樺褐孔菌多糖對糖尿病小鼠的干預(yù)作用及機制

夏 晴，王箴言，王 玉，楊 揚，張久亮

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科學與技術(shù)學院 武漢430070）

糖尿病是以高血糖為主要特征的代謝性疾病，由胰島素絕對或相對分泌不足所引起。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）最新統(tǒng)計顯示：2015年全球糖尿病患病人數(shù)約為4.15 億，而我國糖尿病患病人數(shù)居世界首位，約有1.1 億人[1]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可有效降低餐后血糖水平，被認為是治療Ⅱ型糖尿病的關(guān)鍵因素[2]。目前為止，生物活性多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制被廣泛用于評估其體外降血糖的效果[3]。

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種生長在寒帶的木腐菌，屬擔子菌亞門、層菌綱、非褐菌目（無褐菌目）、多孔菌科、褐臥孔菌屬，主要分布于北半球北緯45°～50°的地區(qū)。自16 世紀以來，樺褐孔菌作為一種民間藥物用作治療胃、腸癌、心血管疾病[4]。有研究表明，樺褐孔菌含有200 多種活性物質(zhì)，主要是多糖、樺褐孔菌素、三萜類化合物等，具有抗腫瘤、增強免疫、抗氧化、降血糖等功效[5-6]。Liang 等[7]報道樺褐孔菌多糖在高脂血癥大鼠中表現(xiàn)出很強的抗氧化和降血脂能力。呂金玲等[8]開展樺褐孔菌各極性部位對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的藥效學試驗，確定樺褐孔菌多糖具有降糖活性。梁麗雅等[9]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌60%醇提物具有較好的體內(nèi)抗氧化和抑制脂質(zhì)過氧化的活性，并可改善血清的血脂水平。Wang 等[10]研究樺褐孔菌多糖對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠抗糖尿病作用及PI3K-Akt 信號通路的可能機制。多糖類活性物質(zhì)傳統(tǒng)上采用水提醇沉，而三萜類化合物通常采用乙醇浸提，實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌80%醇提物中三萜得率最高。雖然動物和臨床試驗顯示樺褐孔菌具有降血糖作用，但是未見對樺褐孔菌發(fā)揮降血糖作用物質(zhì)基礎(chǔ)的報道。

本試驗中采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射STZ 的方法建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，用不同溶劑提取樺褐孔菌活性物質(zhì)，探究樺褐孔菌水提物和醇提物對糖尿病小鼠糖脂代謝與抗氧化的影響。通過體外研究水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制類型，為明確樺褐孔菌提取物降血糖的物質(zhì)基礎(chǔ)和相關(guān)機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

SPF 級昆明雄性小鼠（20±2）g，購自華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心，許可證號為SCXK （鄂）2015-0019。樺褐孔菌，由東莞市神龜生物科技有限公司提供；STZ，美國Sigma 公司；鹽酸二甲雙胍，中美上海施貴寶制藥有限公司；甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、高密度脂蛋白（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白（LDL-C）試劑盒、糖化血清蛋白（GSP）試劑盒、BCA 蛋白濃度試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）以及肝丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；α-葡萄糖苷酶 （14 U/mg），美國Sigma 公司；阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-2 恒溫水浴鍋，上海科爾儀器設(shè)備有限公司；BSA124S 分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Eppendorf centrifuge 5804 高速冷凍離心機，德國艾本德股份公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A 恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Thermo Multiskan GO 全自動酶標儀，上海賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌提取物的制備 子實體經(jīng)粉碎后過40 目篩，加20 倍80%乙醇，在80 ℃下回流提取2 h，離心取上清液，將2 次提取液合并、濃縮、冷凍干燥得到樺褐孔菌醇提物干粉。醇提后所得殘渣于50 ℃烘干，加入20 倍熱水在90 ℃下提取2 h，離心取上清，濃縮至適當體積，加入乙醇使其醇含量達80%，4 ℃靜置過夜，離心取沉淀，加水復(fù)溶，冷凍干燥得到樺褐孔菌水提物。

1.3.2 提取物中活性成分含量測定 總?cè)频臏y定：參考文獻[11]進行測定；總多酚的測定：參照T/AHFIA 005-2018 植物提取物及其制品中總多酚含量的測定；總多糖的測定：參照NY/T 1676-2008 食用菌中粗多糖含量的測定。

1.3.3 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的構(gòu)建 雄性昆明小鼠，標準環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機分為正常組（8 只）和糖尿病組（32 只），正常組給予普通飼料，糖尿病組給予高脂飼料喂養(yǎng)4 周。參考文獻[12]做適量改動，禁食不禁水12 h 后，糖尿病組小鼠腹腔注射65 mg/kg 的STZ 溶液 （STZ 溶解在0.1 mol/L、pH 4.5 的檸檬酸緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用），連續(xù)3 d 建立糖尿病模型，正常組注射等劑量的檸檬酸緩沖液。造模7 d 后，禁食不禁水12 h，尾部取血檢測空腹血糖 （Fasting blood glucose，F(xiàn)BG）含量，F(xiàn)BG>11.1 mmol/L 的小鼠視為糖尿病造模成功，進行后續(xù)試驗。

1.3.4 造模后分組與處理 將糖尿病小鼠按照體重和血糖濃度隨機分為4 組：分別為糖尿病模型組（DC 組）、陽性對照組（PC 組）、樺褐孔菌水提物組（IOWE 組）和樺褐孔菌醇提物組（IOAE 組），每組8 只。PC 組給予250 mg/kg 鹽酸二甲雙胍；IOWE 組和IOAE 組小鼠每天分別灌胃600 mg/kg提取物；NC 組和DC 組小鼠按0.1 mL/kg 灌胃蒸餾水；4 周后各組小鼠均禁食12 h，摘眼球取血、處死并解剖，觀察其體內(nèi)肝、腎、胰腺等臟器后取出稱重并收集。

1.3.5 測量體重及檢測血糖 每周定時測量體重并觀察小鼠生長狀況，尾靜脈取血測空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。試驗結(jié)束前1 d進行小鼠葡萄糖耐受量試驗 （oral glucose tolerance test，OGTT）：小鼠禁食不禁水12 h 后尾靜脈取血測定FBG 作為0 h 的血糖值，隨后根據(jù)體重灌胃給藥，15 min 后再灌胃2 g/kg 葡萄糖溶液，于灌胃后15，30，60，120 min 測定小鼠血糖值，使用GraphPad Prism version 7.0 計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。

1.3.6 檢測血清糖脂代謝相關(guān)指標及肝臟抗氧化水平 使用相關(guān)試劑盒檢測小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GSP 和肝臟中MDA、SOD、CAT含量。具體檢測過程見試劑盒說明書。

1.3.7 樺褐孔菌水提物對α-葡萄糖苷酶IC50值的測定 根據(jù)文獻[13]略有改動，試驗組選用不同濃度的樺褐孔菌水提物溶液 （分別為0，6，8，10，12 μg/mL），在96 孔板中加入40 μL 樣品溶液和20 μL 0.25 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，再加入40 μL 0.5 mmol/L pNPG 溶液，置于37 ℃孵育20 min，最后加入100 μL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于波長405 nm 處測定吸光度。以阿卡波糖作為陽性對照，PBS作為空白對照，按公式計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率：

式中：Asample——樣品組的吸光度值；Ablank——樣品不加酶的吸光度值；Atest——空白組吸光度值；Acontrol——空白不加酶吸光度值。利用SPSS 計算酶抑制率為50%時對應(yīng)的樣品濃度，即為樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.8 水提物對α-葡萄糖苷酶抑制可逆性的研究 固定底物pNPG 的濃度（5×10-4mol/L），比較不同質(zhì)量濃度樣品（分別為0，6，8，10，12 μg/mL）隨酶濃度（0.5，0.625，0.75，0.875，1 U/mL）的改變，吸光值變化率即ΔOD405nm。

1.3.9 水提物對α-葡萄糖苷酶體外抑制動力學的測定 固定α-葡萄糖苷酶的濃度（0.3 U/mL），比較不同質(zhì)量濃度樣品（分別為0，6，8，10，12 μg/mL）吸光值變化率即ΔOD405nm，探究α-葡萄糖苷酶活力隨底物pNPG 濃度 （0.125，0.25，0.5，1 mmol/L）的變化趨勢。對米氏方程兩邊求倒數(shù)得到Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程。以1/V 對1/[S]作圖，計算并判斷樣品對α-葡萄糖苷酶抑制的作用類型。

式中：Km——米氏常數(shù)；[S]——底物濃度，mmol/L；Vmax——最大反應(yīng)速率，ΔOD/min；V——反應(yīng)速率，ΔOD/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0 軟件處理試驗結(jié)果，單因素方差分析（ANOVA）檢驗后Duncan 檢驗，組間統(tǒng)計學顯著性差異分析，其中P＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果均以（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種組分中活性成分含量的比較

采用80%乙醇對樺褐孔菌進行提取，其醇提物得率為（16.14±1.28）%，將殘渣用熱水浸提，醇沉凍干后水提物得率為（17.16±1.89）%。

表1 樺褐孔菌提取物的提取率及活性成分含量Table 1 Extraction rate and active ingredient content of Inonotus obliquus extract

由表1可知：樺褐孔菌水提物主要成分為多糖，含量達到（22.54±1.32）%，基本不含有三萜類和多酚類等中等極性物質(zhì)。而樺褐孔菌醇提物中的活性物質(zhì)主要是弱極性、中極性的小分子，三萜和多酚類物質(zhì)是其主要成分，共占21.04%。

2.2 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠體重、臟器指數(shù)的影響

由圖1可知，連續(xù)3 d 腹腔注射STZ 后，DC組小鼠體重較NC 組有極顯著下降（P<0.01），且肝臟和腎臟指數(shù)極顯著上升（P<0.01）。體重的下降和臟器指數(shù)的上升被認為是糖尿病的典型特征，這與葡萄糖代謝缺陷和組織蛋白過度分解有關(guān)[14]。經(jīng)過4 周的治療，各治療組小鼠體重較DC 組有所增長，其中PC 和IOWE 組小鼠體重與DC 組相比差異顯著（P<0.05）；肝臟指數(shù)有所恢復(fù)，腎臟指數(shù)IOWE 組較模型組顯著下降（P<0.05），但胰腺指數(shù)各組無顯著差異。數(shù)據(jù)表明樺褐孔菌水提物和醇提物可減緩糖尿病小鼠體重的下降，且水提物效果優(yōu)于醇提物。

2.3 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

圖2可以看出，與NC 組相比，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠顯現(xiàn)出較高的FBG 水平，在4 周的試驗期間，DC 組FBG 在持續(xù)增加，這表明成功地建立了Ⅱ型糖尿病小鼠模型。4 周治療后，IOWE 組小鼠的FBG 較第1 周的下降17.57%，恢復(fù)至原始水平，與DC 組小鼠相比FBG 顯著下降（P<0.05），效果與PC 組（較第1 周下降24.4%）相當。這與樺褐孔菌鉻復(fù)合物（600 mg/kg）可顯著降低糖尿病的空腹血糖值結(jié)果相一致[12]。IOAE 組小鼠FBG 水平較DC 組有所下降，但無統(tǒng)計學差異。

圖1 樺褐孔菌提取物對STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體重和臟器指數(shù)的影響Fig.1 Effect of extract of Inonotus obliquus on body weight and organ index in STZ-induced diabetic mice

圖2 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠空腹血糖值的影響Fig.2 Effect of extract of Inonotus obliquus on fasting blood glucose in diabetic mice

2.4 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受量的影響

口服葡萄糖耐受量試驗中血糖如圖3a 所示，口服葡萄糖導(dǎo)致小鼠血糖值在30 min 達到頂峰，糖尿病小鼠血糖值在接下來的90 min 仍處于一個較高水平，與NC 組相比差異極顯著（P<0.01）。NC組小鼠血糖值30 min 達到最大，隨后逐漸下降，120 min 后恢復(fù)至原始水平。與DC 組相比，各治療組血糖峰值有所降低，且PC 和IOWE 組血糖值在接下來的90 min 有所改善。圖3b 表明DC 組AUC較NC 組極顯著升高 （P<0.01），120 min 后PC 組AUC 較DC 組極顯著下降 （P<0.01），IOWE 組較DC 顯著下降（P<0.05），IOAE 組雖有減小，但差異不顯著。上述結(jié)果表明樺褐孔菌水提物及醇提物均可提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，阻止糖尿病的進一步惡化，且水提物效果遠優(yōu)于醇提物。

圖3 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受量的影響Fig.3 Effect of extract of Inonotus obliquus on oral glucose tolerance in diabetic mice

2.5 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠血清中血脂水平的影響

血脂異常被認為是心血管疾病發(fā)展的主要危險因素[15]。因此，旨在預(yù)防血脂異常的策略對于糖尿病的治療是必不可少的。一般來說，血脂異常的特征是血清中TC、TG、LDL-C 水平升高和HDL-C水平降低[16]。本研究中在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中觀察到極顯著的脂質(zhì)水平紊亂（圖4）。經(jīng)過4周的IOWE 治療后，與DC 組相比，血清中TG 含量下降28.81%，TC、LDL-C 水平顯著降低，降低率分別為24%，25.12%（P<0.05）。這與樺褐孔菌發(fā)酵液的干物質(zhì)有助于糖尿病小鼠脂質(zhì)水平趨于正?；难芯拷Y(jié)果一致[17]。經(jīng)IOAE 治療的小鼠血清中TG、TC、LDL-C 較DC 組分別下降28.8%，15.3%，16.24%。與DC 組相比，各治療組的HDL-C 水平有所增加，其中IOWE 和IOAE 組分別增加27.51%，19.46%。已經(jīng)證明HDL-C 可以促進TC和TG 從外周組織流出到肝臟，在循環(huán)期間分解代謝，本研究中TC 和TG 水平降低，可能部分是由于HDL-C 水平的增加引起[18]。經(jīng)過4 周的治療后，PC 和IOWE 組小鼠血清中GSP 含量顯著降低（P<0.05），IOAE 組GSP 與DC 組無統(tǒng)計學差異，僅下降8.37%。脂質(zhì)水平的變化表明樺褐孔菌水提物具有調(diào)節(jié)糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝的潛力。

2.6 樺褐孔菌提取物對小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

圖4 樺褐孔菌提取物對糖尿病小鼠血清中血脂水平的影響Fig.4 Effect of extract of Inonotus obliquus on serum lipid levels in diabetic mice

在慢性高血糖環(huán)境下，由于蛋白質(zhì)的非酶糖化和脂質(zhì)過氧化等幾種生化途徑，自氧化產(chǎn)生的自由基會增加[19]。氧化應(yīng)激在糖尿病特別是Ⅱ型糖尿病引起的血管并發(fā)癥的發(fā)展中起著重要作用[20]。SOD、CAT 是哺乳動物中常見的抗氧化酶，在減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用[21]。因此，抗氧化酶活性的提高是抗高血糖癥的標志。如表2所示，DC 組小鼠的SOD，CAT 活性極顯著下降，肝臟中MDA 水平極顯著升高（P<0.01），說明肝臟和腎臟中的氧化應(yīng)激增強。各治療組與DC 組相比較抗氧化水平有所改善，其中經(jīng)IOWE 治療后糖尿病小鼠肝臟中CAT、SOD 活力顯著升高 （P<0.05），MDA 水平顯著降低（P<0.05）；IOAE 治療后的糖尿病小鼠CAT 活力極顯著增加（P<0.01）。結(jié)果表明，樺褐孔菌提取物可通過促進SOD、CAT 活性和降低MDA 水平來提高糖尿病小鼠的抗氧化能力以減輕由高血糖引起的氧化應(yīng)激。

2.7 樺褐孔菌水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制動力學

2.7.1 樺褐孔菌水提物對α-葡萄糖苷酶IC50值的測定 α-葡萄糖苷酶是一種存在于小腸絨毛黏膜細胞刷狀緣的酶類，通過水解α-1，4 糖苷鍵，可以使淀粉和其它有關(guān)多糖的非還原端水解形成葡萄糖。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，可以有效降低餐后血糖峰值。體內(nèi)降血糖數(shù)據(jù)顯示樺褐孔菌水提物可降低糖尿病小鼠血糖，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減緩氧化應(yīng)激損傷，且水提物效果遠優(yōu)于醇提物。故選擇樺褐孔菌水提物進行體外α-葡萄糖苷酶的抑制試驗。

表2 各組小鼠肝組織中抗氧化指標的測定Table 2 Determination of antioxidant indexes in liver tissues of mice in each group

如圖5所示，水提物濃度與α-葡萄糖苷酶的抑制率呈正相關(guān)，隨著水提物濃度的增加抑制率增加。且水提物的IC50值（8.6 μg/mL±0.44 μg/mL）遠低于阿卡波糖（1.02 mg/mL±0.23 mg/mL），水提物的α-葡萄糖苷酶抑制能力比阿卡波糖高約118倍，這與沈心怡等[22]的研究結(jié)果相似。結(jié)果表明樺褐孔菌水提物可以強烈抑制α-葡萄糖苷酶活性。

2.7.2 樺褐孔菌水提物對α-葡萄糖苷酶可逆性的研究 以樺褐孔菌水提物為研究材料，通過探究其對α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)速度與酶濃度的關(guān)系，系統(tǒng)判斷其對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。如圖6所示，在底物濃度不變的情況下，α-葡萄糖苷酶的量與反應(yīng)速率成正比，且不同濃度的水提物溶液反應(yīng)速率直線均經(jīng)過原點，斜率隨著水提物濃度的增大而變小。其斜率特點表明水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制為可逆性抑制，即樺褐孔菌水提物與α-葡萄糖苷酶以非共價鍵結(jié)合，樣品作為可逆性抑制劑，只減小反應(yīng)速率，不影響反應(yīng)進程和酶的結(jié)構(gòu)。

圖5 水提物及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.5 Inhibition of α-glucosidase by water extracts and acarbose

圖6 樺褐孔菌水提物對α-葡萄糖苷酶的體外抑制可逆性Fig.6 In vitro inhibition of α-glucosidase by water extracts of Inonotus obliquus

圖7 水提物對α-葡萄糖苷酶的體外抑制動力學Fig.7 In vitro inhibition kinetics of α-glucosidase by water extracts

2.7.3 水提物對α-葡萄糖苷酶的體外抑制動力學 圖7為水提物對α-葡萄糖苷酶抑制類型的雙倒數(shù)Lineweaver-Burk 圖。隨著水提物濃度的增大，直線在縱軸的截距依次增大即1/V 增大，即Vmax 隨水提物濃度增大而減小；在橫軸的截距依次減小，即-1/Km減小，即Km隨水提物濃度增大而減小。動力學參數(shù)表明樺褐孔菌水提物對α-葡萄糖苷酶抑制為反競爭性抑制。已有研究表明，非競爭性抑制劑與競爭性抑制劑之間，甚至與非競爭性抑制劑之間可協(xié)同抑制α-葡萄糖苷酶的活性[23-25]。阿卡波糖作為一種競爭性和可逆的α-葡萄糖苷酶抑制劑，可以阻止淀粉和其它碳水化合物的降解，延緩小腸中葡萄糖的吸收，已被用于控制餐后血糖[26]。因此，作為非競爭性抑制劑，樺褐孔菌水提物與阿卡波糖等一線藥物的聯(lián)用也非常具有潛力。

3 結(jié)論

體內(nèi)動物試驗結(jié)果表明樺褐孔菌水提物及醇提物均可緩解STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體重的下降，降低小鼠空腹血糖值，提高糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，改善糖尿病小鼠血脂水平，促進肝臟中SOD 和CAT 活性，降低MDA 水平，且水提物效果優(yōu)于醇提物。體外降血糖試驗數(shù)據(jù)顯示水提物對α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用，且水提物對α-葡萄糖苷酶抑制類型表現(xiàn)為反競爭性抑制，結(jié)果表明樺褐孔菌水提物是一種有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。體內(nèi)外試驗一致證明樺褐孔菌水提物具有較佳的降血糖功效，其降血糖的可能機制是對α-葡萄糖苷酶的良好抑制效果。本研究可為樺褐孔菌在保健品和功能食品中的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論參考。