黑木耳胞外多糖對小鼠腸道微生態(tài)及免疫調(diào)節(jié)的影響

郝 敏，李殿龍，徐俊亭，藺潔茹，王 旭，施治臣，郝利民，劉振興*

（1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津300457 2 軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所 北京100010）

黑木耳作為一種珍貴的傳統(tǒng)食用真菌，不僅能為人體提供氨基酸、蛋白質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，還具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖和預(yù)防心血管疾病等多種活性功能[1]。黑木耳含有多種營養(yǎng)成分，其中所含多糖成分的作用研究較為廣泛，尤其是在食品和保健品開發(fā)方面具有應(yīng)用價(jià)值，如黑木耳飲料、黑木耳口服液等[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳多糖能夠顯著提高機(jī)體免疫力，抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖能力，增強(qiáng)其巨噬細(xì)胞吞噬能力和自然殺傷細(xì)胞活性[5-7]。

腸道微生物是人體的重要代謝“器官”，在消化吸收、新陳代謝和免疫反應(yīng)等生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。隨著對腸道微生物與機(jī)體健康研究的深入，發(fā)現(xiàn)正常生理?xiàng)l件下人體腸道菌群處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)內(nèi)環(huán)境變化或受到外界刺激時(shí)，會導(dǎo)致腸道內(nèi)菌群紊亂，對機(jī)體健康產(chǎn)生影響。例如，抗生素濫用會破壞腸道微生物種群平衡，增加炎癥性疾病風(fēng)險(xiǎn)。益生菌通過分泌一系列抗菌物質(zhì)（有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素等）降低腸內(nèi)pH，增加短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFA）含量來減少病原體活菌數(shù)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖可以促進(jìn)腸道優(yōu)勢菌增殖和調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌物[10-11]，從而促進(jìn)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和機(jī)體健康。

盡管黑木耳具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，但是其多糖成分對腸道微生物的調(diào)控作用與機(jī)制仍不清楚。為了明晰黑木耳多糖對腸道菌群變化的調(diào)控效應(yīng)及其生物功能，本研究利用小鼠模型，分析黑木耳胞外多糖對小鼠腸道菌群多樣性、SCFA 含量變化及血清細(xì)胞因子的影響，為黑木耳多糖益生菌微生態(tài)制劑和新型健康食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黑木耳菌株（GenBank：KF297975.1，天津科技大學(xué)生物醫(yī)藥與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存）。

無水乙醇（分析級）、葡萄糖（分析級）、濃硫酸（分析級）、二甲苯（分析級），天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；三氯甲烷（分析級）、異戊醇（分析級）、二氯甲烷（色譜級），上海生工生物工程有限公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸，上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司；GPR43 抗體，圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司；FITC 標(biāo)記的熒光二抗，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒，上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級近交系CD-1 雌鼠18 只，體重（20±3）g，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

AB204-S 型分析天平，梅特勒-托利多儀器上海公司；GH-6000 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；ALPHA2-4/LD 型冷凍干燥機(jī)，德國CHRIS 公司；722 型紫外分光光度計(jì)，上海精科儀器公司；7890A 氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；BX53 正置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.4 黑木耳胞外多糖提取

黑木耳發(fā)酵培養(yǎng)參照肖彩霞[12]的方法。發(fā)酵液經(jīng)3 000 r/min 離心20 min 棄沉淀，上清液直接進(jìn)行真空蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/4，加入無水乙醇（體積分?jǐn)?shù)30%），4 ℃過夜。3 000 r/min 離心20 min 后，向上清溶液加入去蛋白試劑（三氯甲烷-異戊醇=1∶4）并磁力攪拌10 min，3 500 r/min 離心15 min 棄沉淀，上清液加入無水乙醇（體積分?jǐn)?shù)75%）4 ℃過夜。4 000 r/min 離心15 min 取得沉淀物即為粗多糖，將多糖沉淀用水復(fù)溶后透析12 h，每2 h 換1 次水，隨后冷凍干燥，得到黑木耳胞外多糖。

1.5 多糖的鑒定及單糖組成分析

1.5.1 多糖的紅外光譜解析 稱取黑木耳胞外多糖1 mg，加入適量溴化鉀（KBr）粉末于研缽中，充分研磨后壓成透明薄片，隨后用Nicolet IS10 FTIR 光譜儀（Thermo Scientific，美國）在400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，記錄IR 光譜。

1.5.2 多糖的單糖組成分析 本試驗(yàn)利用高效液相色譜儀，結(jié)合PMP （1-苯基-3-甲基-5 吡唑啉酮）柱前衍生化法對黑木耳胞外多糖樣品進(jìn)行了單糖組成分析。多糖的水解和衍生化方法參照王媛媛等[13]研究。高效液相檢測條件如下：C18 色譜柱；流動相為0.1 mol/L pH 6.5 磷酸緩沖鹽∶乙腈（V/V）=85∶15；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.6 動物試驗(yàn)

1.6.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 將購買的18 只健康CD-1 雌性小鼠飼養(yǎng)在20～22℃、45%～55% RH的無菌潔凈環(huán)境中，讓其自由進(jìn)食（市售普通飼料），適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。將其隨機(jī)分為2 組（每組9只）即試驗(yàn)對照組（Control），黑木耳胞外多糖組（Fermentation-exopolysaccharide，F(xiàn)-P）。將黑木耳胞外多糖用生理鹽水配置，然后按照1.5 g·kg-1BW-1進(jìn)行灌胃處理 （每只小鼠每次給藥體積為0.2 mL），連續(xù)灌胃21 d；對照組給予等體積的生理鹽水處理。

1.6.2 小鼠體重及臟器系數(shù) 試驗(yàn)期間每7 d 記錄1 次小鼠體重，將兩組體重平均值做趨勢分析。第21 天，脫臼法處死小鼠后，快速分離肝、脾、心、肺、腎等臟器，臟器用吸水紙吸干后，進(jìn)行稱量和數(shù)據(jù)采集，最后對臟器系數(shù)及安全性進(jìn)行評估。臟器系數(shù)=（臟器質(zhì)量/體重）×100%

1.6.3 小鼠腸道菌群分析鑒定 灌胃試驗(yàn)結(jié)束后（第21 天），無菌采集新鮮糞便0.1 g，放入滅菌管，將待測樣品交派森諾生物科技有限公司進(jìn)行菌群鑒定分析。流程如下：首先提取樣品細(xì)菌總DNA，然后以微生物核糖體RNA 目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)16S rRNA V3-V4 區(qū)的特異性引物，等溫?cái)U(kuò)增構(gòu)建文庫。構(gòu)建好的文庫經(jīng)梯度稀釋，利用Illumina MiSeq 測序平臺高通量測序。測序結(jié)果通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行亞基因組分析和腸道微生物區(qū)系分析。

1.6.4 小鼠糞便中SCFAs 含量分析 冷凍干燥糞便樣品，準(zhǔn)確稱取50 mg 樣品，加入1.2 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）混勻，4 ℃14 000 r/min 離心20 min，吸取上清液至5 mL 離心管中。每200 μL 上清加入0.1 mL 的稀釋后硫酸（體積分?jǐn)?shù)50%），充分混勻3 min，用2 mL 二氯甲烷（色譜級）進(jìn)行萃取，4 ℃靜置2 h，然后用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾。采用氣相色譜（GC）檢測樣品中短鏈脂肪酸的含量，樣品提取方法參照Zhao 等[14]并做部分修改。GC 分析采用常規(guī)HP-FFAP （25 m×0.32 mm，0.5 μm）配置柱，程序設(shè)定參照賈益群等[15]在生物樣品脂肪酸提取與分析的研究結(jié)果，并調(diào)整其分流比為20∶1。SCFA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置以及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照孟拓等[16]對氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析腸道炎小鼠短鏈脂肪酸代謝研究結(jié)果。

1.6.5 小鼠結(jié)腸GPR43 檢測 小鼠灌胃21 d 后，脫臼法處死小鼠快速分離腸道交武漢谷歌生物科技有限公司制作石蠟切片。取結(jié)腸石蠟切片用二甲苯脫蠟處理，經(jīng)不同濃度梯度乙醇進(jìn)行水化處理后用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液95 ℃溫育15 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，并將其冷卻到室溫，經(jīng)3% BSA 室溫封閉處理30 min 后用GPR43 抗體4 ℃孵育12 h，之后用FITC 標(biāo)記的熒光二抗室溫避光孵育1.5 h，再用DAPI 室溫避光孵育30 min，實(shí)施封片并過夜風(fēng)干，于暗室條件下進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.6.6 小鼠血清細(xì)胞因子測定 小鼠灌胃21 d后，通過摘眼球取血，并將血液保存在含有乙二胺四乙酸絡(luò)合劑（EDTA）的收集管中，4 ℃存放3 h。待自然沉降后，用無菌槍頭吸取血清，利用酶聯(lián)免疫法 （ELISA）測定小鼠血清中IL-6、IL-10 和TNF-α 的含量。試驗(yàn)步驟參照上海茁彩生物科技有限公司ELISA 試劑盒操作說明書。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用Graphpad 5.0 分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，t 檢驗(yàn)分析各組間顯著性差異，數(shù)據(jù)以±s 表示，當(dāng)*P<0.05 時(shí)，認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳胞外多糖紅外光譜鑒定

每升黑木耳發(fā)酵液能提取多糖244 mg，純度為85.3%，F(xiàn)T-IR 光譜顯示，黑木耳胞外多糖為具有典型β-吡喃糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多糖（圖1），官能團(tuán)分析表明[17]，在3 419 cm-1處的寬峰是-OH 伸縮振動吸收峰，2 973 cm-1和2 918 cm-1處的弱吸收帶是-CH 伸縮振動吸收峰，1 735 cm-1和1 638 cm-1處的吸收峰表明含有糖醛酸，1 383 cm-1是-CH 彎曲振動吸收峰，1 078 cm-1和1 048 cm-1處的吸收峰是C-O-H 和C-O-C 中的C-O 引起的振動吸收；880 cm-1是β-糖苷鍵的特征吸收峰。

圖1 黑木耳胞外多糖在400～4 000 cm-1 FT-IR 光譜圖Fig.1 FT-IR analysis of exopolysaccharides from Auricularia auricula-judae fermentation at the range of 400-4 000 cm-1

2.2 黑木耳胞外多糖的單糖組成分析

黑木耳胞外多糖經(jīng)過酸水解和衍生化后，利用HPLC 分析其單糖組成。結(jié)果顯示，葡萄糖和木糖為其主要的單糖組分（物質(zhì)的量比為53.85%和25.05%），還有少量的甘露糖、果糖、巖藻糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸（表1）。與紅外光譜分析結(jié)果一致，黑木耳胞外多糖是由多種單糖組分構(gòu)成的雜合多糖。

表1 黑木耳胞外多糖的單糖組成分析Table 1 Monosaccharide composition analysis of Auricularia auricula-judae exopolysaccharides

2.3 黑木耳胞外多糖對小鼠體重及臟體比的影響

圖2 黑木耳胞外多糖飼喂小鼠體重變化趨勢圖Fig.2 Effects of Auricularia auricula-judae exopolysaccharides on the weight increasing of mice

與對照組相比，灌胃黑木耳胞外多糖后小鼠體重?zé)o明顯變化（圖2）。臟器系數(shù)是反映動物器官發(fā)育的重要指標(biāo)，可直觀反映受試物對動物存在的毒害作用[18]。本研究通過稱量小鼠各臟器組織質(zhì)量，計(jì)算其臟器系數(shù)。黑木耳胞外多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響見表2，統(tǒng)計(jì)分析顯示，樣品組與對照結(jié)果無顯著性差異（P>0.05）。上述試驗(yàn)表明，灌胃黑木耳胞外多糖不會引起小鼠臟器發(fā)生病理性異常。

表2 黑木耳胞外多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響Table 2 Effects of auricularia Auricula-judae exopolysaccharides on the organ coefficients of mice

2.4 黑木耳胞外多糖對小鼠腸道菌群的影響

本試驗(yàn)利用微生物16S rRNA 基因測序技術(shù)，探索了灌胃黑木耳胞外多糖小鼠腸道菌群的變化情況。測序所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)篩選過濾后，對獲得的序列進(jìn)行可操作單元分析（OTU）歸并劃分，采用Greengenes 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，通過多種多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工具對不同樣本（組）微生物群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，得到了小鼠腸道微生物16S rRNA 在屬水平OTU 序列的相對豐度（圖3）。通過Metastats 對樣本組間序列量差異的比較檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，擬桿菌屬和羅氏菌屬顯著增加（P<0.05），擬桿菌屬在多糖組腸道微生物群中占（10.31±1.5）%，而對照組為（5.4±1.38）%；羅氏菌屬在多糖組中占（0.17±0.07）%，而在對照組中未檢測到。

2.5 黑木耳胞外多糖對小鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響

腸道微生物通過膳食纖維的發(fā)酵和短鏈脂肪酸（SCFAs）的產(chǎn)生來提高能量利用率，從而提高宿主代謝效率[19]。本試驗(yàn)將小鼠糞便樣品按照1.6.4 節(jié)方法進(jìn)行處理和檢測，測定值代入SCFAs標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行含量計(jì)算。結(jié)果顯示，灌胃黑木耳胞外多糖后小鼠糞便中丙酸和丁酸含量顯著升高，其中丙酸含量為對照組的3.3 倍（P<0.01），丁酸是對照組的1.4 倍（P<0.05）（圖4）。

圖3 黑木耳胞外多糖飼喂小鼠腸道微生物群落組成情況（屬水平）Fig.3 Effects of Auricularia auricula-judae exopolysaccharides on the taxonomic composition abundance of gut microbiota at genus level in mice

圖4 氣相色譜法分析小鼠糞便中SCFAs 含量變化情況Fig.4 Quantification of short chain fatty acids （SCFAs）in the fecal samples of mice using gas chromatography

2.6 黑木耳胞外多糖對小鼠腸道GPR43 表達(dá)的影響

GPR43 是一種特異性短鏈脂肪酸受體，它可以通過介導(dǎo)短鏈脂肪酸，在調(diào)控脂類代謝和免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程以及在動物腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收中發(fā)揮重要作用[20]。本試驗(yàn)對小鼠結(jié)腸石蠟切片進(jìn)行GPR43 免疫熒光檢測，結(jié)果顯示胞外多糖組小鼠結(jié)腸GPR43 的表達(dá)明顯高于對照組。

2.7 黑木耳胞外多糖對小鼠血清細(xì)胞因子含量的影響

細(xì)胞免疫因子參與了炎癥的發(fā)生、維持和消退，在機(jī)體免疫中起到重要作用[21]。為了探索黑木耳胞外多糖對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響，利用ELISA 試驗(yàn)分析了小鼠血清中的相關(guān)細(xì)胞因子水平。結(jié)果如圖6所示，胞外多糖組小鼠血清中白介素-10（IL-10）的含量顯著升高，是對照組的1.3 倍（P<0.05），而其對腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的水平?jīng)]有明顯影響（P>0.05）。

圖5 黑木耳胞外多糖對小鼠結(jié)腸GPR43 表達(dá)水平的影響Fig.5 Expression of GPR43 in colon of mice fed with Auricularia auricula-judae exopolysaccharides

圖6 黑木耳胞外多糖對小鼠血清相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響Fig.6 Effects of Auricularia auricula-judae exopolysaccharides on the serum cytokines in mice

3 討論

黑木耳中的多種生物活性成分對人體健康具有重要調(diào)節(jié)作用[22]。本研究利用紅外光譜和高效液相定性分析了黑木耳胞外多糖的組分；通過小鼠灌胃試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑木耳胞外多糖可以提高小鼠腸道內(nèi)益生菌擬桿菌屬和羅氏菌屬水平，增加丙酸和丁酸含量，提升血清免疫因子IL-10 水平。

腸道微生物不僅參與人體能量代謝，還與眾多疾病相關(guān)，使其成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，人們更能清楚地認(rèn)識到維持腸道菌群平衡對人體健康的重要性[23]。近年，抗生素濫用逐漸引起人們的重視，其破壞腸道正常微生物組成，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，致使耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生和傳播[24]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有改善機(jī)體腸道微生態(tài)的作用，具有益生元作用，是理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[25]。本研究結(jié)果表明，黑木耳胞外多糖具有促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)擬桿菌屬和羅氏菌屬菌群增殖的功能。擬桿菌屬能對宿主飲食、宿主腸黏膜層和其它微生物表面的復(fù)合多糖進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和分解[26]；羅氏菌屬能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸，尤其是丁酸，不僅具有影響結(jié)腸代謝、調(diào)節(jié)免疫和抗炎等作用，還可用作癥狀病理學(xué)（如膽結(jié)石形成）生物標(biāo)志物或恢復(fù)有益菌群的益生菌[27]。因此，作為一種微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，黑木耳胞外多糖可以在調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮作用，具有取代抗生素治療的潛在應(yīng)用價(jià)值。

腸道微生物菌群產(chǎn)生的SCFAs 作為膳食纖維的發(fā)酵產(chǎn)物，參與宿主免疫調(diào)節(jié)[28]。在淋巴B 細(xì)胞中，SCFAs 增加乙酰輔酶A 并調(diào)節(jié)代謝傳感器以增加氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸合成，從而產(chǎn)生能量和物質(zhì)促進(jìn)抗體產(chǎn)生。此外，SCFAs 可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控血漿中B 細(xì)胞的分化[29]。有研究表明，多糖類物質(zhì)不被消化道的胃酸和酶類消化，進(jìn)入腸道后為微生物提供營養(yǎng)源，使其迅速增殖并產(chǎn)生大量SCFAs 和一些抗菌物質(zhì)，降低腸道內(nèi)pH 值，抑制腸道內(nèi)氨和吲哚等有害物質(zhì)生成，抑制有害菌生長，從而改善腸道微生態(tài)[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)黑木耳胞外多糖能提高小鼠腸道內(nèi)丙酸和丁酸含量，具有調(diào)節(jié)腸道物質(zhì)能量代謝的作用。

Kang 等[30]研究了枸杞多糖對自發(fā)性結(jié)腸炎的有益作用及其在IL-10 缺失小鼠中的益生作用，發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可以提高丁酸鹽產(chǎn)生菌羅氏菌屬的豐度。IL-10 是一種抗炎細(xì)胞因子，在控制免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在缺失IL-10 的結(jié)腸炎和炎性腸病小鼠模型中，巨噬細(xì)胞中受損線粒體積累，導(dǎo)致NLRP3 炎性小體激活和IL-1β 產(chǎn)生，引發(fā)炎性反應(yīng)[31]。本研究顯示，黑木耳胞外多糖能夠提升小鼠血清中免疫因子IL-10 水平，具有抗炎作用。然而，黑木耳胞外多糖對IL-10 的調(diào)控機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，黑木耳胞外多糖能夠促進(jìn)小鼠腸道內(nèi)有益菌增殖，提高菌群代謝產(chǎn)物SCFAs 含量，增加機(jī)體抗炎因子水平，在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡及免疫反應(yīng)方面具有重要作用。本研究為黑木耳胞外多糖益生菌微生態(tài)制劑和新型健康食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。