膨壓處理對(duì)冬棗薄壁組織細(xì)胞微觀力學(xué)特性的影響

朱韻昇，張海紅，邱 雪，吳寶婷

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川750021）

冬棗主要以鮮食為主，而質(zhì)地是影響其鮮食品質(zhì)的主要因素，果肉組織細(xì)胞壁內(nèi)外滲透壓差產(chǎn)生的膨壓決定著其質(zhì)地品質(zhì)[1]。膨壓是植物細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力的主要來(lái)源。細(xì)胞內(nèi)的膨壓是均勻的、各向同性的，對(duì)細(xì)胞壁的應(yīng)力不均一，與細(xì)胞壁厚度、形狀、性質(zhì)有關(guān)[2]。膨壓作用于鮮棗的細(xì)胞壁上，使棗具有飽滿、堅(jiān)硬和新鮮的外觀。冬棗的果皮較薄，木質(zhì)素含量少，果肉主要是薄壁組織，含水量高，且棗的比表面積大，在貯藏過程中因呼吸和蒸騰作用，薄壁細(xì)胞極易失水皺縮，引起細(xì)胞內(nèi)的膨壓減小、水分流失、質(zhì)地品質(zhì)下降。研究不同膨壓下冬棗組織細(xì)胞微觀力學(xué)特性的變化，對(duì)冬棗的貯藏保鮮具有重要意義。

果蔬組織細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)主要由細(xì)胞壁決定，如彈性、剛度、黏附力等都取決于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、形狀以及組成成分[3]。吳杰[4]、Oey[5]、Belie[6]等通過振蕩剪切、單軸壓縮、拉伸、穿刺等試驗(yàn)方法，研究膨壓變化對(duì)果蔬組織的宏觀黏彈性力學(xué)性質(zhì)的影響。近年來(lái)，隨著原子力顯微技術(shù)的進(jìn)步，原子力顯微鏡已成為研究生物細(xì)胞微觀力學(xué)特性的有效工具，被廣泛應(yīng)用于生命和食品科學(xué)領(lǐng)域。原子力顯微鏡通過探針與樣品表面接觸產(chǎn)生的相互作用力得到力-距離曲線，通過分析曲線，來(lái)獲取樣品的彈性模量、剛度、黏附力等微觀力學(xué)參數(shù)的局部變化。Pérez 等[7]使用原子力顯微鏡研究楊氏模量在蘋果組織和分離細(xì)胞中的分布，結(jié)果表明蘋果分離細(xì)胞的E 值分布較窄，楊氏模量平均值為（0.63±0.42）MPa，而蘋果組織的楊氏模量為（0.86±0.81）MPa。Zdunek 等[8]用原子力顯微鏡研究梨采收前、后初生細(xì)胞壁楊氏模量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采收前隨著梨的成熟，細(xì)胞壁楊氏模量E 值呈線性下降，采收后呈上升趨勢(shì)。目前，大多數(shù)研究集中于常膨壓狀態(tài)下果蔬細(xì)胞壁力學(xué)特性的研究，而針對(duì)不同膨壓狀態(tài)下的果蔬微觀力學(xué)特性研究鮮有報(bào)道。本文利用不同濃度的甘露醇溶液對(duì)冬棗薄壁組織進(jìn)行滲透處理，使冬棗薄壁細(xì)胞處于不同的膨壓狀態(tài)，并利用原子力顯微鏡對(duì)不同膨壓下冬棗薄壁細(xì)胞進(jìn)行納米壓痕試驗(yàn)，從微觀力學(xué)層面揭示冬棗薄壁組織細(xì)胞膨壓變化對(duì)細(xì)胞壁力學(xué)特性的影響，以期為冬棗貯藏期間溫、濕度的調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

冬棗采摘于寧夏靈武大泉林場(chǎng)紅棗基地，選擇新鮮飽滿、果皮外表無(wú)損傷、大小均勻的棗果，置于4 ℃，相對(duì)濕度85%～95%的冰箱中貯藏。

甘露醇（C6H14O6），磷酸氫二鉀（K2HPO4），磷酸二氫鉀（KH2PO4），明膠，試驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

原子力顯微鏡AFM （型號(hào)：PicoPlus），美國(guó)Agilent 公司；Si3N4探針（型號(hào)：PSA400，彈性系數(shù)0.18 N/m），日本Olympus 公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：LlGB-27）。

1.3 冬棗薄壁組織膨壓處理方法

參考時(shí)蘭春[2]質(zhì)壁分離法，對(duì)冬棗薄壁組織細(xì)胞滲透處理，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的方式來(lái)改變細(xì)胞膨壓；甘露醇作為一種非離子性滲透劑，很難進(jìn)入細(xì)胞中，但可以引起細(xì)胞滲透壓的改變，因此本試驗(yàn)以甘露醇作為冬棗薄壁細(xì)胞的滲透劑[9]。

配制0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50，0.55，0.60，0.65 mol/L 的甘露醇溶液各5 mL。取冬棗的果肉薄壁組織細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，試樣的切片尺寸為10 mm×10 mm，厚度不超過5 mm，迅速投入含有不同濃度甘露醇溶液的試管中，使其完全浸沒，約15 min。自高濃度開始依次取出冬棗組織切片于滴有相同濃度溶液的載玻片上，輕蓋蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象，每1制片觀察的細(xì)胞不應(yīng)少于100 個(gè)，記錄質(zhì)壁分離的相對(duì)程度。通過觀察，確定使半數(shù)細(xì)胞原生質(zhì)剛從細(xì)胞壁角隅處分離時(shí)的最低濃度和不引起細(xì)胞質(zhì)壁分離的最高濃度，細(xì)胞等滲溶液的濃度等于這兩種濃度的平均值。

試驗(yàn)表明，0.55 mol/L 甘露醇溶液是引起半數(shù)細(xì)胞質(zhì)壁分離的最低濃度下限；而0.35 mol/L 的甘露醇溶液是細(xì)胞不發(fā)生質(zhì)壁分離的最高濃度上限。由此確定0.45 mol/L 的甘露醇溶液為冬棗細(xì)胞的等滲點(diǎn)，以等滲點(diǎn)甘露醇溶液的濃度為標(biāo)準(zhǔn)，配置高滲點(diǎn)為0.8 mol/L 的甘露醇溶液和低滲點(diǎn)0.1 mol/L 的甘露醇溶液，處理冬棗薄壁組織，獲得不同膨壓狀態(tài)的冬棗薄壁細(xì)胞。

依據(jù)公式：

式中：P——膨壓，MPa；ψw——總水勢(shì)，MPa；ψs——滲透勢(shì)，MPa。

理論上估算出在0.1 mol/L 的低濃度甘露醇溶液中，細(xì)胞的膨壓上升0.35 mol/L，0.45 mol/L 的甘露醇溶液中細(xì)胞的膨壓下降為零，0.8 mol/L 的甘露醇溶液中，細(xì)胞的膨壓下降為-0.35 mol/L[2]。

1.4 原子力顯微鏡壓痕試驗(yàn)

試驗(yàn)前，將冬棗薄壁組織切成矩形薄片（10 mm×10 mm，厚度不超過5 mm），表面平整。用剛加熱好的明膠溶液固定于35 mL 培養(yǎng)皿中，倒入對(duì)應(yīng)濃度的甘露醇溶液，甘露醇溶液體積約為培養(yǎng)皿容量的2/3，同時(shí)滴加2～3 滴0.02 mol/L K2HPO4和0.02 mol/L KH2PO4配置的緩沖液（pH值5.2），使冬棗組織充分浸泡30 min，改變細(xì)胞的膨壓狀態(tài)[10]。

使用原子力顯微鏡自帶的熱調(diào)諧適配器（Themo K）獲取探針的彈性系數(shù)，將處理好的冬棗組織樣品置于載物臺(tái)上。將探針移動(dòng)到冬棗細(xì)胞上方，通過接觸模式，在液體環(huán)境中對(duì)冬棗細(xì)胞進(jìn)行壓痕獲取力-距離曲線（如圖1）。不同處理組每次試驗(yàn)前多次測(cè)量敏感度進(jìn)行校正。根據(jù)冬棗的自身特性，隨機(jī)選擇冬棗薄壁組織上細(xì)胞的位置，這些位置的選擇靠近細(xì)胞核，施加一個(gè)垂直于細(xì)胞表面的力，避免壓痕不垂直時(shí)產(chǎn)生的潛在偏差。每片組織隨機(jī)選取20 個(gè)細(xì)胞點(diǎn)，每個(gè)細(xì)胞重復(fù)壓痕10 次，共獲取200 條力-距離曲線，探針加載速度為4 μm/s[11]。

根據(jù)赫茲模型分析探針逼近曲線，得到楊氏模量。

圖1 AFM 力-距離曲線Fig.1 AFM force-distance curve

錐形探針，赫茲模型滿足以下方程：

式中：F——探針對(duì)細(xì)胞施加的壓力；E——楊氏模量；v——泊松比；α——探針半開角；δ——壓痕深度。在此試驗(yàn)中，選擇泊松比為0.5，α 半開角為35°。

2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用原子力顯微鏡自帶的AtomicJ 軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析不同膨壓下，冬棗薄壁組織細(xì)胞楊氏模量和黏附力的分布差異以及表觀剛度的變化；采用SPSS 22.0 軟件對(duì)不同膨壓處理組楊氏模量和黏附力進(jìn)行方差分析，表達(dá)式形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同膨壓下長(zhǎng)棗組織細(xì)胞楊氏模量的分布

楊氏模量可以表征冬棗的彈性狀態(tài)，利用原子力顯微鏡得到的力-距離曲線，采用AtomicJ 統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，自動(dòng)計(jì)算生成不同膨壓下的楊氏模量E，并繪制分布直方圖。

從圖2a～c 中可知，高膨壓（0.1 mol/L）時(shí)，冬棗細(xì)胞的楊氏模量E 值分布范圍在2～30 kPa，平均楊氏模量E=（6.76±7.57）kPa；常膨壓（0.45 mol/L）時(shí)，冬棗細(xì)胞的楊氏模量E 值分布范圍較廣在5～90 kPa，平均楊氏模量E=（20.21±16.95）kPa；低膨壓（0.8 mol/L）時(shí)，冬棗細(xì)胞的楊氏模量分布較窄在1～20 kPa，平均楊氏模量E=（5.58±4.24）kPa，且3 種膨壓下的楊氏模量均呈偏正態(tài)分布。

從圖3可知，常膨壓（0.45 mol/L）下楊氏模量E 值分布范圍大于低、高膨壓處理組，且存在異常值較多；而低、高膨壓處理組的楊氏模量E 值分布范圍相差較小，異常值較少。膨壓從高到低，楊氏模量的分布范圍表現(xiàn)出先增大后減小，剔除異常值后，高、低膨壓的楊氏模量的分布范圍均不超過20 kPa?？赡苁怯捎诙瑮棻”诮M織為多空隙的疏松結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間距較大。當(dāng)冬棗組織處于高膨壓（0.1 mol/L）時(shí)細(xì)胞吸水膨脹，細(xì)胞間隙減小，細(xì)胞壁受到較大的膨壓刺激而出現(xiàn)脹破損傷，同時(shí)高膨壓下可能使細(xì)胞壁中的果膠甲酯酶活性增加[12]，細(xì)胞壁中果膠網(wǎng)絡(luò)遭到破壞，使得細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致楊氏模量值較常壓時(shí)減小。而低膨壓時(shí)（0.8 mol/L），由于細(xì)胞中水分外滲，細(xì)胞間呈現(xiàn)分離趨勢(shì)，細(xì)胞質(zhì)膜收縮，微絲微管隨細(xì)胞質(zhì)膜收縮而彎曲，部分細(xì)微管消失，細(xì)胞膜內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞器開始解體[2]，細(xì)胞變得柔軟而富有黏性，細(xì)胞的楊氏模量下降。

圖2 不同膨壓水平冬棗薄壁組織楊氏模量分布圖Fig.2 Distribution of young’s modulus of parenchyma of Winter jujube at different turgor levels

圖3 不同膨壓楊氏模量分布箱形圖Fig.3 Box diagram of young’s modulus distribution at different turgor pressures

3.2 不同膨壓下冬棗薄壁組織細(xì)胞表觀剛度值的變化

果實(shí)在貯藏過程中，薄壁細(xì)胞膨壓的改變伴隨著果實(shí)的成熟軟化，而細(xì)胞壁表觀剛度更能直觀地反映果實(shí)的軟化狀況[13]。植物細(xì)胞的剛度值大小主要取決于細(xì)胞壁的性質(zhì)和形狀，其值的大小，由力-壓痕深度曲線線性部分的斜率表示。見圖4，不同膨壓下力-壓痕曲線所示，斜率越大表示表觀剛度值越大[14]。

從圖5可知，低膨壓（0.1 mol/L）時(shí)表觀剛度較另外兩種膨壓處理小，平均剛度值k=（0.008±0.002）N/m；常膨壓（0.45 mol/L）時(shí)，表觀剛度值大于低、高膨壓處理組，平均剛度值k=（0.018±0.004）N/m；而高膨壓時(shí)，剛度值與常膨壓相比略有下降，平均剛度值k=（0.013±0.003）N/m；這與Beauzamy 等[14]所揭示的洋蔥細(xì)胞表觀剛度值隨溶液滲透壓變化的趨勢(shì)略有差異，原因可能為采用0.1 mol/L 甘露醇溶液處理時(shí)，組織細(xì)胞吸水膨脹，使得細(xì)胞處于極高的膨壓下，且冬棗薄壁組織相較于洋蔥表皮組織細(xì)胞的細(xì)胞壁薄，在高膨壓下會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷，使得在測(cè)試時(shí)細(xì)胞的表觀剛度值下降。當(dāng)冬棗細(xì)胞處于高濃度的甘露醇溶液中，薄壁組織細(xì)胞處于低膨壓下，此時(shí)，細(xì)胞為維持滲透平衡而失水皺縮，細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜完全實(shí)現(xiàn)質(zhì)壁分離，細(xì)胞壁折疊變形，細(xì)胞體積減小，微絲骨架隨細(xì)胞質(zhì)膜的收縮而彎曲，此時(shí)細(xì)胞壁剛度值下降但幅度較小。此外，所選取的滲透劑種類[13-15]、滲透液濃度范圍[14]、AFM 壓痕深度的不同[16]也可能造成結(jié)果差異。

圖4 不同膨壓水平冬棗薄壁組織細(xì)胞力-壓痕曲線Fig.4 Cell force-indentation curve of parenchyma tissue of Winter jujube at different turgor pressure levels

3.3 不同膨壓下長(zhǎng)棗薄壁組織細(xì)胞黏附力的分布

膨壓的改變，必然引起細(xì)胞黏性的變化[17]。采用AtomicJ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，自動(dòng)計(jì)算生成不同膨壓下的黏附力值，并繪制黏附力分布直方圖。

圖5 不同膨壓水平冬棗薄壁組織細(xì)胞表觀剛度柱形圖Fig.5 Column diagram of apparent stiffness of parenchyma cells at different turgor levels

從圖6a～c 可知，高膨壓（0.1 mol/L）黏附力分布范圍在8～750 pN，平均黏附力F=（102.06±163.55）pN；常膨壓（0.45 mol/L）黏附力分布范圍在30～900 pN，平均黏附力F=（178.41±141.59）pN；且高膨壓、常膨壓黏附力都呈正偏態(tài)分布；低膨壓（0.8 mol/L）黏附力分布范圍集中在40～500 pN，平均黏附力F=（187.96±76.17）pN，且呈現(xiàn)正態(tài)分布。

從圖7可知，高膨壓時(shí)，存在的異常值明顯多于其它膨壓處理組，而低膨壓（0.8 mol/L）幾乎不存在異常值；剔除異常值后，冬棗薄壁細(xì)胞的黏附力分布范圍隨著膨壓的下降，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。主要原因可能是隨著甘露醇濃度升高，冬棗薄壁細(xì)胞所受膨壓下降，對(duì)細(xì)胞壁的作用力減小，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微管微絲作用力增大，而細(xì)胞骨架具有調(diào)節(jié)細(xì)胞所受應(yīng)力大小、控制細(xì)胞黏附強(qiáng)度的特性[18]，細(xì)胞骨架與細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜是一個(gè)連續(xù)體[19]，當(dāng)細(xì)胞骨架所受應(yīng)力增加時(shí)，肌動(dòng)蛋白微絲開始聚集，同時(shí)應(yīng)力的增加刺激了連接細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)膜類整合素、鈣黏素等跨膜蛋白黏附分子[2]，導(dǎo)致細(xì)胞壁跨膜蛋白含量增加，冬棗組織細(xì)胞壁的黏附強(qiáng)度增大，黏附力增加。

圖6 不同膨壓水平冬棗薄壁組織細(xì)胞黏附力分布圖Fig.6 Distribution of cell adhesion in parenchyma of Winter jujube at different turgor pressure levels

另一方面，植物細(xì)胞壁中纖維素與半纖維素通過氫鍵相連形成網(wǎng)絡(luò)，親水性果膠和少量結(jié)構(gòu)蛋白鑲嵌于網(wǎng)絡(luò)中。當(dāng)冬棗薄壁細(xì)胞經(jīng)滲透液處理時(shí)，滲透液濃度造成的膨壓改變會(huì)引起細(xì)胞壁中果膠酶、纖維素酶含量的變化，進(jìn)而使得纖維素、半纖維素、果膠的結(jié)構(gòu)、含量及排列方式產(chǎn)生相應(yīng)變化[20-21]，這必然導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成成分的改變，細(xì)胞壁中半纖維素、果膠等多糖物質(zhì)被相應(yīng)酶分解析出，附著在細(xì)胞壁表面導(dǎo)致冬棗薄壁組織細(xì)胞在不同膨壓下的黏附力差異。

圖7 不同膨壓水平下黏附力分布箱形圖Fig.7 Box diagram of adhesion force distribution at different turgor levels

3.4 不同膨壓下冬棗組織細(xì)胞楊氏模量和黏附力的差異分析

從表1中可以得出：冬棗薄壁組織細(xì)胞在常膨壓（0.45 mol/L）下的楊氏模量E 平均值大于低、高膨壓處理組，且楊氏模量E 值與低、高膨壓的楊氏模量E 值相比有顯著性差異（P<0.05）；高膨壓（0.1 mol/L）時(shí)黏附力平均值與另兩種膨壓處理有顯著性差異（P<0.05）。在低膨壓（0.8 mol/L）時(shí)表現(xiàn)出最低的楊氏模量和最高的黏附力，而在高膨壓下（0.1 mol/L）存在較高的楊氏模量和最低的黏附力，這與Rojas 等[22]通過應(yīng)力松弛試驗(yàn)對(duì)不同膨壓下甜瓜黏彈特性變化的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本文通過不同濃度的甘露醇溶液改變冬棗組織細(xì)胞的膨壓狀態(tài)，利用原子力顯微鏡探索不同膨壓下冬棗薄壁組織細(xì)胞的微觀力學(xué)特性變化。研究結(jié)果如下：

1）冬棗薄壁細(xì)胞的楊氏模量隨著膨壓的下降表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。楊氏模量E 值在常膨壓（0.45 mol/L）時(shí)的分布范圍較廣，而在另外兩組膨壓處理下分布范圍相差較?。槐碛^剛度值在不同膨壓狀態(tài)下的大小變化與楊氏模量E 值的分布范圍大小基本一致，表明冬棗薄壁細(xì)胞楊氏模量E 值的變化可以反映其剛度值的變化規(guī)律。

2）冬棗薄壁細(xì)胞的黏附力隨著膨壓的下降呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，這與細(xì)胞壁中果膠等多糖物質(zhì)的降解，以及細(xì)胞中類整合素、鈣黏素等跨膜黏附蛋白分子含量增加有一定的關(guān)系。

表1 不同膨壓下棗組織細(xì)胞的楊氏模量和黏附力方差分析結(jié)果Table 1 Results of variance analysis of young’s modulus and adhesion force of jujube tissue cells at different turgor pressure

3）從不同膨壓下楊氏模量E 和黏附力的方差分析結(jié)果中可以得出常膨壓（0.45 mol/L）時(shí)楊氏模量E 值與高膨壓、低膨壓有顯著性差異（P＜0.05）；高膨壓（0.1 mol/L）時(shí)黏附力與低膨壓、常膨壓有顯著性差異（P＜0.05）。

綜上所述，不同膨壓狀態(tài)導(dǎo)致冬棗薄壁組織細(xì)胞微觀力學(xué)特性差異，進(jìn)而引起冬棗整果質(zhì)地品質(zhì)的變化，該研究可為冬棗采后貯藏保鮮提供一定理論依據(jù)。