干酪乳桿菌發(fā)酵對脫脂薏米營養(yǎng)品質(zhì)的影響

王清爽，高 珊，朱靈靈，陳曉明，徐 磊

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 江蘇淮安223003）

薏米（Coix lachryma-jobi L.），一年生或多年生草本植物，廣泛種植于中國、韓國等亞洲國家，營養(yǎng)保健功能和藥用價值較高，是一種被廣泛應(yīng)用的藥食兩用資源[1]。薏米含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類、多糖及多酚類物質(zhì)[2-3]，被譽為“世界禾本科植物之王”。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為薏米具有去濕利尿等功效，而現(xiàn)代科學(xué)研究還表明薏米具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗癌和抗腫瘤等作用[4-6]。薏米油是薏米中的一種重要功能性組分，占薏米質(zhì)量的5.14%～9.40%[2]，具有較強的藥用價值，被開發(fā)成多種商業(yè)化藥用制劑，廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療或輔助治療[7-8]。然而，薏米提油后產(chǎn)生大量的脫脂薏米殘渣，目前主要用于動物飼料或被直接丟棄，嚴重制約了相關(guān)企業(yè)的經(jīng)濟效益提升，因此對脫脂薏米進行深加工和綜合利用具有重要的意義。

近年來，發(fā)酵成為谷物深加工的一個重要方式，顯示出巨大的潛力，谷物發(fā)酵不僅可以降低抗營養(yǎng)因子水平，還可以調(diào)整其營養(yǎng)和感官品質(zhì)，進一步提高生物活性[9]。Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵薏米黃豆?jié){能顯著降低高血脂小鼠的膽固醇水平，減輕氧化應(yīng)激。Wang等[11]使用枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵薏米、板栗、蓮子和核桃，所得產(chǎn)物的多酚和黃酮含量得到顯著提高，抗氧化活力顯著增強。Liang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，薏米和大米經(jīng)裂蹄木層孔菌固態(tài)發(fā)酵后非揮發(fā)性的呈味物質(zhì)顯著增加。然而，利用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵脫脂薏米，研究其發(fā)酵過程中的營養(yǎng)品質(zhì)變化，國內(nèi)外尚未見報道。

本試驗中采用干酪乳桿菌發(fā)酵脫脂薏米，研究發(fā)酵時間對脫脂薏米pH 值和TTA、蛋白分子質(zhì)量分布、游離氨基酸、多酚、抗氧化活性及酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響，以期闡明脫脂薏米營養(yǎng)品質(zhì)在發(fā)酵過程中的動態(tài)變化，為其深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

薏米，貴州鑫龍食品開發(fā)有限公司；干酪乳桿菌 （1011CFU/g），山東中科嘉億生物工程有限公司；酪氨酸酶、黃嘌呤氧化酶、奎諾二甲基丙烯酸酯 （Trolox），美國Sigma 公司；其余試劑均為分析純級，購自國藥集團上海化學(xué)試劑有限公司。

SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；FD-2C 冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；5810R 臺式高速大容量冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Agilent1100 及Agilent1260 氨 基酸專用高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；PHS-3C 型pH 計，上海雷磁儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵薏米的制備 將薏米去除雜質(zhì)，粉碎并過60 目篩，正己烷脫脂后于干燥箱中40 ℃烘干至恒重，備用。準確稱取20 g 脫脂薏米粉與1倍體積的去離子水混合，接入干酪乳桿菌（2 g/100 g 薏米粉），分別于37 ℃下密封發(fā)酵0，6，12，24，36，48 h，取樣凍干，粉碎過100 目篩，得到干酪乳桿菌發(fā)酵脫脂薏米粉。

1.2.2 pH 和TTA 的測定 pH 和TTA 的測定參考崔晨曉等[13]的方法，并稍作修改。準確稱取1 g發(fā)酵薏米樣品，加入10 mL 無CO2蒸餾水，磁力攪拌器室溫攪拌30 min 后，用pH 計測定發(fā)酵薏米的pH；TTA 測定時采用0.01 mol/L NaOH 滴定懸浮液至終點pH 8.5，記錄所消耗的NaOH 溶液體積（mL）。

1.2.3 蛋白分子質(zhì)量分布測定 采用分子排阻色譜（SE-HPLC）研究薏米蛋白分子質(zhì)量在發(fā)酵過程中的變化[14]。準確稱取0.1 g 發(fā)酵薏米粉于10 mL離心管中，加入4 mL 含有2% SDS 的磷酸鈉緩沖溶液（0.05 mol/L，pH 6.8），旋轉(zhuǎn)振蕩提取12 h，4 000 r/min 離心10 min，收集上清液用于分析。選用Shodex Protein KW-804 凝膠色譜柱，流速為0.7 mL/min，檢測器波長為214 nm，流動相為含0.2% SDS 的磷酸鈉緩沖溶液。

1.2.4 游離氨基酸分析 參照國標GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》規(guī)定的方法，使用氨基酸自動分析儀測定發(fā)酵薏米中游離氨基酸的含量，準確稱取發(fā)酵薏米樣品2.5 g，用5% TCA溶液定容到25 mL，超聲提取2 次后靜置1 h，雙層濾紙過濾后16 000 r/min 離心10 min，取上清液400 μL 上機進樣。

1.2.5 水和醇提取液的制備 準確稱取發(fā)酵薏米樣品3 g 于100 mL 錐形瓶中，加入蒸餾水或80%甲醇（料液比為1∶10），40 ℃振蕩提取2 h，3 500 g離心10 min，取上清液備用。

1.2.6 總酚含量測定 發(fā)酵薏米總酚含量的測定采用福林酚法[15]，取0.4 mL 提取液，2.6 mL 去離子水，0.5 mL 福林酚試劑混合均勻，靜置6 min 后加入1.5 mL 20% Na2CO3，去離子水補齊至10 mL，40 ℃水浴2 h 后測定760 nm 的吸光度值，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量GAE（gallic acid equivalents）表示，單位為：μg GAE/mL。

1.2.7 抗氧化能力測定

1.2.7.1 鐵離子還原能力 （FRAP）發(fā)酵薏米FRAP 的測定參考Benzie 等[16]的方法，并做一定修改。將乙酸鈉緩沖溶液（300 mmol/L，pH 3.6）、TPTZ溶液（10 mmol/L）和FeCl3·6H2O（20 mmol/L）按照體積比10∶1∶1 混合均勻，此為FRAP 試劑。取2.7 mL FRAP 試劑，90 μL 提取液，再加270 μL 去離子水混勻，室溫黑暗處反應(yīng)30 min，波長593 nm測定吸光值，結(jié)果以Trolox 當(dāng)量TE 表示，單位為：μmol TE/mL。

1.2.7.2 清除ABTS·+能力 發(fā)酵薏米清除ABTS·+能力的測定參考Erel[17]的方法，并做一定修 改。將5 mL 7 mmol/L ABTS 與88 μL 140 mmol/L K2S2O8混合均勻，于室溫黑暗處反應(yīng)16 h以制備ABTS·+溶液。用乙酸鈉緩沖溶液（20 mmol/L，pH 4.5）稀釋ABTS·+溶液，使稀釋液在734 nm 波長處的吸光值為0.700±0.020。吸取0.1 mL 提取液與3.9 mL ABTS·+稀釋液混合，搖勻，避光反應(yīng)15 min，734 nm 處測定吸光值，結(jié)果以Trolox 當(dāng)量TE 表示，單位為：μmol TE/mL。

1.2.8 酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制率測定

1.2.8.1 酪氨酸酶抑制率 參考Xu 等[18]的方法，略做修改反應(yīng)體系。準確吸取發(fā)酵薏米水提取液1 mL，酪氨酸酶液（250 U/mL）1 mL，加磷酸鈉緩沖溶液（50 mmol/L，pH 6.5）至5 mL，于室溫下孵育10 min，之后加入底物L(fēng)-DOPA （1.5 mg/mL）0.5 mL，立即在475 nm 處記錄吸光度值（每隔30 s 一次），共計5 min。

式中，S0——無樣品組別的斜率；S1——添加樣品組別的斜率。

1.2.8.2 黃嘌呤氧化酶抑制率 參照文獻[19]的方法，準確吸取發(fā)酵薏米水提取液1 mL，黃嘌呤氧化酶液（0.05 U/mL）1 mL，于室溫下孵育10 min，之后加入底物黃嘌呤（0.42 mmol/L）3 mL，立即在295 nm 處記錄吸光度值（每隔30 s 一次），共計5 min。

式中，S0——無樣品組別的斜率；S1——添加樣品組別的斜率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和顯著性檢驗（P<0.05 表示差異顯著），使用Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對薏米pH 和TTA 的影響

乳酸菌生長過程中產(chǎn)生大量的有機酸，可以使原料快速酸化[20]，薏米發(fā)酵過程中pH 和TTA的變化如圖1所示。從圖1可以看出，脫脂薏米發(fā)酵后具有較低的pH 值和較高的TTA，表明干酪乳桿菌在脫脂薏米基質(zhì)中生長旺盛，生成大量的乳酸、乙酸等有機酸。在發(fā)酵前12 h，薏米pH 顯著下降，隨后趨于平穩(wěn)，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵48 h后，pH 由7.10 降至3.72，差異顯著（P<0.05）。而薏米TTA 在發(fā)酵過程中成逐漸上升的趨勢，發(fā)酵48 h 后，薏米TTA 由2.70 mL 增加到40.20 mL。

2.2 發(fā)酵對薏米蛋白分子質(zhì)量的影響

通過分子排阻色譜技術(shù)，可以對分子質(zhì)量分布范圍較寬的薏米蛋白進行有效地分離和定量。從圖2可以看出，薏米蛋白分子質(zhì)量主要集中在F2 區(qū)域 （低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，97.4 ku>MW>20.0 ku），而F1 （高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，MW>97.4 ku）和F3（肽和氨基酸，MW<20.0 ku）兩個區(qū)域較少。由于干酪乳桿菌酶系的作用，薏米蛋白分子質(zhì)量在發(fā)酵過程中發(fā)生了顯著的變化。位于F1 區(qū)域的峰1 在發(fā)酵過程中面積顯著提高，說明在發(fā)酵過程中部分SDS 不溶蛋白變?yōu)镾DS 可溶蛋白。位于F2區(qū)域的峰4 和5 在發(fā)酵過程中面積顯著降低，而峰2 和3 顯著提高，說明在發(fā)酵過程中F1 區(qū)域的高分子質(zhì)量蛋白部分被降解成F2 區(qū)域的低分子質(zhì)量蛋白，同時F2 區(qū)域的部分低分子質(zhì)量蛋白也被降解為更低分子質(zhì)量的肽和氨基酸。位于F3 區(qū)域的峰6、7、8 在發(fā)酵過程中面積顯著提高，說明發(fā)酵過程中部分蛋白被降解為多肽和氨基酸。

圖1 發(fā)酵時間對薏米pH 和TTA 的影響Fig.1 Effect of fermentation time on pH and TTA of adlay

圖2 發(fā)酵過程中薏米蛋白的分子質(zhì)量分布Fig.2 Typical molecular weight distribution profiles of adlay protein during fermentation

2.3 發(fā)酵對薏米游離氨基酸的影響

乳酸菌必須依賴外部氨基酸進行增長代謝，同時其生長過程中內(nèi)源酶系的作用可以使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸[21]，對薏米發(fā)酵過程中17 種游離氨基酸含量進行測定，結(jié)果見表1。由表1可知，薏米在發(fā)酵過程中絕大多數(shù)游離氨基酸含量隨著發(fā)酵時間的增加顯著增加，必需氨基酸總量從1.19 mg/g 增加到3.15 mg/g，升高了165%。游離氨基酸總量增加顯著 （P<0.05），從發(fā)酵初期（2.99 mg/g）至發(fā)酵結(jié)束（7.95 mg/g）增加了1.7 倍。總氨基酸增加的最大貢獻者為谷氨酸（從0.41 mg/g 增加至1.58 mg/g）、精氨酸（從0.16 mg/g 至0.83 mg/g）和亮氨酸（從0.18 mg/g 至0.80 mg/g）。在未發(fā)酵薏米中，天冬氨酸和谷氨酸含量最高，占總游離氨基酸的比例分別為14.05%和13.71%；而發(fā)酵48 h后，谷氨酸和精氨酸含量最高，占總游離氨基酸的比例分別為19.87%和10.44%。

2.4 發(fā)酵對薏米總酚含量的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，薏米中含有豐富的酚類物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)表現(xiàn)出較高的功能活性[22-23]，發(fā)酵對薏米總酚含量影響如圖3所示。從圖3可以看出，隨著發(fā)酵時間增長，薏米水和醇提取液的總酚含量呈先快速增長，后增長速率逐漸降低的趨勢，發(fā)酵48 h 后分別從64.3 和82.0 μg GAE/mL 增加到85.0 和111.4 μg GAE/mL。乳酸菌發(fā)酵過程中，內(nèi)源酶系的作用能夠使薏米中的酚類物質(zhì)從結(jié)合狀態(tài)游離出來。伍靜等[24]研究發(fā)現(xiàn)，大麥中的結(jié)合酚經(jīng)過發(fā)酵能被釋放出來，對人體結(jié)腸癌細胞具有顯著的抑制作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵及未發(fā)酵薏米中，醇提取液的總酚含量都顯著高于水提取液。

表1 薏米發(fā)酵過程中游離氨基酸變化情況分析（mg/g）Table 1 Changes in free amino acids during adlay fermentation （mg/g）

2.5 發(fā)酵對薏米抗氧化活性的影響

發(fā)酵薏米的抗氧化活性測試結(jié)果如圖4和圖5所示，結(jié)果表明發(fā)酵處理顯著提高了薏米的FRAP 和ABTS·+清除能力。由圖4可知，未發(fā)酵薏米的水和醇提取液的FRAP 值分別為0.152 和0.286 μmol TE/mL，發(fā)酵48 h 后分別增加到0.188和0.365 μmol TE/mL。由圖5可知，未發(fā)酵薏米的水和醇提取液的ABTS·+清除能力分別為0.162 和0.231 μmol TE/mL，發(fā)酵48 h 后分別增加到0.202和0.311 μmol TE/mL。研究還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵及未發(fā)酵薏米中醇提物的抗氧化活性要顯著強于水提物，表明發(fā)酵及未發(fā)酵薏米中抗氧化活性成分主要集中在醇提取物中。脫脂薏米發(fā)酵過程中顯著提高的多酚、多肽含量可能促進了薏米抗氧化活性的提高。

圖3 發(fā)酵時間對薏米總酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total phenolic content of adlay

圖4 發(fā)酵薏米提取液的鐵離子還原能力Fig.4 The ferric reducing antioxidant power of fermented adlay extracts

圖5 發(fā)酵薏米提取液的ABTS·+清除能力Fig.5 The ABTS radical scavenging activities of fermented adlay extracts

2.6 發(fā)酵對薏米酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酪氨酸酶是黑色素形成的關(guān)鍵限速酶，其過量表達可誘發(fā)黑色素沉積。發(fā)酵薏米水提取液對酪氨酸酶的抑制效果如圖6所示。薏米水提取液對酪氨酸酶的抑制作用在發(fā)酵過程中呈緩慢上升的趨勢。從發(fā)酵初始至發(fā)酵結(jié)束，水提取液的酪氨酸酶抑制率由37.30%增加至50.31%，增加了0.35倍。黃嘌呤氧化酶在核酸代謝過程中具有重要作用，其活性較高易引發(fā)高尿酸血癥，導(dǎo)致痛風(fēng)和代謝性疾病[25]。從圖6可以看出，在發(fā)酵過程中，薏米水提取的黃嘌呤氧化酶抑制作用增加。發(fā)酵48 h 后，抑制率從10.30%增加至31.04%，增加了2.01 倍。研究表明，多酚類物質(zhì)具有較好的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性[19，26]。發(fā)酵薏米水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性與總酚含量呈高度的正相關(guān)性，相關(guān)性分別為r=0.971 和r=0.940，因此，發(fā)酵薏米水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的變化可能與總酚含量變化有關(guān)。

圖6 發(fā)酵薏米提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性Fig.6 Inhibitory effect of fermented adlay extracts on tyrosinase and xanthine oxidase activity

3 結(jié)論

本文研究了脫脂薏米在干酪乳桿菌發(fā)酵過程中營養(yǎng)品質(zhì)的動態(tài)變化。脫脂薏米經(jīng)干酪乳桿菌發(fā)酵后pH 下降，TTA 上升。薏米蛋白在發(fā)酵過程中發(fā)生顯著降解，游離氨基酸含量隨著發(fā)酵時間延長顯著增加，總游離氨基酸48 h 發(fā)酵后增加了1.7 倍。薏米水和醇提取液總酚含量隨著發(fā)酵時間延長逐漸增加，其FRAP 和清除ABTS·+能力也顯著增強。此外，發(fā)酵薏米的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性顯著增強，發(fā)酵48 h 后分別達到了50.31%和31.04%。干酪乳桿菌發(fā)酵可以作為一種有效的脫脂薏米營養(yǎng)品質(zhì)提升方法，拓寬其在食品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。