玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料的制備工藝條件

林標(biāo)聲，嚴(yán)建彬，鐘志龍，羅 建，周孝瓊

(1. 龍巖學(xué)院；2. 易之泰生物科技(龍巖)有限公司；3. 龍巖正高生物科技有限公司；4. 福建龍巖金和動(dòng)物飼料有限公司 福建龍巖 364000)

玉米芯是玉米果穗脫去子粒后的穗軸，在中國(guó)年產(chǎn)量巨大，達(dá)2千萬(wàn)噸以上[1]。目前，大部分玉米芯未得到充分的利用，主要作為燃料燒掉，一方面污染環(huán)境，另一方面又造成了資源的極大浪費(fèi)。研究表明，玉米芯中包括32%～36%纖維素、35%～40%半纖維素、17%～20%木質(zhì)素和少量的灰分以及其它組分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，經(jīng)加工后可用作優(yōu)質(zhì)粗飼料資源[2]。但實(shí)踐表明，玉米芯中主要營(yíng)養(yǎng)成分纖維素、半纖維素和復(fù)雜多糖等在畜體內(nèi)難以消化，實(shí)際飼喂的效果并不理想[3]。目前市場(chǎng)上玉米芯發(fā)酵飼料產(chǎn)品主要為添加復(fù)合益生菌發(fā)酵，未添加外源的酶制劑[4]或僅添加單一酶制劑發(fā)酵[5]，玉米芯中的大分子物質(zhì)未得到最充分的利用。因而，本研究采用益生菌及多功能外源酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)以期增強(qiáng)玉米芯各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，改善適口性和消化利用率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，用以改善畜禽腸道生態(tài)平衡，增強(qiáng)免疫力，提高生產(chǎn)性能，并為玉米芯的綜合利用及畜禽飼糧的配制研究提供基礎(chǔ)依據(jù)[6]。

本研究結(jié)合微生物益生菌改善腸道健康和非淀粉多糖(Non- Starch Polysaccharide，NSP)酶對(duì)玉米芯主要營(yíng)養(yǎng)成分具有良好降解作用的優(yōu)勢(shì)，制備一種玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵預(yù)混飼料，通過(guò)采用響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman、Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化其發(fā)酵工藝參數(shù)，確定玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料最優(yōu)的制備工藝條件，以期開(kāi)發(fā)出一種適合育肥豬飼用的高品質(zhì)混合飼料，變廢為寶，延長(zhǎng)玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物料應(yīng)用產(chǎn)業(yè)鏈，為其在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米芯：市場(chǎng)購(gòu)買，去掉霉?fàn)€部分，60～70 ℃烘干后過(guò)50～100目篩粉碎備用。

復(fù)合菌株：根據(jù)玉米芯的營(yíng)養(yǎng)成分及已有的玉米芯發(fā)酵飼料研究[4]，從市場(chǎng)購(gòu)買含發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)凍干菌混合菌粉，其中發(fā)酵乳桿菌含量6.2×109～7.7×109CFU/g、釀酒酵母3.3×108～4.6×108CFU/g、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)2.5×108～4.2×108CFU/g。

NSP酶及其活力組成：木聚糖酶活性10000～20000 U/g，β-葡聚糖酶活性1000～1500 U/g，甘露聚糖酶活性200～300 U/g，纖維素酶活性2000～4000 U/g，果膠酶活性100～300 U/g。

發(fā)酵裝置：選擇帶有單向透氣孔的PE膜，5～7層厚，透氣孔經(jīng)9～12 mm，透氧量2.25～4.42 cm3/m2.d. bar ，排氣壓力678～750 mmH2O。

玉米芯發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1000 g)：玉米芯670 g，紅糖15 g，復(fù)合多維15 g，水300 g，另添加NSP酶0.6～0.8 g。其中，每千克復(fù)合多維包括：維生素A 4000000 IU，維生素B1 1000 mg，維生素B2 3200 mg，維生素B6 800.0 mg，維生素B12 24 mg，維生素D3 1200000 IU，維生素E 30000 IU，維生素K3 800.0 mg， D-生物素 480.0 mg，D-泛酸 14400 mg，葉酸2800 mg，煙酸24000 mg。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)整體工藝流程

發(fā)酵復(fù)合菌株→25～30 ℃紅糖水活化

↓

發(fā)酵原料(玉米芯、復(fù)合多維、NSP酶、水等)→ 混合→單向透氣孔的PE膜袋裝密封→發(fā)酵→檢測(cè)產(chǎn)品(營(yíng)養(yǎng)成分、總菌數(shù)、外觀形態(tài)等)

1.2.2 影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵效果關(guān)鍵因素篩選的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在1000 g裝量的發(fā)酵袋中設(shè)定的比例接入發(fā)酵原料(玉米芯、復(fù)合多維、NSP酶)、紅糖水活化后的菌株，并按比例補(bǔ)足水分，包裝、密封，在25～30 ℃下進(jìn)行發(fā)酵5～8 d，待發(fā)酵物料中顏色變深明顯，含有明顯清香氣味時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，待檢。采用響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總菌數(shù)為響應(yīng)值篩選出影響發(fā)酵效果的顯著因素，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示[7]。

表1 影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平表和編碼

1.2.3 影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵效果的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選對(duì)響應(yīng)值影響顯著的關(guān)鍵因素進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)[8]，優(yōu)化得到影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，并對(duì)最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證分析。

1.2.4 發(fā)酵飼料產(chǎn)品性能測(cè)定

對(duì)所優(yōu)化確定的最優(yōu)工藝條件制備玉米芯發(fā)酵飼料，對(duì)產(chǎn)品發(fā)酵前后的外觀、微生物菌株含量、營(yíng)養(yǎng)成分組成等進(jìn)行分析，檢測(cè)發(fā)酵效果。微生物菌株含量采用平板活菌計(jì)數(shù)法；粗蛋白、干物質(zhì)、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗脂肪、還原糖、鈣、磷等營(yíng)養(yǎng)成分分析均按照飼料常規(guī)分析方法測(cè)定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵效果關(guān)鍵因素的篩選結(jié)果

對(duì)影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵效果的各因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)所得響應(yīng)值見(jiàn)表2所示，各因素影響結(jié)果的分析見(jiàn)表3所示。結(jié)果表明：影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵效果的因素重要性依次排序是：玉米芯(X1)﹥菌液接種量(X6)﹥NSP(X5)﹥紅糖(X2)﹥水(X4)復(fù)合多維(X3)﹥發(fā)酵時(shí)間(X8)﹥發(fā)酵溫度(X7)。其中，玉米芯(X1)、菌液接種量(X6)、NSP(X5)三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值(總菌數(shù))的影響達(dá)到了顯著水平，用以選做進(jìn)一步的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化分析。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素影響重要性分析

2.2 玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵的最優(yōu)工藝條件優(yōu)化結(jié)果

按Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選的影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵的三個(gè)顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面分析法的Box-Benhnken設(shè)計(jì)，同樣以總菌數(shù)為響應(yīng)值，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4所示。采用Design-Expert7.0 軟件對(duì)索獲得的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，獲得響應(yīng)值(總菌數(shù))和各因素之間的二元回歸方程為：Y=4.91+0.16A+0.094B+0.032C+0.02AB-0.048AC+0.052BC-0.18A2-0.15B2-0.13C2。響應(yīng)值(總菌數(shù))和各因素之間的回歸模型分析見(jiàn)表5所示，該模型P<0.000、失擬項(xiàng)P=0.0708>0.05，擬合情況好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最終確定對(duì)玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵影響大小依次為玉米芯(A)>菌液接種量(B)>NSP(C)，且三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響均達(dá)顯著水平(P<0.05)。

表4 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

表5 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸模型方差分析

影響玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵的三個(gè)顯著因素的響應(yīng)面曲面分析如圖1所示，Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝參數(shù)及響應(yīng)值為：玉米芯 691.75 g/kg、菌液接種量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.01%、NSP 0.71 g/kg，總菌數(shù)為4.97×1010。對(duì)此工藝參數(shù)進(jìn)行三次實(shí)踐驗(yàn)證，所得實(shí)際總菌數(shù)均值為4.96×1010，與模型預(yù)測(cè)值非常接近，比Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得最高響應(yīng)值4.89×1010提高了1.43%。

2.3 產(chǎn)品性能測(cè)定結(jié)果

最優(yōu)工藝條件下所制備的玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料發(fā)酵前后產(chǎn)品的性能測(cè)定見(jiàn)表6所示，結(jié)果表明玉米芯經(jīng)菌酶協(xié)同發(fā)酵處理后，其顏色加深，產(chǎn)生了明顯的酒香味和乳酸味，產(chǎn)品色澤、手感、質(zhì)地也發(fā)生了明顯改善；與發(fā)酵前相比，玉米芯發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)、鈣、磷含量增加，干物質(zhì)、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗脂肪、還原糖含量下降，其中粗蛋白質(zhì)、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維四個(gè)指標(biāo)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。結(jié)果表明添加NSP酶后，大大增加了玉米芯中大分子物質(zhì)利用效率，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化效率明顯提高，同時(shí)也為微生物菌株的生長(zhǎng)提供了更多的能量，各微生物菌株數(shù)量也明顯增加。

表6 玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵前后產(chǎn)品性能的測(cè)定

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)響應(yīng)面分析法中的Plackett-Burman、Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化得到了玉米芯菌酶協(xié)同發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為玉米芯 691.75 g/kg、菌液接種量為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2.01%、NSP 0.71 g/kg。菌酶協(xié)同發(fā)酵后，玉米芯中大分子物質(zhì)利用效率增加，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化效率明顯提高，產(chǎn)生了明顯的酒香味和乳酸味，產(chǎn)品色澤、手感、質(zhì)地也發(fā)生了明顯改善，為制備發(fā)酵預(yù)混飼料，替代基礎(chǔ)日糧中玉米、豆粕等部分能量成分提供了參考依據(jù)。

NSP是植物性飼料細(xì)胞壁的主要成分，不易被單胃動(dòng)物消化利用[10]，且水溶性的非淀粉多糖(如阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖)具有高度的粘性，能使動(dòng)物腸道中的食糜粘度增加，阻礙飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與消化液接觸，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化，降低飼料轉(zhuǎn)化率和動(dòng)物生產(chǎn)性能，而添加NSP酶可以消除或減輕NSP的不良影響[11-12]，但NSP酶在飼料發(fā)酵中的研究屬于新生事物，應(yīng)用還屬于探索階段[13]。本研究創(chuàng)新性地采用了乳酸菌、酵母菌等復(fù)合益生菌與NSP酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)制備玉米芯發(fā)酵飼料，增強(qiáng)了玉米芯各物質(zhì)的降解，提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。一方面NSP酶可以破壞玉米芯細(xì)胞壁，切割其中可溶性非淀粉多糖，促進(jìn)細(xì)胞壁包裹的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放，降低腸道內(nèi)容物黏度，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與酶的相互作用，提高了消化率。另一方面，復(fù)合益生菌也可將玉米芯中畜禽難以消化的大分子物質(zhì)分解成易被動(dòng)物機(jī)體消化吸收的小肽、葡萄糖、氨基酸和維生素等小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且益生菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的乳酸、乙醇的物質(zhì)還提高了飼料的適口性，刺激了生豬采食量增加，對(duì)于改善飼料適口性、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道健康具有積極意義[14]。總之，菌酶協(xié)同發(fā)酵技術(shù)貫穿整個(gè)發(fā)酵飼料加工生產(chǎn)過(guò)程，其微生物益生菌與酶解技術(shù)相結(jié)合的功能，是發(fā)酵飼料最大的技術(shù)突破點(diǎn)，代表將來(lái)生物飼料發(fā)展的一個(gè)重要方向[15]。