副豬嗜血桿菌銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗對小鼠免疫功能的影響

葉碧錦，劉 棟，賴連杰，劉 星，張秋娟，尹會方,2 ，李曉華，2，3

(1.龍巖學(xué)院；2.福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室；3.福建省生豬疫病防控工程研究中心 福建龍巖 364000)

副豬嗜血桿菌(HPS)是當前危害保育豬最嚴重的細菌病之一[1]。隨著集約化養(yǎng)殖的飛速發(fā)展，豬群飼養(yǎng)密度越來越高，本病危害日益嚴重，成為全球范圍內(nèi)危害養(yǎng)豬業(yè)的典型細菌性疾病之一，且呈逐年上升的趨勢[2]，給豬場帶來嚴重損失。近年來抗生素的濫用導(dǎo)致副豬嗜血桿菌(HPS)的耐藥性越來越普遍，采用疫苗免疫成為防治副豬嗜血桿菌病經(jīng)濟而有效的途徑。在副豬嗜血桿菌桿菌滅活苗研制中，選用能顯著提高體液免疫作用的佐劑對提高疫苗的效力起著重要作用[3]。楊飛等[4]研究表明，疫苗佐劑能夠調(diào)節(jié)細胞因子的分泌，增強機體的免疫功能。張繼東等[5-6]研究表明，一些中藥具有增強和調(diào)節(jié)免疫的作用，能促進動物免疫器官的發(fā)育，增強機體的細胞免疫和體液免疫功能。

銀杏是一種具有很高藥用價值的古老孑遺植物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對機體的免疫功能有很大的促進作用，銀杏葉提取物能調(diào)節(jié)細胞因子的分泌來增強機體的免疫功能。張申等[7]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物具有抗炎抗氧化應(yīng)激的作用，使IL-1、IL-6、TNF-α和COX-2分泌水平趨于正常，調(diào)控炎癥因子在病菌感染時過度表達而使機體功能受損，維持機體的平衡穩(wěn)態(tài)。將銀杏葉提取物作為佐劑疫苗治療手段，大大提高畜禽動物的存活率。李曉華等[5]應(yīng)用銀杏葉黃酮苷作為副豬嗜血桿菌5型滅活疫苗的佐劑研究發(fā)現(xiàn)，添加一定劑量的銀杏葉黃酮苷對仔豬的免疫調(diào)節(jié)有促進作用；可以刺激機體產(chǎn)生 IL-2、IL-4細胞因子，對仔豬有一定的免疫促進作用。為了探索銀杏葉黃酮苷作為副豬嗜血桿菌滅活疫苗佐劑的可行性，本次試驗以小鼠為動物模型，應(yīng)用自制副豬嗜血桿菌血清4型銀杏葉黃酮苷佐劑疫苗免疫小鼠，用血清4型副豬嗜血桿菌強毒株攻毒，通過觀察小鼠保護率，測定小鼠IgG抗體、小鼠外周血T淋巴細胞水平及IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ等細胞因子的水平，研究銀杏葉黃酮苷作為疫苗佐劑的應(yīng)用效果，以期為開發(fā)中草藥疫苗佐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：副豬嗜血桿菌血清4型菌株分離自龍巖某豬場，現(xiàn)存于福建省生豬疫病防控工程研究中心實驗室。

實驗動物：Balb/c實驗鼠，雌雄各半，體重22～25 g(福建吳氏實驗動物有限公司提供，合格證號：FJWS2019-052)。

實驗試劑：TSA、TSB購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；AG購自上海仝元生物科技有限公司；NAD購自上海克拉瑪爾；小牛血清，購自上海江林生物科技有限公司；銀杏提取物購自德國威瑪舒培博士藥廠(銀杏提取物原液每毫升含銀杏黃酮苷9.6 mg,萜內(nèi)酯1.47 mg)；血液RNA、DNA反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量檢測試劑盒購自TAKARA生物公司；HPS抗體檢測試劑盒購自北京飛凱生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 佐劑疫苗的制備

1.2.5 小鼠細胞因子的檢測[9]

表1 副豬嗜血桿菌佐劑疫苗的制備

收集小鼠肝素鈉抗凝外周血，取100 μL抗凝血裂解紅細胞，洗滌并重懸細胞，用 BD FACS Calibur流式細胞儀檢測 T淋巴細胞亞群 CD4+和CD8+比值變化，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析試驗結(jié)果。

隨機選取50只小鼠，設(shè)置5個實驗組，每組小鼠10只，雌雄各半。分別為高、中、低濃度佐劑疫苗組、疫苗組和生理鹽水對照組，一免皮下注射0.2 mL/只，14 d后以同樣的途徑和劑量進行二免。21 d后用HPS血清4型強毒株腹腔注射攻毒(1.2×109CFU·mL-1，0.5 mL/只)。記錄小鼠臨床表現(xiàn)，統(tǒng)計小鼠死亡率。

1.2.3 小鼠采血

同樣的，我們?nèi)杂蒙衔墓蚕斫?jīng)濟的定義嘗試深究一下，元征此舉是類似于滴滴打車和愛彼迎為交易服務(wù)提供兩端鏈接的平臺。滴滴打車鏈接了私家車主和乘客，愛彼迎鏈接了個人房東和有住宿需求的旅客，元征鏈接了汽修技師和車主，使得閑置的汽修技師的技術(shù)資源得到充分利用，給汽修技師和車主雙方提供便利。而略有不同的是，滴滴打車和愛彼迎實現(xiàn)的是汽車、房屋等的共享，共享維修站除了場地和設(shè)備的共享，更具意義的是實現(xiàn)汽修技師技術(shù)的共享，同時解決了汽車維修這一服務(wù)對場地和設(shè)備的需求，從而使這一技術(shù)的共享得以落地實施。

分別在二免后第7 d和14 d小鼠眼眶采血，一部分于4000 r/min離心20 min后收集血清，2～8 ℃保存，用于IgG抗體的檢測；另一部分用肝素鋰抗凝處理，置于-70 ℃保存，用于細胞因子的檢測。

1.2.4 小鼠副豬嗜血桿菌IgG抗體的檢測相關(guān)操作參照試劑盒使用說明書進行。

將存于實驗室的副豬嗜血桿菌血清4型菌株涂布于TSA培養(yǎng)基上復(fù)壯，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種于100 mL含5%(V/V)犢牛血清、4%(V/V)NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃180 r/min搖床培養(yǎng)過夜，再將種子液按1∶10(V/V)轉(zhuǎn)接至含5%(V/V)犢牛血清、4%(V/V)NAD的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃180 r/min搖床培養(yǎng)18 h，測OD600值，計算活菌含量；按菌液總體積加入0.5%甲醛置37 ℃搖床中滅活，24 h后取滅活菌液于TSA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，檢驗是否有細菌生長。滅活菌液用PBS調(diào)整濃度為1.33×1010CFU·mL-1，將菌液與不同濃度銀杏葉黃酮苷混勻作為佐劑疫苗的水相(見表1)，白油與司班-80滅菌作為油相，水相和油相按比例(V∶V=1∶1.5)乳化，制備成油包水滅活苗，檢驗物理性狀合格后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

我恨透了日本人。教會學(xué)校本來全是學(xué)英語、法語，日本人來了，非要我們學(xué)日語，教我們的老師就是日軍翻譯官，經(jīng)常打我們。我一生只打過一次人?？箲?zhàn)勝利后，我邀了三個最要好的同學(xué)，在大街上對著迎面來的一個日本兵，走上去狠狠地搧了他個耳光。

1.2.6 外周血淋巴細胞亞群測定

表2 熒光定量PCR引物序列及退火溫度

根據(jù)Genbank公布的小鼠細胞因子基因序列設(shè)計引物以及內(nèi)參基因β-Actin的引物序列，由上海生工生物有限股份公司合成并提供。RNA的提取、cDNA的制備及Real-timePCR按說明書進行，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性和變性30 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)(見表2)。

1.2.2 小鼠的免疫及攻毒

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

新的經(jīng)濟周期機制的稅務(wù)策劃、分析和規(guī)劃將是一項稅，一種緩慢的稅收，所有企業(yè)在宏觀控制、加強企業(yè)管理和全面統(tǒng)計，降低產(chǎn)品的成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，使企業(yè)在市場競爭優(yōu)勢的優(yōu)勢。稅收策劃稅收不同，根據(jù)法律規(guī)定，沒有非法的問題。

一免后，銀杏葉黃酮苷疫苗佐劑組IgG抗體水平均高于疫苗組，其中高濃度組IgG抗體水平顯著高于疫苗組(P<0.01)；二免后，高濃度組IgG抗體水平低于疫苗組，低濃度組和中濃度組的IgG抗體水平顯著高于疫苗組(P<0.01)(見圖1)。

2 結(jié)果

2.1 攻毒小鼠情況

攻毒4 h后，小鼠開始出現(xiàn)焦躁、亂竄等現(xiàn)象；攻毒10 h后，小鼠精神沉郁，被毛濕亂，出現(xiàn)聚集、扎堆、厭食、倒翻和抽搐等現(xiàn)象；攻毒14 h后，未死亡的小鼠狀態(tài)低迷，超過一半的小鼠死亡，疫苗組和生理鹽水組死亡嚴重，其中生理鹽水組小鼠全部死亡；攻毒48 h后，存活小鼠活躍度提升，采食、飲水等生理活動恢復(fù)正常。小鼠攻毒后保護率，低濃度組為80%，中濃度組為50%，高濃度組為30%，疫苗組為60%，生理鹽水對照全部死亡(見表3)。

表3 小鼠副豬嗜血桿菌4型攻毒結(jié)果

2.2 小鼠IgG抗體檢測水平結(jié)果

使用 SPSS 20.0 軟件單因素方差分析和 LSD 法進行組間比較，當P<0.05時,差異被認為具統(tǒng)計學(xué)意義；使用2-△△Ct法[10-11]計算熒光定量PCR的基因表達，選擇β-Actin為內(nèi)參基因，計算公式為：△△CT=(CTTarget-CTβ-Actin)experimental -(CTTarge-CTβ-Actin)control。

注：與疫苗組相比，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001，下同圖1 小鼠血清IgG抗體水平

2.3 細胞因子的檢測結(jié)果

對免疫后小鼠熒光定量PCR所得的CT值進行定量分析，結(jié)果表明：高、中、低三個濃度的銀杏葉黃酮苷疫苗佐劑組對IL-4的表達具有顯著促進作用(P<0.01)；低濃度組對TNF-α的表達有極顯著作用(P<0.001)；高濃度組對INF-α的促進表達有顯著作用(P<0.05)；疫苗組和生理鹽水對照組對IL-4和TNF-α的表達無明顯差異；添加銀杏葉黃銅苷佐劑組對IL-2、IL-10和IFN-γ作用均不明顯(P>0.05)(見圖2)。

佐劑疫苗組、疫苗組CD4+和CD8+T淋巴細胞檢測結(jié)果分別如圖3A、B和C所示。結(jié)果顯示，與未添加黃酮苷佐劑的疫苗組比較，添加低濃度黃酮苷佐劑顯著升高小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞比例(P<0.05)，添加銀杏黃酮苷佐劑中濃度組和高濃度組較疫苗組略有升高，但差異不顯著(圖3A)；與疫苗組比較，添加低濃度黃酮苷佐劑雖可降低 CD8+T淋巴細胞的比例，但疫苗組和佐劑疫苗組之間差異不顯著(圖3D)；對小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞的比值，低濃度黃酮苷佐劑疫苗組和高濃度黃酮苷佐劑疫苗組顯著升高(P<0.05)，表明銀杏葉黃酮苷可刺激機體淋巴細胞的分化(見圖3E)。

圖2 小鼠外周血細胞因子的基因表達量

2.4 T淋巴細胞亞群的檢測

筆者不憚篇幅，引用其說，意在彰明石濤論中國畫創(chuàng)作整體性的“曲折”邏輯:筆墨→氤氳→混沌→一畫(實為筆墨)→自我→筆墨→胎一(即混沌)→氤氳→筆墨，由此進入到創(chuàng)造的循環(huán)之中。此段批評，實際上是論說了筆墨與氤氳、筆墨與自我、筆墨與混沌三種關(guān)系，但石濤并未以今天常見的批評方式，分而論之，而是以線性回文的三個回環(huán)，來曲折言說。于此，正鮮活現(xiàn)出積淀在中國藝術(shù)家、批評家心靈與思維深處的“曲折感”。

A B C

3 分析與討論

銀杏葉黃酮苷對單核巨噬細胞具免疫促進作用。覃紅斌[10]、VILLASENOR等[11]報道，銀杏葉黃酮苷能提高大鼠、小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力。本實驗中，添加不同濃度的黃酮苷佐劑對小鼠均有保護作用，以低濃度添加量保護率最好。

體液免疫是B細胞介導(dǎo)的一種重要的免疫反應(yīng)，血清中抗體水平為評估其免疫狀況的重要指標之一。銀杏葉黃酮苷能促進抗體的生成，增強機體的體液免疫功能[12]。明亮等[13]試驗證明，銀杏黃酮提取物能明顯提高環(huán)磷酰胺引起的免疫功能低下的小鼠血清IgG水平。本次實驗，一免后，銀杏葉黃酮苷疫苗佐劑組IgG抗體水平均高于疫苗組，其中高濃度組IgG抗體水平顯著高于疫苗組(P<0.01)；二免后，低濃度組和中濃度組的IgG抗體水平仍顯著升高，但高濃度組IgG抗體水平顯著降低，IgG抗體水平低于疫苗組。王蕙等[14]試驗發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮對體外淋巴細胞增殖的影響具有劑量依賴性，但當濃度過高對淋巴細胞增殖有明顯抑制作用。高濃度銀杏黃酮苷對小鼠體液免疫應(yīng)答是否也具抑制作用，有待進一步研究。

（3）設(shè)計僅考慮最大負荷工況，未結(jié)合長期運行過程中的實際生產(chǎn)負荷，變工況狀態(tài)下機組與循環(huán)泵系統(tǒng)的調(diào)節(jié)措施欠缺；

細胞因子(cytokine，CK)是外界病原體刺激免疫系統(tǒng)時誘導(dǎo)免疫細胞分泌參與機體免疫調(diào)節(jié)的一種小分子量蛋白質(zhì)，通過協(xié)同、拮抗等多種生理特性抵抗病原體的入侵，消滅機體有害病原體，不同的細胞分泌不同的細胞因子且行使著不同的功能職責(zé)，調(diào)節(jié)參與機體的免疫作用，維持體內(nèi)的正常的生理穩(wěn)態(tài)平衡。IL-4是輔助性T細胞(TH細胞)在識別抗原過程中產(chǎn)生的重要的細胞因子，對淋巴細胞的活化、生長和分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。IL-4是TH2分泌的細胞因子，對B細胞活化具有重要作用。王國棟等[15]研究表明，銀杏葉提取物能調(diào)節(jié)機體LPS的數(shù)量，LPS可誘導(dǎo)KC細胞表達TNF-α，當銀杏葉提取物濃度增加時，合成TNF-α的mRNA和相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達被抑制，從而抑制KC細胞釋放過量的TNF-α，達到抗炎的效果。張素英等[16]將銀杏葉提取物連續(xù)12周灌胃糖尿病模型實驗鼠發(fā)現(xiàn)，腎組織中的IL-6以及TNF-α等炎癥因子明顯升高，進而改善糖尿病模型實驗鼠的腎功能，降低了DN的發(fā)生率，本次實驗結(jié)果，細胞因子分泌量只有IL-4和TNF-α的有明顯的變化，低濃度組的佐劑疫苗明顯能促進IL-4和TNF-α的表達(P<0.01)，中、高濃度組對IL-4的表達也有促進(P<0.05)；高濃度組也能促進TNF-a的表達，但差異不明顯。

CD4+/CD8+比值是判斷機體免疫功能狀態(tài)的重要指標，正常小鼠CD4+/CD8+比值為1～2[16-18]。對小鼠外周血T淋巴細胞亞群的檢測結(jié)果標明，添加低濃度黃酮苷佐劑能顯著升高小鼠外周血中CD4+T淋巴細胞比例(P<0.05)，對小鼠外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞的比值，低濃度黃酮苷佐劑疫苗組和高濃度黃酮苷佐劑疫苗組顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，表明銀杏葉黃酮苷可刺激機體淋巴細胞的分化。

綜上所述，利拉魯肽聯(lián)合胰島素治療肥胖T2DM是安全有效的，可顯著控制血糖、血脂，改善胰島功能，值得臨床應(yīng)用推廣。

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銀杏葉黃酮苷提取物的藥用價值廣泛。在營養(yǎng)飼料上，李焰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加不同劑量的銀杏葉黃酮苷提取物與肉雞飼糧混合飼喂肉雞，均能提高肉雞的日增重；添加0.20%的銀杏葉黃酮苷提取物可降低盲腸中21.99%的大腸桿菌數(shù)量；添加0.25%的銀杏葉黃酮苷提取物，能使盲腸中乳酸菌數(shù)量提高7.74%，粗蛋白利用率提高7.14%。黃其春等[20-21]在仔豬日糧中添加質(zhì)量分數(shù)0.2%和0.3%的銀杏葉黃酮苷提取物,能夠增強斷奶仔豬的體液免疫功能，改善斷奶仔豬血清生化指標,提高生長相關(guān)激素水平,促進仔豬生長。銀杏葉黃酮苷作為疫苗佐劑的研究目前未見報道。本實驗結(jié)果，在副豬嗜血桿菌4型滅活疫苗中添加低濃度銀杏葉黃酮苷能顯著提高小鼠機體內(nèi)IgG抗體水平，促進誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫反應(yīng)。綜上，本試驗表明，銀杏葉黃酮苷具有一定的免疫佐劑效果，但其在豬的免疫效果還需進一步試驗研究。