桃PpNAC19的克隆及其對PpCCD4啟動子活性的調(diào)節(jié)分析

秦 娟 余 凡 劉 璐 朱婷婷 陳 偉 曹士鋒 楊震峰 施麗愉,*

(1 浙江萬里學院，浙江 寧波 315100；2 上海海洋大學，上海 201306)

類胡蘿卜素是大量存在于黃色、橙色和紅色果實中的萜類色素物質(zhì)，其含量和組成直接決定了果實外觀色澤和商品性[1]。果實中類胡蘿卜素具有重要的保健及經(jīng)濟價值，不僅可為人類提供膳食維生素A，而且在清除自由基、提高免疫力、預防心血管疾病和防癌等保護人類健康方面起重要作用[2-3]。近年來，隨著人們對營養(yǎng)健康關注度的提高，果蔬的營養(yǎng)價值被進一步挖掘，尤其對類胡蘿卜素的研究逐漸深入。目前，深入揭示果實中類胡蘿卜素的形成與調(diào)控已成為國內(nèi)外研究的熱點。

NAC家族轉(zhuǎn)錄因子是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類植物特有轉(zhuǎn)錄因子[4]，其命名來源于矮牽牛NAM(noapicalmeristem)基因、擬南芥ATAF1/2和CUC2(cup-shapedcotyledon)基因的首字母縮寫[5]。NAC家族編碼蛋白的N端含有一段高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域，是NAC的功能結(jié)構(gòu)域，其C端高度變異，為轉(zhuǎn)錄激活域[6]。研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學功能，在植物生長發(fā)育[7]、逆境脅迫應答[8]、成熟衰老[9]和激素信號轉(zhuǎn)導[10]等過程中扮演著重要角色。值得注意的是，在模式植物番茄(Solanumlycopersicum)中的研究發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子能參與果實類胡蘿卜素積累的調(diào)控。在番茄果實中已發(fā)現(xiàn)了4個NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實類胡蘿卜素的積累，即SlNAC1、SlNAC4、SlNAC19(SNAC9)和SlNAC48(SNAC4)；其中，SlNAC1在未成熟的綠果期大量表達[11]，其通過抑制番茄果實中SlPSY1表達，負調(diào)控果實類胡蘿卜素的積累[12-13]。相反，SlNAC4、SlNAC19和SlNAC48都是果實類胡蘿卜素合成的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，它們的沉默表達均降低了SlPSY1表達量，減少了總類胡蘿卜素的積累[14-15]。

桃(Prunuspersica)是我國重要特色水果，根據(jù)成熟果實果肉色澤，可將桃果實分成白肉、黃肉和紅肉桃3類。其中，黃肉桃果實是很好的類胡蘿卜素源，而白肉桃果實幾乎不含類胡蘿卜素[16]。Cao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與黃肉桃品種金麗果實相比，白肉桃品種湖景果實中類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因PpCCD4的高表達是該果實幾乎不含類胡蘿卜素的重要原因之一。Bai等[18]通過基因沉默技術將白肉桃中PpCCD4基因敲除，結(jié)果顯示白肉桃被注射部分出現(xiàn)黃色素沉著及類胡蘿卜素含量的增加。由此可見，PpCCD4基因是造成黃肉桃和白肉桃果實色澤差異的關鍵因子。以往對黃肉桃果實類胡蘿卜素的研究大多集中在類胡蘿卜素的種類、含量等變化規(guī)律，鮮見黃肉桃果實類胡蘿卜素積累的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究?；诖耍狙芯吭谇捌诶肗CBI-BLAST工具從桃中獲得了1個與番茄SINAC19高度同源的NAC基因，將其命名為PpNAC19。本研究對PpNAC19進行克隆和生物信息學分析，通過實時熒光定量 PCR技術分析PpNAC19基因在不同桃組織和不同成熟期桃果實中的表達差異，同時檢測黃肉桃和白肉桃果實不同成熟時期總類胡蘿卜素含量變化以及PpCCD4基因表達差異，并利用雙熒光素酶試驗分析PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子對PpCCD4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，旨在為揭示桃果實類胡蘿卜素積累調(diào)控機制奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料黃肉桃品種金麗和白肉桃品種湖景均由浙江省奉化市水蜜桃研究所提供。分別采集花、葉、芽、軟核期果實(盛花后35～45 d)和硬核期果實(盛花后55～65 d)；同時采集S1期(盛花后90～100 d)、S2期(盛花后100～110 d)、S3期(盛花后110～120 d)、S4期(盛花后120～130 d)和S5期(盛花后130～150 d)5個不同成熟時期果實。樣品采集后1 h內(nèi)運回實驗室，立即用液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 桃總RNA提取及cDNA合成 桃5種組織(花、葉、芽、軟核期果實和硬核期果實)和5個成熟時期果實(S1、S2、S3、S4和S5期)總RNA的提取采用植物RNA提取試劑盒(Omega，美國)。然后，以提取的總RNA為模板，根據(jù)SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)合成反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈。

1.2.2PpNAC19的克隆 根據(jù)從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找獲得的桃PpNAC19基因序列，利用Primer Premier 5.0設計開放閱讀框(open reading frame, ORF)擴增引物(表1)。以桃果實cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為ddH2O 29 μL、5×SF buffer 10 μL、dNTP Mix 1 μL、cDNA模板5 μL、正反向引物各2 μL、phanta Super-Fidelity DNA Polynerase 1 μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性8 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min 20 s,30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后與PMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆送上海華大基因測序。

1.2.3 實時熒光定量PCR 利用Beacon Designer 7軟件設計PpNAC19和PpCCD4基因特異性擴增引物，見表1。根據(jù)美國賽默飛世爾公司的DyNAmo Flash SYBR Green qPCR試劑盒，以反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板，反應體系為2×Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。采用CFX96 Touch Real-Time PCR系統(tǒng)進行三步法擴增。程序設置如下：95℃初始變性7 min，95℃保持15 s，進行39個循環(huán)，45～60℃退火30 s，75℃保持15 s。以PpTEF2作為內(nèi)參基因，進行3次生物學重復，最終結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進行分析。利用IBM SPSS Statistics 21軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

表1 引物序列

1.2.4 桃總類胡蘿卜素含量的測定 參考梁敏華[19]的方法，略作修改。取10 mL無水乙醇(含0.1%抗壞血酸)加入50 mL離心管中，置于冰上預冷30 min,加入2 g液氮研磨粉末樣品，渦旋40 s，置于-20℃下避光浸提10 h。加入550 μL 80%氫氧化鉀溶液,渦旋30 s，置于95℃恒溫水浴鍋中避光皂化45 min。取5 mL預冷去離子水加入皂化液，立刻置冰浴冷卻。加入5 mL石油醚(60～90℃)，渦旋30 s萃取皂化液，6 000×g離心10 min，取上清液。重復萃取4次，合并上清液。氮吹去除上清液中的石油醚，再加入3 mL體積比為1∶1 的二氯甲烷、甲醇混合液溶解。取1 mL溶解液，用上述二氯甲烷、甲醇混合液定容至10 mL，混勻，用UV-1900紫外可見分光光度計(日本島津)測定其在450 nm波長下的吸光度，用二氯甲烷、甲醇(1∶1)混合液作為空白液對儀器進行空白調(diào)零，代入公式(1)得出總類胡蘿卜素含量：

ρ=A450×v×f×10×1 000×m-1×2 500-1

(1)

式中，ρ：樣品中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，μg·g-1；A450：類胡蘿卜素萃取液在450 nm下的吸光值；v：類胡蘿卜素萃取液體積，mL(即3 mL)；f：測定時類胡蘿卜素萃取液的稀釋倍數(shù)(即10倍)；m：樣品質(zhì)量，g； 2 500∶1% 類胡蘿卜素在最大吸收波長時的平均吸光值。

1.2.5PpNAC19的生物信息學分析 利用NCBI網(wǎng)站中的CD-search工具鑒定PpNAC19基因序列的保守結(jié)構(gòu)域。利用NCBI-BLAST搜索與PpNAC19基因同源性較高的基因，再結(jié)合GeneDoc和ClustalW2軟件將PpNAC19基因與同源基因進行氨基酸序列比對分析。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析氨基酸序列、蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成、理論等電點、脂溶指數(shù)、親水系數(shù)。利用在線工具Cell-PLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行蛋白質(zhì)的亞細胞定位分析。利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；利用Swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。利用MEGA 7.0軟件中鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展值(bootstrap)設為1 000。

1.2.6 LUC/REN雙熒光素酶試驗 利用高保真酶Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，南京)和ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒(Vazyme，南京)將PpNAC19基因ORF序列插入到pGreenII 62-SK載體的BamHI和HindIII酶切位點區(qū)域，將PpCCD4基因啟動子序列插入到pGreenII 0800-LUC載體的BamHI和NcoⅠ酶切位點區(qū)域，擴增引物見表1。利用電擊法將構(gòu)建好的PpNAC19-62-SK和PpCCD4-0800-LUC重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，通過菌液PCR法檢測得到陽性轉(zhuǎn)化菌株。挑取單菌落接種于5 mL含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基，28℃、220 r·min-1活化12 h。取適量活化菌接種于50 mL含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)12 h至OD600為1.0～2.0，4 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。用滅菌水洗菌后，加侵染液(10 mmol·L-12-嗎啉乙磺酸，10 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH值5.6)調(diào)節(jié)菌液OD600約為0.25，置于室溫避光3 h。將PpNAC19-62-SK和PpCCD4-0800-LUC菌液按8∶1(v∶v)比例混合，用1 mL注射器將其注射到煙草葉片背面下表皮內(nèi)，置于人工氣候箱中培養(yǎng)3 d。采用雙熒光素酶報告分析試劑盒(Dual-Luciferase? Reporter Assay System)(Promega，美國)和Luminoskan Ascent化學發(fā)光分析儀(Thermo，美國) 測定葉片侵染區(qū)中螢火蟲光素酶與海腎光素酶催化產(chǎn)生的熒光信號(LUC和REN)比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpNAC19基因序列與蛋白特征分析

以桃果實cDNA為模板進行PCR擴增，得到一段約900 bp的片段。測序結(jié)果表明，該片段長度為867 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫中查找獲得的桃序列(XP_007223324.1)完全吻合，BLAST結(jié)果(圖1)顯示，該片段含有一個NAM結(jié)構(gòu)域，從N端第10～第134氨基酸，為NAC轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域。

PpNAC19基因編碼288個氨基酸，預測蛋白質(zhì)分子量為33.2 kDa，等電點為7.01，不穩(wěn)定系數(shù)為39.34，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白的平均疏水系數(shù)為-0.719， 屬于親水性蛋白。利用在線工具Cell-PLoc對蛋白進行亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，PpNAC19蛋白定位在細胞核的可能性最大。對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占71.53%，延伸鏈和α-螺旋結(jié)構(gòu)各占14.24%，與蛋白三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果基本一致。

圖1 PpNAC19蛋白中NAM結(jié)構(gòu)域分析

2.2 PpNAC19蛋白的同源比對與聚類分析

對桃PpNAC19基因的ORF序列進行NCBI-BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列與其他植物NAC蛋白有一定的相似性，其與巴旦杏(Prunusdulcis，VVA20514.1) 的氨基酸序列同源性最高，達到99.65%，其次為梅(Prunusmume，XP_008221592.1)，同源性為98.61%。通過與其他9種植物序列進行多重比較分析，結(jié)果(圖2)表明，PpNAC19蛋白與其他物種NAC在N端高度相似，都存在5個保守的NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域(A～E)，而C端差異較大，是高度變異和具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控區(qū)。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明PpNAC19與巴旦杏(Prunusdulcis，VVA20514.1)聚類于同一分支(圖3)，親緣性較好。

注：圖中字母表示NAC結(jié)構(gòu)域中5個亞結(jié)構(gòu)域A～E。

圖3 桃PpNAC19蛋白與其他植物NAC蛋白的聚類分析

2.3 PpNAC19基因表達分析

對不同桃組織(花、芽、葉、軟核期果實和硬核期果實)中PpNAC19的表達量進行分析，結(jié)果表明(圖4-A)，PpNAC19在黃肉桃金麗和白肉桃湖景的所有組織中均有表達，并且在2個品種桃的不同組織中表達趨勢一致，即都在硬核期果實中表達水平最高，其次為花和軟核期果實，在芽中表達量最低，對2種桃進行比較發(fā)現(xiàn)，PpNAC19在金麗硬核期果實中表達量顯著低于湖景(P<0.05)，而在2種桃的花、芽、葉和軟核期果實中表達量無顯著差異(P>0.05)。

由圖4-B可知，在金麗和湖景果實成熟過程中PpNAC19基因表達量都呈先上升后下降的趨勢，在果實成熟后期(S3～S5)金麗中PpNAC19表達量顯著高于湖景果實(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示在 0.05 水平差異顯著。下同。

2.4 桃果實成熟過程中總類胡蘿卜素含量分析

由圖5可知，在桃果實成熟過程中，金麗果實中總類胡蘿卜素含量逐漸上升，并且顯著高于湖景果實(P<0.05)，湖景果實中總類胡蘿卜素含量在各成熟時期無顯著變化(P>0.05)。

圖5 不同成熟度果實中總類胡蘿卜素含量變化

2.5 桃果實成熟過程中類胡蘿卜素代謝基因PpCCD4表達分析

由圖6可知，在桃果實成熟過程中，PpCCD4基因表達量在白肉桃湖景中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在黃肉桃金麗果實中其表達量并無顯著變化(P>0.05)，但黃肉桃中該基因的表達量顯著低于白肉桃(P<0.05)。

圖6 不同成熟度果實中類胡蘿卜素代謝基因PpCCD4的表達

2.6 PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子對PpCCD4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性

利用同源重組方法，將PpNAC19基因ORF序列插入pGreenII 62-SK構(gòu)建Effector重組載體，將PpCCD4基因啟動子序列插入pGreenII 0800-LUC構(gòu)建Reporter重組載體(圖7-A)。LUC/REN雙熒光素酶試驗結(jié)果如圖7-B所示，與陰性對照相比，當PpNAC19與PpCCD4基因啟動子共同轉(zhuǎn)化煙草時，螢火蟲光素酶與海腎光素酶催化產(chǎn)生的熒光信號(LUC和REN)比值極顯著降低(P<0.001)，說明PpNAC19能夠轉(zhuǎn)錄抑制PpCCD4啟動子活性，從而抑制PpCCD4基因表達。

注：A:載體構(gòu)建； B:將報告基因與效應基因共轉(zhuǎn)化煙草，LUC與REN比值作為最終的轉(zhuǎn)錄激活活性；*** 表示差異極顯著(P<0.001)。

3 討論

NAC是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其N端含有高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域，由150～160個氨基酸組成，包含了5個子結(jié)構(gòu)域(A～E)，A、C和D子結(jié)構(gòu)域高度保守，B和E子結(jié)構(gòu)域保守性不強[20]。NAC蛋白C端是轉(zhuǎn)錄激活域，特異性較高，富含絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸和蘇氨酸等[21]。本試驗從桃果實中克隆獲得了PpNAC19基因，將其編碼的氨基酸序列與其他物種NAC進行比對，發(fā)現(xiàn)其與巴旦杏、梅和櫻花等植物高度同源。對PpNAC19蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為親水性蛋白，與大多數(shù)植物中NAC蛋白相似[22]。亞細胞定位預測表明，PpNAC19定位于細胞核，屬于典型的核蛋白，表明PpNAC19基因可能在細胞核中發(fā)揮重要功能。另外，該蛋白N端含有一個NAM結(jié)構(gòu)域，C端富含絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和谷氨酸等。其二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主，這與大多數(shù)NAC蛋白二級結(jié)構(gòu)相似。以上結(jié)果表明PpNAC19是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族之一，但同一轉(zhuǎn)錄因子在不同物種中的功能可能存在差異。

大量研究發(fā)現(xiàn)NAC轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學功能，參與植物細胞分裂[23]、種胚發(fā)育[24]、花的形成[25]、果實的成熟與衰老[26]等過程，并且在植物抗逆境脅迫應答中有一定的功能[27]。本研究中桃的花、芽、葉、果實等組織中均檢測到PpNAC19基因不同程度地表達，表明PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子可能參與了桃的各個生長發(fā)育過程。周暉[28]研究發(fā)現(xiàn)桃NAC基因能夠激活MYB基因轉(zhuǎn)錄從而促進桃果實花青苷著色，而本研究中PpNAC19基因在桃花組織中高表達說明PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控桃花中花色苷的積累。番茄果實的成熟和發(fā)育過程由多個NAC轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控，并且這些NAC基因表達量都在果實成熟后期(成熟期和完熟期)達到峰值[15]。姚丹等[29]報道果梅果實中存在12個NAC基因大量表達。本研究中PpNAC19在果實期表達量較高，并且硬核期果實中PpNAC19表達顯著高于軟核期果實，這說明PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子可能參與桃果實的成熟與發(fā)育過程。

Kou等[15]研究發(fā)現(xiàn)SlNAC19是促進番茄果實類胡蘿卜素積累的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，SlNAC19基因在果實成熟期間的表達趨勢與類胡蘿卜素的積累相一致。本研究前期從桃中克隆的PpNAC19基因與番茄SlNAC19基因序列相似度高達69.01%；并且PpNAC19在黃肉桃金麗果實成熟后期表達量顯著高于白肉桃湖景果實，這與該期間金麗果實中類胡蘿卜素含量顯著高于湖景果實相一致，這些結(jié)果表明PpNAC19可能具有與SlNAC19類似的功能，即可能也對桃果實類胡蘿卜素的積累具有正調(diào)控作用。類胡蘿卜素裂解雙加氧酶CCDs作為催化類胡蘿卜素裂解的關鍵酶，在果實類胡蘿卜素的積累及果實顏色的形成中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同品種木瓜和柑橘果實的色澤差異分別與CCD1和CCD4 基因表達水平密切相關[30-31]。類似地，本研究中金麗比湖景果實含有更高的類胡蘿卜素含量主要與PpCCD4基因在湖景果實中高表達有關，這與Cao等[17]的研究結(jié)果相同。Bai等[18]利用病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技術直接證明了抑制PpCCD4基因表達可以提高桃果實類胡蘿卜素的含量。而本研究通過LUC/REN雙熒光素酶試驗發(fā)現(xiàn)PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子對PpCCD4啟動子具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。因此推測PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子可能通過抑制PpCCD4啟動子活性進而影響其表達，并與其他類胡蘿卜素代謝相關基因共同參與調(diào)控桃果實類胡蘿卜素積累。但PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控桃果實類胡蘿卜素合成與積累的具體分子機制有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究在桃果實中克隆了NAC基因PpNAC19，開放閱讀框為867 bp，編碼288個氨基酸，含有一個NAM結(jié)構(gòu)域。生物信息學結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為33.2 kDa，等電點為7.01，為穩(wěn)定蛋白，且具有親水性。PpNAC19與巴旦杏(Prunusdulcis，VVA20514.1)的氨基酸序列相似率最高。通過分析PpNAC19基因在桃果實成熟過程中時空表達、類胡蘿卜素代謝相關基因PpCCD4表達，以及PpNAC19對PpCCD4基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，推測該基因可能通過抑制PpCCD4表達參與桃果實類胡蘿卜素積累的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究為進一步探究PpNAC19轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類胡蘿卜素合成與積累的分子機制提供了理論依據(jù)。