酸丁基4-羥酸己酸辛酸壬酸癸正物合化類醇醇丁基3-甲醇己1-醇庚1-醇-3-烯辛1-醇糠醇壬2-醇-1-烯壬2-醇辛-1-基丁2-物合化類酯酯乙酸己物合化烴烷及族香芳苯甲二對(duì)閾的中水在質(zhì)物各a 指:注

      豆乳飲料在發(fā)酵后及貯藏期與乙醛、3-甲基丁醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛、2-壬烯-1-醇等5 種OAV≥0.1 的揮發(fā)性物質(zhì)有較強(qiáng)的正相關(guān)性。乙醛是發(fā)酵乳制品中重要的風(fēng)味化合物之一,具有果香、清香味,適量的乙醛能夠提供給發(fā)酵乳制品較好的風(fēng)味[17-18]。相關(guān)研究表明,豆乳中的豆腥味主要來(lái)源于脂肪氧化酶催化亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸形成各類揮發(fā)性呈味物質(zhì),己醛、苯甲醛、戊醇、1-己醇、(E,E)-2,4-癸二烯醛等風(fēng)味化合物呈現(xiàn)青草味、生味、磨茹、辛辣味,被定義為豆腥味化合物,乳酸菌發(fā)酵能夠有效降低并去除豆腥味[35-36];由表3可知,以豆乳為發(fā)酵基料的乳酸菌飲料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后,己醛、苯甲醛、1-己醇等致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)的含量顯著降低 (P<0.05),同時(shí)產(chǎn)生3-甲基丁醛、(E)-2-壬烯醛等賦予發(fā)酵乳制品巧克力、青草香的風(fēng)味物質(zhì)[37]。

      乳清飲料在發(fā)酵后及貯藏期與正戊醛、(E)-戊烯醛、2-壬醇、壬醛、癸醛、1-庚醇等6 種OAV≥0.1 的揮發(fā)性物質(zhì)有較強(qiáng)的相關(guān)性,正戊醛、壬醛、癸醛等醛類化合物具有清爽的芳香味、脂肪氣息,1-庚醇具有土質(zhì)、油質(zhì)的風(fēng)味[38]。

      3 結(jié)論

      本研究以8 株分離源明確,有良好益生特性的益生菌為發(fā)酵菌株,研究復(fù)合益生菌對(duì)3 種基料(脫脂乳粉、濃縮乳清蛋白粉和大豆分離蛋白粉)的乳酸菌飲料揮發(fā)性代謝物的影響。利用SPME-GC-MS 技術(shù)定性定量分析乳酸菌飲料發(fā)酵前、發(fā)酵結(jié)束及貯藏過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化,共檢測(cè)出107 種揮發(fā)性物質(zhì),其中包括21種醛類、17 種酮類、13 種酸類、23 種醇類、5 種酯類、17 種芳香族及烷烴類、7 種含氮化合物、4 種其它化合物。對(duì)揮發(fā)性代謝物成分的主成分分析結(jié)果表明:不同基料的乳酸菌飲料經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵后,揮發(fā)性代謝物明顯不同,相同基料的乳酸菌飲料在貯藏期間揮發(fā)性代謝物變化較小。對(duì)主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(OAV≥0.1)進(jìn)行主成分分析結(jié)果表明:在貯藏期的脫脂乳飲料中,乙偶姻、3-羥基丁醛、雙乙酰、2-壬酮、2-十一酮、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-己烯醛、4-羥基丁酸、3-甲基-1-丁醇、己酸乙酯等10 種揮發(fā)性物質(zhì)貢獻(xiàn)較大;在貯藏期的豆乳飲料中,乙醛、3-甲基丁醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛、2-壬烯-1-醇等5 種揮發(fā)性物質(zhì)貢獻(xiàn)較大并呈正相關(guān)性,且發(fā)酵后的豆乳飲料中己醛、苯甲醛等致豆腥味揮發(fā)性物質(zhì)的含量顯著降低(P<0.05),同時(shí)產(chǎn)生3-甲基丁醛、(E)-2-壬烯醛等賦予豆乳飲料良好風(fēng)味的揮發(fā)性物質(zhì);在貯藏期的乳清飲料中,正戊醛、(E)-戊烯醛、2-壬醇、壬醛、癸醛、1-庚醇等6 種OAV≥0.1 的揮發(fā)性物質(zhì)貢獻(xiàn)較大。本研究為復(fù)合益生菌的商業(yè)化應(yīng)用及活性乳酸菌飲料的研制開發(fā)提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

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