松材線蟲谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Sigma1基因(BxGSTs1)克隆及表達分析

王步勇，問榮榮，李秀偉，馬 玲

（1.菏澤學(xué)院，山東 菏澤 274015；2.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

松材線蟲（Bursaphelechus xylophilus，Nikle）是目前世界上最具危險性的森林病原之一，引起的松材萎蔫病，導(dǎo)致松林毀滅性死亡，給亞洲、歐洲和美洲等國家和地區(qū)造成了巨大經(jīng)濟損失和生態(tài)破壞[1-4]。自1982年首次在南京發(fā)現(xiàn)以來[2]，該病情在我國迅速蔓延至江蘇、浙江、安徽、廣東、山東、湖南、重慶、湖北和陜西等省市。目前，該病的防治仍以化學(xué)防治為主，包括溴甲烷熏蒸、克線磷埋土、甲維鹽注干防治等[5]。但化學(xué)防治易引起嚴重的“3R”問題，誤殺非靶標(biāo)生物、增加線蟲抗藥性、污染土壤環(huán)境等，破壞了森林生態(tài)平衡，危害人類健康[6-7]。因此，尋求高效、安全、無污染的防治措施迫在眉睫。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的基因工程技術(shù)被廣泛應(yīng)用到線蟲防治研究中[8-9]。研究與線蟲侵染寄生、耐藥解毒、免疫防御等相關(guān)基因功能，利用分子生物技術(shù)安全有效地防治線蟲成為線蟲研究的熱點。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases,GSTs，EC 2.5.1.18）是一類廣泛存在于動植物、鳥類、昆蟲、線蟲及微生物體內(nèi)的多功能同工催化酶，具有解毒和抗氧化功能[10-11]。它可以催化機體內(nèi)還原型谷胱甘肽與內(nèi)外源性有毒物質(zhì)發(fā)生親電子團偶聯(lián)反應(yīng)，增加有毒物質(zhì)疏水性使其易于排出體外，降低機體遭受的損害，從而達到解毒作用[12]。GSTs 酶家族分為微粒體型、線粒體型和胞質(zhì)型3 類，通常所指的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶為胞質(zhì)型GSTs[13]。根據(jù)氨基酸同源性及底物特異性，胞質(zhì)型GSTs 又分為Alpha（GSTA），KaPPa（GSTK），Mu（GSTM），Pi（GSTP），Sigma（GSTS），Theta（GSTT），Zeta（GSTZ）和Omega（GSTO）8 類[14]。作為生物體內(nèi)一類重要的II 期二聚體酶，GSTs 家族中許多基因被證實參與了動植物、真菌、昆蟲的機體解毒機制、抗氧化應(yīng)激等[15-17]。隨著研究的深入，對線蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的報道越來越多。Hasegawa 等[18]發(fā)現(xiàn)適量異硫氰酸烯丙酯誘導(dǎo)模式線蟲GST 表達，可使線蟲產(chǎn)生氧化應(yīng)激抗性。李海燕等[19]發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲過量表達GST 酶應(yīng)激類黃酮脅迫。GSTs 在線蟲的解毒耐藥、氧化應(yīng)激、免疫防御等過程發(fā)揮了重要作用。

基于課題組前期松材線蟲的轉(zhuǎn)錄組分析，本論文利用Blast 比對松材線蟲基因庫，鑒定得到模式線蟲GST的同源基因，鑒定屬于GST Sigma類，故命名BxGSTs1。結(jié)合RT-PCR 技術(shù)克隆獲得BxGSTs1基因CDS 全長序列。利用生物信息學(xué)進行基因特性分析，原位雜交試驗進行基因組織表達定位分析，利用qPCR 試驗定量分析BxGSTs1基因在藥劑脅迫時的表達水平，利用RNAi 技術(shù)及后續(xù)藥劑處理試驗，深入分析BxGSTs1基因的具體功能。通過對BxGSTs1基因特性及功能的具體分析，為研究松材線蟲GSTs 家族基因功能奠定基礎(chǔ)，也為尋找潛在靶標(biāo)基因，利用生物技術(shù)防治線蟲病提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲及藥劑

試驗所需松材線蟲由中國林業(yè)科學(xué)院濕地研究所提供，灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）由東北林業(yè)大學(xué)森林病蟲害生物學(xué)實驗室提供。試驗線蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后接種到灰葡萄孢菌PDA 上，于25℃黑暗培養(yǎng)擴繁7～9 d。貝曼漏斗法收集新鮮松材線蟲（混合蟲態(tài)100 μL），經(jīng)M9 緩沖液清洗后，于液氮中速凍，-80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。藥劑魚藤酮（rotenone，95%）及鹽酸左旋咪唑（levamisole hydrochloride，98%）均購買于德國Sigma 公司，ddH2O 購買于大連TaKara 生物公司。

1.2 RNA 提取及cDNA 合成

將收集備用的松材線蟲蟲樣，用研磨棒于液氮中研至粉末狀。采用Invitrogen TRIzol Reagent試劑盒，根據(jù)試劑盒操作要求提取松材線蟲混合蟲齡的總RNA[20]。經(jīng)DNase I 消化后，紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測線蟲總RNA 質(zhì)量。取3 μL 的線蟲總RNA 樣為模板，用TaKara PrimeScript ? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒操作要求進行第一鏈cDNA合成，合成的cDNA 稀釋10 倍，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因克隆與序列分析

基于前期松材線蟲轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，以模式線蟲GST基因序列（NM_062481.7）為檢索序列，Blast 比對松材線蟲全基因組數(shù)據(jù)庫[21]，鑒定得到模式線蟲GST基因的同源序列，因?qū)儆贕ST Sigma 類基因，故命名為BxGSTs1。利用Primer 5.0 軟件設(shè)計覆蓋完整CDS 區(qū)的特異性引物BxGSTs1-F（5′-TCCTCATCGATGGAAAGCCG-3′）/BxGSTs1-R（5′-TGATCGTATCGGGTCGGTTC-3′）進行PCR 擴增，獲得BxGSTs1基因CDS 序列全長。上述PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。再連接至pGEM-T Easy Vector載體，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞，IPTG-X-Gal 涂板培養(yǎng)，隨機挑取陽性單菌落，送至上海生工測序。

利用NCBI ORF-Finder、ExPASy ProtParam、ProtScale、NetPhos 3.1 Server 等生物信息學(xué)分析網(wǎng)站，對編碼蛋白的氨基酸序列、開放閱讀框ORF、相對分子量、理論等電點、親疏水性、磷酸化位點等基因特性進行預(yù)測分析[22]。利用NCBI Conserved Domains 對編碼蛋白氨基酸序列的保守區(qū)域進行預(yù)測分析；利用NCBI BLASTP、DNAMAN、MEGA6.0 軟件，篩選同源蛋白序列，進行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析；用PredictProtein、SWISS-MODEL、Swiss-PdbViewer在線工具對編碼蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。

1.4 原位雜交ISH

選用德國Roche 公司的地高辛原位雜交試劑盒進行原位雜交試驗，定位分析BxGSTs1基因在松材線蟲組織中的表達部位。基于基因序列設(shè)計探針引物BxGSTs1-insF（5′-TCCCGAAAATCATCGGCCTT-3′）、BxGSTs1-insR（5′-TTCCTGACGTCGGTGAGATG-3′），按照試劑盒要求進行不對稱PCR，合成雜交探針。1.2%凝膠電泳檢測探針產(chǎn)物，-80℃冰箱備用。

原位雜交試驗的主要方法按照De Boer 等[23]描述，略加修改進行。具體雜交方法如下：貝曼漏斗法收集新鮮的混合蟲齡的松材線蟲20 μL，離心后收集于1.5 mL 的離心管中；待5%多聚甲醛溶液5℃固定處理16 h 后，室溫預(yù)處理4 h；用裂解液、蛋白酶K、丙酮等溶液，液氮冷凍裂解30 s，對線蟲進行通透化處理；用合成的雜交探針處理松材線蟲懸浮液，55℃黑暗處理16 h；離心處理停止顯色后，制作玻片標(biāo)本，Olympus 拍照檢測。

1.5 熒光定量qPCR

采用實時熒光定量qPCR，對松材線蟲BxGSTs1基因在藥劑魚藤酮及鹽酸左旋咪唑脅迫時的表達水平進行定量分析。根據(jù)前期生測結(jié)果，試驗選取1.35、2.60 μg/mL 魚藤酮藥劑處理松材線蟲12、24 h，ddH2O 處理作為對照組；選取2.50、3.50 μg/mL 鹽酸左旋咪唑藥劑處理松材線蟲12、24 h，ddH2O 處理作為對照組。采用TRIzol Reagent 試劑盒，提取ddH2O 和藥劑處理12、24 h后的松材線蟲總RNA，經(jīng)DNase I 消除DNA 后，PrimeScriptTMRT Kit 合成cDNA，-80℃冰箱儲存，備用qPCR 模板。

實時熒光定量qPCR 使用TOYOBO KOD SUBR qPCR Mix 試劑盒進行。Primer 5.0 軟件設(shè)計BxGSTs1定量引物BxGSTs1-qF（5′-AACCGATTCGTTGCCAGAGT-3′）、BxGSTs1-qR（5′-AATGCTTCTGAACTGCGGGA-3′），Actin基因為內(nèi)參基因。qPCR 反應(yīng)參照試劑盒使用說明書進行，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸45 s，40 個循環(huán)；95℃變性1 min，55℃延伸30 s，95℃變性30 s，進行溶解曲線反應(yīng)。每個樣重復(fù)3 次，用2-ΔΔCt法進行目的基因的相對表達分析[24]。

1.6 RNAi 沉默

RNAi 基因沉默技術(shù)研究BxGSTs1基因的具體功能。采用Promega 公司的T7 RiboMAXTM Express RNAi System 試劑盒進行dsRNA 合成。根據(jù)BxGSTs1基因序列信息，設(shè)計引物BxGSTs1-pF（5′-CCTTCTGAAGCCCAACGGAT-3′） 和BxGSTs1-T7R（5′-AGTAATACGACTCACTATAG GGATCTGACGTCGGTGAGATGCTT-3′），引 物BxGSTs1-pR（5′-CTGACGTCGGTGAGATGCTT-3′）和BxGSTs1-T7F（5′-GCTAATACGACTCACTAT AGGGATCCTTCTGAAGCCCAACGGAT-3′），分別進行正/反義鏈ssRNA 的PCR 合成。將上述ssRNA PCR 產(chǎn)物混合（1∶1），94℃解鏈處理10 min，冷卻至25℃退火合成dsRNA。紫外分光光度計及凝膠電泳檢測合成的dsRNA 質(zhì)量。

采用體外浸泡dsRNA 法[25]，對BxGSTs1基因進行RNAi 沉默處理。將松材線蟲幼蟲用DEPCH2O 清洗3 次，待離心后吸取10 μL 線蟲懸浮液浸泡至30 μL 的dsRNA 溶液（終濃度為2.0 μg/μL）中。移液槍輕輕混勻后，置于25℃搖床上200 r/min浸泡12 h，采用qPCR 試驗檢測松材線蟲BxGSTs1基因的表達情況。同等數(shù)量的線蟲浸泡至30 μL ddH2O 中做對照組。每組試驗進行3 次重復(fù)。ddH2O 洗蟲3 次，進行顯微觀察及后續(xù)藥劑處理試驗。

采用24 孔板浸泡法[26]，對dsRNA 處理后的線蟲進行藥劑處理試驗，具體處理如下：隨機挑選50 條dsRNA 處理的松材線蟲作為處理組線蟲，挑選50 條ddH2O 處理的松材線蟲作為對照組線蟲。根據(jù)前期生測結(jié)果，選取2.60 μg/mL 魚藤酮、3.50 μg/mL 鹽酸左旋咪唑藥劑處理線蟲12 h。每組試驗重復(fù)3 次。通過觀察計數(shù)，統(tǒng)計線蟲死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BxGSTs1 基因克隆及特性分析

采用TRIzol 提取松材線蟲總RNA，經(jīng)分光光度計及凝膠電泳檢測，總RNA 質(zhì)量均符合標(biāo)準(zhǔn)。凝膠電泳檢測cDNA 樣品呈彌散帶，滿足試驗要求。通過松材線蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及PCR 擴增試驗獲得1 條GST基因（圖1）。該基因CDS區(qū)全長468 bp，Blast 比對分析其屬于GST Sigma（GSTs）亞家族，故命名為BxGSTs1（NCBI 登錄號：MK714354）。經(jīng)ORF 分析BxGSTs1編碼155 個氨基酸（圖2）。

圖1 凝膠電泳圖像Fig.1 Agarose gel electrophoresis

圖2 松材線蟲BxGSTs1 基因CDS 全長及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of BxGSTs1 gene from B.xylophilus

ExPASy ProtParam 預(yù)測BxGSTs1 蛋白分子式為C813H1228N202O230S3，相對分子質(zhì)量17.608 kD，理論等電點為5.89，不穩(wěn)定系數(shù)為36.51，屬于穩(wěn)定性蛋白。ProtScale 預(yù)測BxGSTs1 蛋白平均疏水指數(shù)為-0.262，屬于親水性蛋白。SignalP 4.1 顯示蛋白無信號肽存在。NetPhos 3.1 Server 磷酸化位點分析顯示，BxGSTs1 蛋白含有3 個絲氨酸磷酸化位點、2 個蘇氨酸磷酸化位點、6 個絡(luò)氨酸磷酸化位點。NCBI CDD 進行蛋白保守區(qū)域預(yù)測分析（圖3），該蛋白含有N 端保守結(jié)構(gòu)域“GST_N”和C 端保守結(jié)構(gòu)域“GST_C_Sigma_like”，屬于類硫氧還原蛋白超家族（Thioredoxin_like Superfamily）及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶超家族（GST_C_family Superfamily）。

2.2 多序列比對及系統(tǒng)進化分析

NCBI BLASTP 比對分析松材線蟲BxGSTs1蛋白，篩選出9 個GST 同源蛋白序列，利用DNAMAN 軟件進行多序列比對。比對結(jié)果顯示，松材線蟲BxGSTs1 蛋白的氨基酸序列與其他9 個GST 同源蛋白序列的相似性性介于30%～37%。BxGSTs1 序列與同源蛋白序列在N 端保守區(qū)域“GST_N” 和C 端保守區(qū)域“GST_C_Sigma_like”上比較保守。為進一步研究線蟲GSTs 蛋白的進化關(guān)系，利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖4），發(fā)現(xiàn)松材線蟲BxGSTs1 蛋白序列與鉤口線蟲GST 蛋白（EYC01086.1）遺傳距離遠，親緣關(guān)系較遠；與秀麗隱桿線蟲GST 蛋白（NP_494882.2）遺傳距離近，親緣關(guān)系較近。BxGSTs1 蛋白與秀麗隱桿線蟲GST 蛋白（EYC01086.1）具同源性（E=9e-22），表明兩者功能相似。進化樹分析結(jié)果與同源性分析結(jié)果相一致。

圖3 松材線蟲BxGSTs1 蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 The conserved domains of BxGSTs1

圖4 松材線蟲BxGSTs1 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of BxGSTs1

2.3 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

PredictProtein 在線工具對BxGSTs1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白中氨基酸殘基組成以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主，分別占比53.55%，38.06%。應(yīng)用SWISS-MODEL 軟件于PBD 庫中尋找BxGSTs1 的同源蛋白，構(gòu)建三維模型，Swiss-PdbViewer 進行建模分析（圖5）。結(jié)果顯示，松材線蟲BxGSTs1 蛋白包含1 個N 端谷胱甘肽的結(jié)合區(qū)域和1 個C 端識別結(jié)合底物區(qū)域。圖5A 右邊為N 端區(qū)域，含有7 個α-螺旋、2 個β-折疊及大量無規(guī)則卷曲；圖5A 左邊為C 端區(qū)域，含有個8個α-螺旋、2 個β-折疊及大量無規(guī)則卷曲。拉氏構(gòu)象圖顯示（圖5B），預(yù)測蛋白的殘基二面角多位于黃色核心區(qū)域，說明預(yù)建模蛋白的空間結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，同源建模結(jié)果具有可信性。

2.4 BxGSTs1 基因的表達分析

原位雜交試驗研究BxGSTs1基因在松材線蟲組織中的表達部位，Olympus 顯影檢測。雜交顯色結(jié)果顯示：經(jīng)反義鏈雜交探針處理，松材線蟲的食道腺及生殖部位附近顏色變深，有雜交信號存在（圖6A）；正義鏈雜交探針（對照組）處理的線蟲無雜交信號存在（圖6B）。推測松材線蟲BxGSTs1基因主要在松材線蟲的食道腺及腹部近生殖處表達。

圖5 BxGSTs1 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Three-dimensional structure of BxGSTs1 protein

圖6 松材線蟲BxGSTs1 基因的原位雜交結(jié)果Fig.6 The ISH results of BxGSTs1 gene of B.xylophilus

采用實時熒光定量PCR 分析該基因在魚藤酮及鹽酸左旋咪唑處理下的脅迫表達（圖7）。結(jié)果表明，松材線蟲BxGSTs1基因在藥劑魚藤酮脅迫12、24 h 時，基因表達上調(diào)（圖7A）。隨著藥劑濃度、脅迫時間的增加，BxGSTs1基因的相對表達量呈上升。該基因在2.60 μg/mL 魚藤酮脅迫24 h時的相對表達量最高，約為對照的4 倍；BxGSTs1基因在藥劑鹽酸左旋咪唑脅迫12、24 h 時，基因表達上調(diào)（圖7B）。隨著藥劑濃度、脅迫時間的增加，BxGSTs1上調(diào)趨勢顯著下降。該基因在3.50 μg/mL 鹽酸左旋咪唑脅迫12 h 時的相對表達量最高，約為對照的10.5 倍。

圖 7 松材線蟲BxGSTs1 基因在藥劑脅迫時的表達分析Fig.7 Expression analysis of BxGSTs1 gene under pesticide stress

2.5 BxGSTs1 基因沉默分析

利用T7 RiboMAXTM Express RNAi System 試劑盒，體外PCR 轉(zhuǎn)錄法合成BxGSTs1基因相應(yīng)dsRNA。凝膠電泳檢測顯示正/反義鏈ssRNA 的條帶大小一致，dsRNA 質(zhì)量良好。紫外分光光度計顯示合成的dsRNA 濃度較高（3.85 μg/μL），滿足RNAi 試驗要求。實時熒光定量qPCR 檢測dsRNA 的沉默效率，結(jié)果顯示，BxGSTs1基因在2.0 μg/μL dsRNA 浸泡12 h 時的表達量較對照組（ddH2O）下降了49%，基因被沉默。奧林巴斯顯微觀察顯示，dsRNA 處理組線蟲與對照組（ddH2O）線蟲相比，蟲態(tài)無明顯變化。

選用2.60 μg/mL 魚藤酮、3.50 μg/mL 鹽酸左旋咪唑，研究dsRNA 處理組線蟲及ddH2O 對照組線蟲的藥劑死亡率。24 孔板藥劑浸泡試驗顯示：2.60 μg/mL 魚藤酮處理12 h 時，dsRNA 處理組線蟲的死亡率為67.33%，ddH2O 對照組線蟲的死亡率為48.67%，死亡率顯著提高了18.67%；3.50 μg/mL 魚藤酮處理12 h 時，dsRNA 處理組線蟲的死亡率為32.67%，ddH2O 對照組線蟲的死亡率為26%，死亡率提高了6.67%。與ddH2O 對照組線蟲相比，dsRNA 處理組線蟲對魚藤酮藥劑的敏感性顯著提高。

圖8 基因沉默效率及線蟲死亡率Fig.8 Gene silencing efficiency and mortality rate of dsRNA-treated nematodes

3 結(jié)論與討論

所有的生物體都有一套精細的防御系統(tǒng)，細胞色素P450、酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是構(gòu)成該防御系統(tǒng)主要酶系[27]。作為解毒代謝酶類之一，谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶（GST）在該系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用。GST 蛋白是多基因編碼、具有多功能的超家族同工酶，廣泛存在于動物、植物、昆蟲、真菌、線蟲及微生物等多種生物組織中。該類蛋白于1961年首次在大鼠肝臟中被發(fā)現(xiàn)[28]。隨后大量研究發(fā)現(xiàn)，作為二期解毒的主要參與者，GST家族酶主要用于催化谷胱甘肽與疏水的、親電的化合物發(fā)生親電取代反應(yīng)，轉(zhuǎn)化降解多種天然和人工合成的化合物，在生物體抵抗內(nèi)源性、外源性有毒物質(zhì)的過程中發(fā)揮了抗氧化及解毒等作用，保護生物體。隨著化學(xué)農(nóng)藥濫用、“3R”問題日益加劇，有害生物抗藥性問題研究愈加重要[29]。通過對松材線蟲GST基因深入研究，初步了解線蟲對殺線蟲劑的脅迫響應(yīng)機制。利于我們尋找潛在藥物靶標(biāo)基因，利用分子生物技術(shù)防控線蟲病。

本研究基于松材線蟲轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用Blast 比對松材線蟲基因庫，RT-PCR 技術(shù)克隆獲得松材線蟲1 條谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶Sigma 類基因（BxGSTs1）CDS 全長序列。Conserved Domains結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，BxGSTs1 蛋白包含2 個保守結(jié)構(gòu)域—C 端結(jié)構(gòu)域和N 端結(jié)構(gòu)域。C 端結(jié)構(gòu)域含有特異性底物結(jié)合H 位點，N 端含有與GSH 特異結(jié)合G 位點。推測該蛋白通過催化GSH 與底物發(fā)生特異性結(jié)合，減少底物對線蟲機體的損傷。多序列比對及進化樹分析顯示，松材線蟲BxGSTs1蛋白與秀麗隱桿線蟲GST 蛋白（NP_494882.2）同源性較高，親緣關(guān)系較近，推測兩者的蛋白功能相似。蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，BxGSTs1 蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、無規(guī)則卷曲。高占比的無規(guī)則卷曲，表明BxGSTs1 蛋白含有大量的功能區(qū)域、具功能多樣性，與GSTs 蛋白屬于多功能同工酶[11]相吻合。

原位雜交試驗研究BxGSTs1基因在松材線蟲組織中的表達位置，發(fā)現(xiàn)BxGSTs1基因主要在松材線蟲的食道腺附近和腹部近生殖處表達。食道腺是線蟲侵染寄生的重要部位，通過分泌效應(yīng)蛋白等，降低寄主防御系統(tǒng)。腹部及生殖部位是線蟲的代謝與生殖中心。推測上述兩處在線蟲代謝過程中會消耗大量能量產(chǎn)生很多內(nèi)源性有毒物質(zhì)，BxGSTs1基因的大量表達有利于松材線蟲降低體內(nèi)外有毒活性物質(zhì)的危害。qPCR 試驗定量分析發(fā)現(xiàn)，松材線蟲BxGSTs1基因在藥劑脅迫處理時的相對表達上調(diào)。推測松材線蟲通過高表達BxGSTs1基因響應(yīng)藥劑脅迫，使線蟲產(chǎn)生氧化應(yīng)激抗性，發(fā)揮耐藥解毒作用。

RNAi 技術(shù)可降低目的基因的表達，是研究線蟲基因具體功能的有效工具[30]。本研究采用體外法合成dsRNA，利用浸泡法進行RNAi 試驗。RNAi 試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dsRNA 浸泡12 h 時，松材線蟲BxGSTs1基因的相對表達量下降，基因沉默成功。后續(xù)藥劑處理試驗顯示，在魚藤酮及鹽酸左旋咪唑藥劑脅迫12 h 時，dsRNA 處理組線蟲的死亡率較ddH2O 對照組線蟲的死亡率增加，dsRNA 處理組線蟲對魚藤酮藥劑的敏感性顯著提高。BxGSTs1基因沉默時，松材線蟲的抗藥性下降。結(jié)合前人對GST 家族酶解毒功能的研究，筆者推測松材線蟲BxGSTs1 在線蟲的抗氧化應(yīng)激及耐藥解毒方面發(fā)揮了重要作用。

總之，本文通過對松材線蟲BxGSTs1基因特性及具體功能的初步研究，了解其在線蟲抗氧化應(yīng)激、耐藥解毒等方面的重要作用，為線蟲GSTs家族基因功能的全面研究奠定了基礎(chǔ)，也為尋找藥物靶標(biāo)基因、生物防治線蟲病提供了理論支持。但BxGSTs1基因具體如何參與線蟲解毒耐藥機制，還需進一步深入研究。后續(xù)可通過灰葡萄孢菌接種試驗，進一步研究松材線蟲BxGSTs1基因沉默后是否對松材線蟲的遷移、繁殖能力、生長發(fā)育有影響；通過松樹接種試驗，深入研究松材線蟲BxGSTs1在線蟲與松樹植物互作中的具體機制；通過沉默線蟲的轉(zhuǎn)錄組測序分析，系統(tǒng)探究BxGSTs1基因與其它兩大解毒蛋白家族基因的關(guān)系。