冷休克處理提高嗜酸乳桿菌的凍干存活率

王曉萌，甄 妮，田啟遠(yuǎn)，葉聰艷，曾小群*，潘道東，陳小虎

（1 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室 浙江寧波315211 2 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江寧波315211）

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）作為第3 代乳酸菌發(fā)酵劑，廣泛用于發(fā)酵乳制品、微生態(tài)制劑和藥物制劑生產(chǎn)中[1]，可緩解乳糖不耐癥，抑制腸道中的致病菌，增強(qiáng)免疫力，抑制癌癥的發(fā)展等[2]。冷凍干燥法是有效保存菌種和制備直投式發(fā)酵劑的方法之一，包括預(yù)凍、升華、解析3 個過程。菌體的細(xì)胞在低溫和干燥雙重脅迫下，會遭受損傷，從而導(dǎo)致存活率降低[3]。主要有以下幾點原因：首先，細(xì)胞在冷凍干燥過程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的溶液處于低溫環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)、外水分凍結(jié)而生成冰晶以及復(fù)水時產(chǎn)生的重結(jié)晶，會對菌體造成物理傷害，喪失正常的生理代謝功能而死亡[4]；其次，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞其完整性和流動性，導(dǎo)致生物膜功能喪失，最終使細(xì)胞的正常生理代謝發(fā)生紊亂[5-8]；同時，冷凍會改變細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，讓細(xì)胞內(nèi)、外物質(zhì)的轉(zhuǎn)換過程失去正?？刂芠9]。

當(dāng)前，針對乳酸菌凍干保護(hù)的研究集中在以下4 個方面。第一，添加凍干保護(hù)劑，主要包括糖類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和脫脂乳等[10]；第二，優(yōu)化菌體生長培養(yǎng)條件，包括優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，調(diào)節(jié)菌體的生長環(huán)境，控制菌體的生長時間，選擇合適的菌體培養(yǎng)時間[11]；第三，優(yōu)化冷凍干燥條件，包括溫度及濃縮菌體方式等[12]；第四，脅迫預(yù)處理，主要包括冷脅迫和饑餓脅迫等[13]。本試驗以嗜酸乳桿菌為模式菌株，優(yōu)化提高凍干存活率的冷休克預(yù)處理條件，并結(jié)合復(fù)合凍干保護(hù)劑，獲得一種提高乳酸菌凍干存活率的新方法，為制備活性直投式發(fā)酵劑提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室的嗜酸乳桿菌ATCC4356、MRS 肉湯、MRS 瓊脂、甘油、葡萄糖、脫脂乳、山梨糖醇、生理鹽水、無菌水等。

1.2 設(shè)備及儀器

LDZX-50KB 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JB090312-02 超凈工作臺，蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；SPX-150 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，常州華冠儀器制造有限公司；LGJ-10 普通實驗型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DW-86L828J-80 ℃超低溫冰箱，杭州諾丁科學(xué)器材。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化和擴(kuò)大培養(yǎng) 將-40 ℃下的嗜酸乳桿菌菌種，接種至MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃放置8 h，活化得到種子培養(yǎng)液。然后以1%的接種量，接種至7 瓶100 mL 的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后得到發(fā)酵液。菌種活化和擴(kuò)大培養(yǎng)都需要在超凈工作臺中進(jìn)行，以確保整個過程不會受到其它菌種的影響[14-16]。

1.3.2 生長曲線的測定 活化后的菌種以1%的接種量接種至MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃放置32 h，每隔4 h 取100 μL 樣液，測定600 nm 處OD 值，并用逐級稀釋涂布法測定每個時間點的活菌數(shù)，繪制生長曲線[17]。

1.3.3 冷凍干燥條件及存活率的測定 冷凍干燥條件：發(fā)酵液中的細(xì)胞進(jìn)行離心（5 000 r/min，10 min），并用10 mL 生理鹽水洗凈3 次后，收集菌體，棄發(fā)酵液上清，將沉淀在-80 ℃冰箱預(yù)冷12 h后冷凍干燥（真空9 Pa，冷凝溫度-49 ℃）24 h。

活菌數(shù)的測定采用平板計數(shù)法。將各菌液梯度稀釋至10-7，10-8，取這2 個濃度梯度菌液均勻涂布于MRS 瓊脂的平板上，37 ℃放置24 h 后計數(shù)，分別做3 個平行，最后結(jié)果取其平均數(shù)[18]。

1.3.4 單因素試驗

1）菌體收集時間 將嗜酸乳桿菌以1%的接種量，接種至100 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)6，8，10，12，14 h 后，各平均分為2 部分，試驗組4 ℃冰箱冷休克處理15 h，對照組在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)相同時間，調(diào)兩個組的OD 值至相同數(shù)值后，進(jìn)行離心、預(yù)凍、凍干等操作。測定兩組凍干前后的活菌數(shù)，找出存活率最高的菌體收集時間。

2）冷休克處理溫度 將菌液37 ℃培養(yǎng)10 h后，試驗組分別以0，4，8，12，16 ℃冷休克處理15 h，對照組在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)相同時間，調(diào)兩個組的OD 值至相同數(shù)值后，進(jìn)行離心、預(yù)凍、凍干等操作，計算存活率。

3）冷休克處理時間 將活化后的嗜酸乳桿菌于37 ℃培養(yǎng)10 h 后，試驗組4 ℃冷休克分別處理5，10，15，20，25 h；對照組于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)相同時間。試驗組和對照組調(diào)至相同的OD 值，再離心、預(yù)凍、凍干，計算凍干前、后的存活率。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，運用Design Expert 8.0.6 內(nèi)Box-Behnken 設(shè)計試驗，選擇各因素適合的參數(shù)，把嗜酸乳桿菌的凍干存活率作為響應(yīng)值，把菌體收集時間、冷休克處理溫度、冷休克處理時間作為三因素三水平的中心組合進(jìn)行響應(yīng)面試驗[19]，試驗設(shè)計見表1。

1.3.6 冷休克處理結(jié)合復(fù)合凍干保護(hù)劑 根據(jù)單因素試驗優(yōu)化結(jié)果確定的最佳冷休克條件，設(shè)計4 組試驗P1（冷休克，添加保護(hù)劑），P2（未冷休克，添加保護(hù)劑），P3（冷休克，未添加保護(hù)劑），P4（未冷休克，未添加保護(hù)劑），探究冷休克和凍干保護(hù)劑對嗜酸乳桿菌凍干存活率的交互影響[20-22]。添加復(fù)合凍干保護(hù)劑配方為脫脂乳10%、葡萄糖10%、山梨糖醇1.5%及甘油2.5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定

如圖1a 所示，嗜酸乳桿菌在8～12 h 生長最快，12 h 菌數(shù)達(dá)最大值，進(jìn)入穩(wěn)定期。以生長曲線為參考，選定6，8，10，12，14 h 作為菌體培養(yǎng)的收集時間進(jìn)行試驗。

2.2 單因素試驗測定結(jié)果

2.2.1 菌體收集時間對嗜酸乳桿菌凍干存活率的影響 嗜酸乳桿菌菌體收集時間即冷休克處理前菌的培養(yǎng)時間。經(jīng)冷休克處理的各試驗組菌的存活率顯著，均高于各對應(yīng)的對照組（圖1b）（P＜0.05）。試驗組和對照組菌的存活率均在10 h 達(dá)到最高，第6～10 小時呈上升趨勢，第10～14 小時呈下降趨勢。故選取培養(yǎng)至對數(shù)末期（第10 小時）作為最佳菌體收集時間，再進(jìn)行冷休克處理。

2.2.2 冷休克處理溫度對嗜酸乳桿菌凍干存活率的影響 冷休克對照組的嗜酸乳桿菌存活率僅為45%左右，而冷休克組的嗜酸乳桿菌存活率高達(dá)55%～60%，說明冷休克處理可顯著提高嗜酸乳桿菌存活率（圖1c）（P＜0.05）。其中，在8 ℃下嗜酸乳桿菌存活率最大，為最適冷休克溫度。

2.2.3 冷休克處理時間對嗜酸乳桿菌凍干存活率的影響 冷休克對照組的嗜酸乳桿菌存活率僅為18%～28%，而冷休克組的嗜酸乳桿菌存活率都比同一條件下的對照組高，表明冷休克處理可顯著提高嗜酸乳桿菌存活率（圖1d）（P＜0.05）。冷休克處理時間為15 h 時嗜酸乳桿菌存活率最高。

圖1 嗜酸乳桿菌在MRS 中的生長曲線（a）、菌體收集時間（b）、冷休克處理溫度（c）、冷休克處理時間（d）對嗜酸乳桿菌凍干存活率的影響Fig.1 The growth curve of L.acidophilus in MRS broth （a）and the effect of collection time of bacterial （b），the temperature（c）and treating time （d）for cold shock treatment on the survival rate of L.acidophilus after freeze-drying

2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面試驗的因素水平編碼見表1；Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果見表2；利用Design-Expert.8.0.6，剔除不顯著因子得出經(jīng)冷休克處理后LA 凍干存活率Y 的回歸方程為：

Y=45.54+0.21A-0.26B+0.71C-2.500AB+0.10AC+0.10BC-2.04A2-1.52B2-4.80C2

得到了冷休克處理的最佳條件是：菌體收集時間10 h，冷休克溫度8 ℃，冷休克時間15 h。在這個條件組合下，嗜酸乳桿菌的凍干存活率最高。驗證試驗測得在該條件下，嗜酸乳桿菌凍干存活率為59.76%，其與理論上的60.70%相對誤差在1%以內(nèi)，吻合度高；顯著高于未經(jīng)冷休克處理的凍干存活率（36.68%，P＜0.05）。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 對表內(nèi)數(shù)據(jù)做多元回歸擬合和分析模型的方差，如表3。其中F 值是2 814.57，P<0.0001，表明模型極顯著。A、B、C 3 個一次項表現(xiàn)得非常顯著，表明涉及到的3 個條件對嗜酸乳桿菌凍干存活率均有顯著影響；二次項A2、B2、C2偏回歸系數(shù)達(dá)非常顯著的水平。由上述的F 值可得出，對LA 凍干存活率的影響能力依次為：C>B>A，即冷休克時間>冷休克溫度>菌體收集時間；模型的P>0.05，表明失擬性不顯著，方程對試驗擬合較好，該模型能夠準(zhǔn)確模擬出各因素對LA 凍干存活率的影響；R2值為0.9956，擬合度高，可正確描述試驗結(jié)果。

表1 Box-Behnken 中心因素組合水平編碼表（三因素三水平）Table 1 Independent variables and coded levels in Box-Behnken experimental design

2.4 響應(yīng)面及等高線分析結(jié)果

嗜酸乳桿菌的存活率隨著菌體收集時間和冷休克溫度的升高而先增大后減小，等高線接近于圓形，表明菌體收集時間與冷休克溫度之間的相互作用不顯著（圖2a）。嗜酸乳桿菌存活率隨著冷休克處理時間的增加而呈先上升后下降的趨勢，冷休克處理時間約為15 h 時達(dá)到最高值，輪廓呈現(xiàn)橢圓形，表明冷休克處理時間和菌體收集時間之間相互作用影響顯著，且冷休克時間影響更大（圖2b）。隨著菌體收集時間的增加，嗜酸乳桿菌凍干存活率呈先增大后減小的態(tài)勢，在冷休克處理時間為15 h，溫度為8 ℃時，LA 凍干存活率最高，輪廓呈現(xiàn)橢圓，等高線隨時間軸向比較致密，表現(xiàn)出冷休克時間和冷休克溫度之間顯著的交互作用（圖2c）。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 The results of response surface tests

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the established regression model

2.5 冷休克結(jié)合凍干保護(hù)劑對凍干存活率影響的探究結(jié)果

根據(jù)單因素試驗優(yōu)化結(jié)果確定的最佳冷休克條件，設(shè)計4 組試驗探究冷休克和凍干保護(hù)劑對嗜酸乳桿菌凍干存活率的交互作用。測得P1、P2、P3、P4 4 組嗜酸乳桿菌存活率分別為96.64%，78.99%，55.38%，21.42%。結(jié)果表明經(jīng)冷休克處理并添加凍干保護(hù)劑組最高（96.64%），比未冷休克、添加凍干保護(hù)劑組（78.99%），冷休克、未添加凍干保護(hù)劑組（55.38%），未冷休克、未添加凍干保護(hù)劑組（21.42%）分別提高了17.65%，41.26%，75.22%。說明冷休克和凍干保護(hù)劑的交互作用對嗜酸乳桿菌凍干存活率有顯著提高。

圖2 冷休克溫度與冷休克時間（a）、菌體收集時間與冷休克時間（b）、菌體收集時間與冷休克溫度（c）交互作用對嗜酸乳桿菌凍干存活率的影響響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagram for the interaction effect of cold shock temperature and cold shock time （a），bacterial collection time and cold shock time （b），bacterial collection time and cold shock temperature （c）on L.acidophilus freeze storage rate

圖3 冷休克結(jié)合凍干保護(hù)劑對凍干存活率影響結(jié)果Fig.3 Effect of cold shock combined with freeze-drying protectant on the survival rate after freeze-drying

3 結(jié)果與討論

冷休克處理提高菌體凍干存活率的作用機(jī)理與冷休克蛋白、細(xì)胞膜的流動性、嗜冷酶作用有關(guān)[23-26]。Jeffery 等[23]發(fā)現(xiàn)菌體經(jīng)冷休克后，產(chǎn)生了冷休克蛋白（Csps），使細(xì)胞膜上的酶不容易發(fā)生變化，防止酶發(fā)生變性而損害細(xì)胞。經(jīng)冷休克處理后，細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量增加，有利于維持細(xì)胞膜的流動性，提高微生物細(xì)胞對冷凍干燥的耐受性[24-25]。Eroglu 等[26]報道了微生物菌體內(nèi)的嗜冷酶在冷休克低溫條件下，其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保持了與底物的結(jié)合能力，仍具有較高的催化活性，提高了細(xì)胞的抗凍干能力。

凍干保護(hù)劑的應(yīng)用越來越廣泛。曹永梅等[27]研究發(fā)現(xiàn)，凍干保護(hù)劑能通過抑制氧化酶的活性，阻止菌體在冷凍干燥過程中發(fā)生氧化反應(yīng)，保持細(xì)胞的完整性和生理活性。呂加平等[28]認(rèn)為，保護(hù)劑和水的混合物在冷凍干燥時發(fā)生了玻璃化，使蛋白質(zhì)分子表面具有黏性，不容易形成結(jié)晶，從而保持其穩(wěn)定性。Prakash 等[29]通過研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑分子中的羥基能通過冷凍干燥過程中形成的氫鍵連接蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)，形成近似于水化膜的保護(hù)層，避免蛋白質(zhì)變性引起細(xì)胞損傷。張光磊等[30]提出，細(xì)胞膜蛋白優(yōu)先與水分子結(jié)合，保護(hù)劑分子在其周圍維持內(nèi)部結(jié)構(gòu)不受破壞。冷凍干燥過程中膜質(zhì)的相轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，加入凍干保護(hù)劑可以降低Tm，防止復(fù)水時細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變回液晶態(tài)而導(dǎo)致的細(xì)胞膜滲漏，從而提高細(xì)胞的存活率[31]。

本試驗獲得了冷休克處理結(jié)合凍干保護(hù)劑提高嗜酸乳桿菌存活率的最優(yōu)條件。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)10 h 時收集菌體，于8 ℃冷休克處理15 h，結(jié)合復(fù)合凍干保護(hù)劑，使嗜酸乳桿菌冷凍干燥后的存活率可以提高至96.64%。比未冷休克、添加凍干保護(hù)劑組（78.99%），冷休克、未添加凍干保護(hù)劑組 （55.38%），未冷休克、未添加凍干保護(hù)劑組（21.42%）分別提高了17.65%，41.26%，75.22%；表明在冷凍干燥前進(jìn)行冷休克預(yù)處理，是一種有效提高乳酸菌抗凍干脅迫能力的新途徑。本試驗得到的凍干存活率高于王菡等[32]僅篩選利用凍干保護(hù)劑（72.15%），李春等[33]僅利用8 ℃冷休克處理（62.35%）的嗜酸乳桿菌的存活率。說明冷休克處理結(jié)合凍干保護(hù)劑，可對菌體細(xì)胞形成雙重保護(hù)作用，效果好于僅使用1 種保護(hù)方法，且操作方法方便快捷。這對乳酸菌產(chǎn)品的保存及直投式發(fā)酵劑的生產(chǎn)均具有重要的理論與實踐意義。