干旱脅迫對(duì)藜麥幼苗組織解剖結(jié)構(gòu)和生理特性的影響

趙紅梅 鄧素芳 楊艷君 冀愛青 李洪燕

(晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 榆次 030600)

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、分布及產(chǎn)量的重要逆境因子之一，植物通?？梢酝ㄟ^形態(tài)反應(yīng)、調(diào)整細(xì)胞代謝和啟動(dòng)各種防御機(jī)制來應(yīng)對(duì)干旱脅迫[1]。Lee等[2]研究表明水稻可通過增加根系導(dǎo)管數(shù)量來協(xié)助植株抵御干旱條件。Chimungu等[3]研究認(rèn)為玉米可通過減少根系皮層細(xì)胞降低代謝消耗，以提高水分利用率。陳文妃等[4]研究表明黃瓜幼苗在輕度干旱脅迫下會(huì)出現(xiàn)根皮層薄皮細(xì)胞減少、莖木質(zhì)部導(dǎo)管萎縮及葉片柵欄組織排列緊密等組織結(jié)構(gòu)的變化。劉忠靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下由于葉片產(chǎn)生過量的活性氧從而導(dǎo)致葉片柵欄組織和海綿組織排列疏松。表明不同植物葉片組織結(jié)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)不同。脯氨酸作為“滲透保護(hù)劑”，其代謝過程是植物在干旱脅迫下重要的細(xì)胞代謝反應(yīng)之一[6-7]。干旱脅迫下，植物體內(nèi)積累大量脯氨酸，不僅可以防止細(xì)胞脫水，而且可以降低有毒離子含量[8-9]。另外，過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶活性的提高也是解除植物活性氧(reactive oxygen species，ROS)危害的關(guān)鍵參與者，抗氧化酶可清除逆境脅迫產(chǎn)生的ROS，提高植物抗逆性[10-12]。

藜麥(ChenopodiumquinoaWild)是一種古老的具有遺傳多樣性的安第斯山脈類谷類作物，近年來由于其種子中的高蛋白含量與良好氨基酸組成等健康特性，以及其能適應(yīng)不同環(huán)境(包括營(yíng)養(yǎng)貧瘠的鹽地和干旱脅迫的邊緣農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)等)堿抗逆特性[13]而備受國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前關(guān)于藜麥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和活性成分提取的研究報(bào)道較多[14-15]，而有關(guān)藜麥抗逆性的研究尚處于起步階段，尤其對(duì)逆境脅迫下藜麥的不同組織形態(tài)及生理特性方面的研究較少。因此，本研究以藜麥幼苗為試驗(yàn)材料，探究不同組織根、莖、葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，并從脅迫下不同組織中脯氨酸含量及其相關(guān)酶活性變化、抗氧化物酶活性變化等方面探討藜麥的抗旱機(jī)理，以期為藜麥品種選育、栽培管理及合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藜麥品種為華青一號(hào)，由山西省靜樂縣華青藜麥種子公司提供。該品種藜麥籽呈淺黃色，扁圓柱形，植株呈掃帚狀，株高約180～220 cm，生育期110～120 d，屬中熟品種，抗旱、耐瘠性較強(qiáng)，不耐高溫和雨澇，中等抗倒伏，適宜在海拔1 000 m以上的旱源地區(qū)種植。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 藜麥幼苗的培育 選取顆粒飽滿的藜麥種子，將其置于墊襯濕紗布的培養(yǎng)皿中，待發(fā)芽之后用鑷子將其移至裝有試驗(yàn)基地土壤的培育盆中，每盆種植8株，共27盆，并放置于生化培養(yǎng)箱，恒溫25℃培養(yǎng)，采用稱重法，確定每天的加水量維持所需田間持水量。待藜麥幼苗長(zhǎng)至六葉一心期，進(jìn)行干旱處理。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)不同田間持水量，分別為100%、50%、25%，并分別設(shè)置3個(gè)干旱處理時(shí)間，分別為0、48、96 h，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。

1.2.2 干旱處理 根據(jù)Earl[16]的方法并稍作修改。根據(jù)環(huán)刀法測(cè)定試驗(yàn)基地田間持水量約為40%，為保證實(shí)驗(yàn)室干旱處理?xiàng)l件的一致性，以帶回的濕土量與干土量為基礎(chǔ)，采用稱重加水的方法控制不同的田間持水量，130 g濕土壤經(jīng)烘干后測(cè)得干重為92.58 g，失去的水分為37.42 g，將該田間持水量設(shè)為100%，然后計(jì)算50%和25%田間持水量所需的水分，干旱處理時(shí)在同樣的干土中加入計(jì)算好的水量，達(dá)到所需土壤的重量，分別為130 g(100%)、111.29 g(50%)、101.94 g(25%)，然后將藜麥幼苗移栽至不同處理中，每盆每天測(cè)量3次，及時(shí)補(bǔ)水保持重量不變。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

田間持水量的測(cè)定：采用環(huán)刀法測(cè)定田間持水量，在試驗(yàn)基地選擇挖掘的土壤位置，先用土刀修平土壤表面，按0.5 m的深度將環(huán)刀向下垂直壓入土中，直至環(huán)刀筒中充滿土樣，然后用土刀切開環(huán)刀周圍的土樣，取出已充滿土的環(huán)刀，細(xì)心削平刀兩端多余的土，并擦凈環(huán)刀外圍的土，將其帶回實(shí)驗(yàn)室。在環(huán)刀底端放2張大小合適的濾紙，紗布包好后用橡皮筋扎好。放在事先放有濾紙的盆中，注入清水，并保持盆中水的高度低于環(huán)刀上沿約1～2 mm，使環(huán)刀中土壤充分浸泡直至水分沿毛管上升而全部充滿為止。取出裝土環(huán)刀，去掉紗布和濾紙，取出一部分土壤放入已知重量的鋁盒內(nèi)稱重得濕土重，然后放入105～110℃烘箱中，烘干至恒重后稱重，得干土重。根據(jù)公式計(jì)算田間持水量：

田間持水量=[(濕土重-干土重)/干土重]×100%

(1)

組織解剖結(jié)構(gòu)的觀察：用流水洗凈藜麥根系樣品，濾紙吸干表面水分后，沿根尖5～6 cm處切成0.5 cm的小段；取藜麥莖稈中間部位將其切成0.5 cm的小段；沿葉片主脈處切取0.5 cm×0.5 cm的小片；標(biāo)準(zhǔn)固定液(Formalin-acetic acid-alcohol, FAA)固定，按照固定—脫水—透明—浸蠟—包埋—切片(厚8 μm)—貼片—烘干—染色(番紅-固綠雙重染色)—封片的步驟進(jìn)行，采用RM2235切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)切片，SA3300 PL生物顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)觀察、拍照。每個(gè)處理重復(fù)10次，每張樣片選取5個(gè)視野。

生理指標(biāo)的測(cè)定：脯氨酸含量的測(cè)定采用酸性茚三酮法[17]；吡咯啉-5-羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)活性測(cè)定采用鹽酸羥胺比色法[18]；脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，PDH)活性測(cè)定參照趙福庚等[19]的方法。POD活性測(cè)定參照Shi等[20]的方法；SOD活性測(cè)定參照Huang等[21]的方法；CAT活性測(cè)定參照Abei[22]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)和作圖，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析法(one-way ANOVA) 和LSD法進(jìn)行不同處理間的方差分析和多重比較 (α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥幼苗根、莖、葉組織結(jié)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

圖1 不同田間持水量下藜麥幼苗根組織結(jié)構(gòu)的變化

2.1.1 根組織結(jié)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng) 由圖1可知，田間持水量為100%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，根直徑、根韌皮部厚度和根木質(zhì)部厚度均呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。與100%田間持水量相比，除0 h外，同一處理時(shí)間下，隨著田間持水量的降低，根直徑與根表皮厚度總體呈逐漸增加趨勢(shì)，最大分別增加了9.1%和64.9%；根韌皮部厚度和根木質(zhì)部厚度則呈降低趨勢(shì)，兩指標(biāo)最低可降低26.3%和30.3%。在50%和25%田間持水量條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，根直徑與根表皮厚度均呈逐漸增加趨勢(shì)；根韌皮部厚度與根木質(zhì)部厚度則呈先下降后上升的趨勢(shì)?？梢?，藜麥根系在一定干旱脅迫下會(huì)變粗，并通過表皮變厚來防止脫水。

2.1.2 莖組織結(jié)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng) 由圖2可知，在田間持水量為100%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，莖直徑、莖表皮厚度、莖木質(zhì)部厚度、莖髓腔直徑總體均呈增加趨勢(shì)；而當(dāng)田間持水量為50%和25%時(shí)，則呈下降趨勢(shì)。在同一處理時(shí)間下，隨著田間持水量的下降，各指標(biāo)均呈逐漸下降趨勢(shì)，其中，田間持水量為25%處理96 h后，各指標(biāo)值最低，與100%田間持水量處理96 h相比，莖直徑、莖表皮厚度、莖韌皮部厚度、莖木質(zhì)部厚度、莖髓腔直徑分別下降了27.2%、50.0%、38.6%、48.5%、55.6%?？梢?，一定程度的干旱脅迫影響了藜麥幼苗莖組織的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.1.3 葉片組織結(jié)構(gòu)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng) 由表1可知，田間持水量為100%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片厚度、上表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度均呈逐漸上升趨勢(shì)；當(dāng)田間持水量為50%和25%時(shí)，各指標(biāo)則呈下降趨勢(shì)。同一處理時(shí)間下，隨著田間持水量的降低，各指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)，且25%田間持水量處理96 h作各指標(biāo)值最低，與100%田間持水量處理96 h相比，各指標(biāo)分別降低了56.9%、57.2%、61.6%、59.5%、50.8%?？梢?，干旱脅迫程度的加深和處理時(shí)間的延長(zhǎng)均會(huì)使葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸受損。

由圖3可知，田間持水量為100%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥幼苗葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)仍保持完整，層次結(jié)構(gòu)較清晰，排列整齊；當(dāng)田間持水量為50%和25%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片結(jié)構(gòu)破損逐漸加重，其中，25%田間持水量處理96 h后葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)破損最嚴(yán)重。同一處理時(shí)間下，田間持水量為50%時(shí)，葉片結(jié)構(gòu)還相對(duì)較完整，葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損不大，而當(dāng)田間持水量降低至25%時(shí)，葉片結(jié)構(gòu)損傷加重，尤以處理96 h后，葉片結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，葉片的下表層細(xì)胞與海綿組織細(xì)胞破損較多。可見，藜麥葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)在適度干旱脅迫下還可保持較完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但嚴(yán)重的干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致葉片結(jié)構(gòu)受損。

2.2 干旱脅迫對(duì)藜麥幼苗脯氨酸含量及脯氨酸代謝酶活性的影響

由表2可知，田間持水量為100%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，根、莖、葉組織中脯氨酸含量、P5CS活性呈上升趨勢(shì)，PDH活性呈逐漸降低趨勢(shì)；當(dāng)田間持水量為50%和25%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，根、莖、葉中脯氨酸含量及P5CS活性以及葉和莖中的PDH活性與田間持水量為100%時(shí)趨勢(shì)一致，但變化幅度明顯增加，根中PHD活性在田間持水量為50%時(shí)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸上升趨勢(shì)，而在田間持水量為25%時(shí)，PDH活性呈先增后降的趨勢(shì)。同一處理時(shí)間下，隨著田間持水量的下降，根、莖、葉中脯氨酸含量和P5CS活性總體顯著增加，PDH活性則在各組織中表現(xiàn)不同，葉和莖中呈逐漸下降趨勢(shì)，而根中PDH活性在處理48 h隨著田間持水量的下降表現(xiàn)為逐漸上升趨勢(shì)，96 h后則呈先升后降的趨勢(shì)?？梢娹见溣酌绮煌M織在干旱脅迫下脯氨酸代謝相關(guān)酶活性表現(xiàn)不同。

圖2 不同田間持水量下藜麥幼苗莖組織結(jié)構(gòu)的變化

表1 不同田間持水量下葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

注：a～c：100%田間持水量處理0、48、96 h；d～f：50%田間持水量處理0、48、96 h；g～i：25%田間持水量處理0、48、96 h；up：上表皮；le：下表皮；lp：柵欄組織；ls：海綿組織。

表2 不同田間持水量下藜麥幼苗不同組織脯氨酸含量、P5CS活性、PDH活性變化

2.3 干旱脅迫對(duì)藜麥幼苗不同組織抗逆性酶活性的影響

由表3可知，各田間持水量根中SOD、POD和CAT活性均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)田間持水量為100%和50%時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉中3種酶活性呈逐漸上升趨勢(shì)，莖中SOD和POD活性與葉中趨勢(shì)相同，而莖中CAT活性僅在田間持水量50%時(shí)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)田間持水量為25%時(shí)，莖和葉3種酶活性則表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。處理48 h后，隨著田間持水量的下降，不同組織中SOD、POD和CAT活性均呈上升趨勢(shì)；處理96 h后，根中3種酶活性仍呈逐漸增加趨勢(shì)，而葉和莖中3種酶活性則隨著田間持水量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。

表3 不同田間持水量下藜麥幼苗不同組織SOD、POD、CAT活性變化

3 討論

干旱脅迫可影響植物形態(tài)特征和生理特性，從而導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢及產(chǎn)量降低[12,23]。已有研究表明，植物各器官組織對(duì)干旱脅迫的反應(yīng)不同[24-26]。本研究結(jié)果表明，藜麥幼苗根、莖、葉對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)也有所不同，其中藜麥的根直徑和表皮厚度隨著田間持水量的降低反而增加，這可能因?yàn)楦桥c土壤直接接觸的器官，是接收土壤水分虧缺信號(hào)的首要部位，藜麥抵御干旱首先會(huì)通過增加根粗來體現(xiàn)，這與前人的研究較為一致[27]；由于藜麥根對(duì)干旱脅迫的抵御，莖和葉在一定程度的干旱脅迫下仍能保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，但隨著干旱程度的不斷加深和持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥莖稈輸送水分能力降低，從而使葉片缺水嚴(yán)重，葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)最終遭到破壞，表明藜麥雖可以抵御一定程度的干旱，但嚴(yán)重的水分虧缺仍會(huì)影響其生長(zhǎng)發(fā)育。

干旱脅迫下，植物除形態(tài)結(jié)構(gòu)改變外，也會(huì)通過一系列的分子和生理生化機(jī)制來減輕干旱帶來的危害。脯氨酸作為膜穩(wěn)定的滲透保護(hù)劑，是在脅迫條件下維持細(xì)胞水分含量的重要有機(jī)溶質(zhì)之一。大量研究已表明，干旱脅迫下植物體內(nèi)脯氨酸含量會(huì)大量增加[28-29]。本研究結(jié)果表明，隨著田間持水量的降低和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥幼苗根、莖、葉中的脯氨酸含量均呈增加趨勢(shì)，其中，由于葉片對(duì)水分虧缺最為敏感，也是虧缺最嚴(yán)重的組織，其脯氨酸的積累量最高，其次是莖和根，這與前人報(bào)道的藜麥幼苗葉片脯氨酸含量在干旱脅迫下會(huì)大量增加的結(jié)果較為一致[30]。前人研究認(rèn)為，在干旱脅迫下脯氨酸的合成和分解主要由吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和脯氨酸脫氫酶(PDH)參與進(jìn)行[31]。P5CS是脯氨酸合成的限速酶，在鹽脅迫或脫水條件下具有重要的滲透調(diào)節(jié)作用[32]。由本研究結(jié)果可知，干旱脅迫下根、莖、葉中P5CS活性均提高，從而導(dǎo)致大量脯氨酸的合成，但在葉中25%田間持水量條件下處理96 h后，由于葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)被逐漸破壞，P5CS活性也較50%田間持水量處理有所降低；而莖和根受損程度小于葉，因此這兩種組織中P5CS仍能在嚴(yán)重的干旱脅迫下(25%田間持水量)維持較高的活性；PDH活性則表現(xiàn)為在根中高活力而在葉和莖中被抑制，表明干旱下藜麥幼苗脯氨酸代謝具有組織特異性，根中PDH的高活性可能也是藜麥幼苗抵御干旱的一種機(jī)制。

植物細(xì)胞在脅迫下會(huì)激活抗氧化防御系統(tǒng)來抵御干旱，在這一體系中，抗氧化酶如SOD、POD、CAT是最活躍、最有效的抗氧化應(yīng)激保護(hù)機(jī)制[33]。隨著田間持水量的降低及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥根、莖、葉中SOD、POD和CAT活性逐漸增加，這與早期在不同作物中報(bào)道的結(jié)果較為一致[34-36]；此外，根中3種酶的穩(wěn)定性高于莖和葉，這可能是因?yàn)橹参锏乃种饕獊碓从诟担淠褪芰Ω哂谇o和葉的緣故。

4 結(jié)論

藜麥幼苗根、莖、葉3種組織解剖結(jié)構(gòu)對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)不同。藜麥幼苗可通過增加根粗及根表皮厚度來抵御一定的干旱；干旱脅迫下藜麥幼苗3種組織中脯氨酸含量及P5CS活性均會(huì)提高，且葉中脯氨酸積累量高于莖和根，而PDH活性則在根中較高，在葉和莖中被抑制；此外，干旱脅迫下藜麥幼苗3種組織中抗氧化酶活性的提高也進(jìn)一步增強(qiáng)了其抗旱性。本研究結(jié)果表明，藜麥幼苗可抵御田間持水量為50%時(shí)的干旱脅迫，該結(jié)果可為藜麥的栽培種植提供理論借鑒。