李河橋,劉紹明,孫櫻菲,張修舉
(1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院泌尿外科,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院泌尿男科,北京 100163;3.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院男科,北京 100091)
精子生成是一系列細胞事件,與睪丸精子生成或睪丸后成熟有關的分子事件的干擾可能導致不孕不育。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù),全球近1.9億人患有不孕不育,其中因男性因素所致者占到半數(shù)[1]。各種條件可以不同程度地影響男性的生殖潛力,它們往往共存[2]。越來越多的證據(jù)表明,氧化應激(OS)在男性不孕癥病因學中起著獨立的作用,其中超過半數(shù)的男性,基質活性氧物種水平表達過多[3]。OS可以通過多種途徑對生育產(chǎn)生負面影響,包括電容干擾和精子細胞膜、DNA可能受損,這可能損害精子受精卵并發(fā)育成健康胚胎的潛力[4-5]。然而,精子擁有發(fā)達的抗氧化防御網(wǎng)絡,包括抗氧化基因和酶,在保護精子的活力和生存能力方面發(fā)揮著至關重要的作用??寡趸騈rf2(核因子紅細胞2+相關因子2)促進抗氧化酶表達,是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[6]。本團隊前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[7-8],二仙解毒方以補腎益精、活血解毒為組方思想,可以提高精液質量、精子的活動力(progressive and non-progressive,PR+NP),調整氧化應激狀態(tài)。為了明確二仙解毒方對弱精子癥(asthenospermia,AS)大鼠睪丸及附睪組織Nrf2蛋白表達的影響,本研究通過建立AS大鼠模型,對此進行研究,以進一步闡述為二仙解毒方的臨床起效作用機制。
1.1 實驗動物 選取SPF級SD健康雄性大鼠72只,8周,體質量 200~250 g,統(tǒng)一購于斯貝福(北京)實驗科技有限公司。
1.2 藥物 二仙解毒方:熟地黃15 g,牡丹皮9 g,丹參 9 g,枸杞子 12 g,茯苓 9 g,車前子 9 g,仙茅 9 g,淫羊藿9 g,菟絲子12 g,黃精9 g,巴戟天12 g,萆薢9 g,白花蛇舌草15 g,蒲公英12 g,配方顆粒購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司。
左卡尼汀口服液:國藥準字H19990372,東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司,規(guī)格:10mL;奧立泰:國藥準字H20031257,西安萬隆制藥股份有限公司,規(guī)格:0.25 g。
1.3 主要及試劑 EPS 300電泳儀(biorad);低溫離心機(Sigma,德國);LEGEND MICRO 21R 臺式高速冷凍離心機(THERMO);熒光定量PCR儀(Applied biosystems(USA));分光光度計(THERMO);TRIZOL(10296028,Invitrogen);SuperScript III RT 逆轉錄 kit(11752050,ABI-invitrogen);Sybr qpcr mix(4472920,ABI-invitrogen);DJ-1(ab18257,Abcam)。
1.4 方法 采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為空白組、模型組、二仙解毒方低劑量組、中劑量組、高劑量組、左卡尼汀組,每組各12只。除空白組外,剩下各個實驗組采取奧硝唑法制備AS模型[9]。二仙解毒方各組均以二仙解毒方濃縮液生藥予以灌胃,其中二仙解毒方低劑量組灌胃劑量為7.5 g生藥/kg;中劑量組灌胃劑量為15 g生藥/kg;高劑量組灌胃劑量為生藥30 g/kg;左卡尼汀組灌胃劑量為左卡尼汀口服液0.1 g/kg;空白組、模型組:予生理鹽水10 mL/kg體重灌胃。各組灌胃持續(xù)4周。
1.5 觀察指標
1.5.1 大鼠精子活動力檢測 末次給藥24 h后處死大鼠,分離睪丸、附睪,取左側睪丸和附睪置于37℃生理鹽水的平皿中,稱重后將附睪橫切分為大致均勻的上下兩部分,將左側上半部分剪碎的附睪組織移入孵育緩沖液試管中。自大鼠輸精管及附睪中留取精液標本,進一步行精子活力檢測。
1.5.2 精液氧化應激指標檢測 取左側下半部分睪丸、附睪組織,分別用4℃的生理鹽水在冰水浴中制成10%的組織勻漿,離心速度為3 000 r/min,持續(xù)10 min,收集上清液并冷凍保存,各小組蛋白表達將采用分光光度法進行。SOD檢測用黃嘌呤氧化法;選用硫代巴比妥法來進行MDA檢測;考馬斯亮藍法被用來檢測GSH-Px;采用熒光探針測定精子ROS;具體步驟說明書實施。
1.5.3 Western Blot檢測睪丸、附睪組織Nrf2蛋白的表達 從-80℃冰箱中取出樣品,蛋白上樣量為20 μg,進行電泳后將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上室溫封閉 2 h;以 Nrf2抗體(兔源,1∶5 000)為第一抗體,HRP-山羊抗兔IgG(1:6 000稀釋)為第二抗體進行孵育;漂洗后加入發(fā)光液,顯影、定影。用Quantity One對蛋白條帶的灰度進行定量,以β肌動蛋白為內參,計算相對表達量用來統(tǒng)計學分析。
1.5.4 RT-PCR檢測睪丸、附睪組織Nrf2基因的轉錄取另一側大鼠睪丸組織,用RNA simple Total試劑盒提取總RNA,用Rever TraAce qPCR RT kit試劑盒反轉錄成cDNA,設計目的基因及管家基因引物,以cDNA為模板,采用 SYBR Green進行PCR檢測。同時測定待測樣品的管家基因(β-actin)及目的基因Ct值和對照組管家基因(β-actin)及目的基因Ct值,其中數(shù)據(jù)相對定量分析,將通過2-△△CT法計算。引物序列見表1。
表1 引物序列
1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)來表示;滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)選擇單因素方差分析來實現(xiàn)多個小組之間的比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01表示差異有顯著性意義。
2.1 精子密度及活動力比較 對比空白組與模型組大鼠精子濃度,結果表明不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05),而PR+NP精子百分率下降,存在統(tǒng)計學差異(P<0.01),說明AS大鼠成功造模。與模型組比較,二仙解毒方低劑量組精子密度升高(P<0.05);其余各組精子密度顯著升高(P<0.01);與模型組比較,二仙解毒方低、中、高劑量組、左卡尼汀組中精子活動力PR+NP精子均上升,有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。見表2。
表2 不同濃度二仙解毒方對大鼠精子的改變(±s)
表2 不同濃度二仙解毒方對大鼠精子的改變(±s)
注:與模型組相比,*P<0.05;**P<0.01。
組別 數(shù)量 精子密度/(×106·L-1)PR+NP/%空白組 12 39.17±4.62** 60.23±1.72**模型組 12 15.06±4.17 41.06±1.19二仙解毒方低劑量組 12 19.94±2* 45.51±1.52**二仙解毒方中劑量組 12 22.83±4.65** 49.43±0.77**二仙解毒方高劑量組 12 31.30±4.04** 62.31±1.12**左卡尼汀組 12 33.16±3.96** 57.21±0.85**
2.2 不同濃度二仙解毒方對大鼠精液氧化應激指標的影響 與正常組比較,模型組SOD、GSH-Px水平顯著降低(P<0.01),MDA、ROS水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,各組SOD、GSH-Px含量明顯上升(P<0.01),MDA、ROS含量明顯下降(P<0.01),且二仙解毒方劑量越高,氧化應激指標改變越顯著。此外,二仙解毒方高劑量組大鼠氧化應激指標與空白組相比,二者未表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異(P>0.05),提示二仙解毒方高劑量組可將模型組大鼠的精液抗氧化能力恢復至正常大鼠水平。見圖1。
圖1 不同濃度二仙解毒方對大鼠精液氧化應激指標的影響(±s)
2.3 二仙解毒方對大鼠附睪、睪丸Nrf2 mRNA表達的影響 在附睪組織中,與模型組比較,空白組,二仙解毒方低、中、高劑量組Nrf2 mRNA的表達都顯著上升(P<0.01),左卡尼汀組中 Nrf2 mRNA 同樣上升(P<0.05)。睪丸組織中,各組Nrf2 mRNA表達均顯著提高,具有一定的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。見表3。
表3 二仙解毒方對大鼠附睪、睪丸組織Nrf2 mRNA表達的影響
2.4 二仙解毒方對大鼠附睪、睪丸組織Nrf2蛋白表達的影響 附睪組織中,與空白組相比較,模型組大鼠Nrf2蛋白表達明顯降低(P<0.05),表明弱精子癥大鼠Nrf2蛋白受影響。除左卡尼汀組(P>0.05)外,各組Nrf2蛋白表達均有所上升,有一定的統(tǒng)計學差異(P<0.05),說明西藥治療弱精子癥的主要靶點不在Nrf2蛋白上;其中高劑量組與空白組比較,結果顯示不存在統(tǒng)計學差異(P>0.05),說明二仙解毒方高劑量組效果最好,能在實驗層面恢復大鼠Nrf2蛋白表達。睪丸組織中,相對于模型組,二仙解毒方中劑量組蛋白表達較高,且有一定的統(tǒng)計學差異(P<0.05);空白組和高劑量組蛋白表達顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);二仙解毒方低劑量組和左卡尼汀組Nrf2蛋白表達無明顯變化。提示在恢復蛋白表達上,二仙解毒方效果明顯,左卡尼汀無顯著效果。見圖2。
圖2 不同濃度二仙解毒方對大鼠附睪睪丸組織Nrf2蛋白表達的影響
弱精子癥臨床常見,降低了懷孕幾率,影響胚胎質量。專家共識指出,脾腎兩虛夾瘀為弱精子癥纏綿難愈的關鍵病機,故治療要以健脾益腎、活血養(yǎng)精為基本治法[10]。尤在涇《金匱要略心典》載:“毒,邪氣蘊結不解之謂”[11]。目前一些高輻射、物理化學性等有害成分可歸于中醫(yī)之“毒邪”。毒邪無所出路,日久蘊積體內,損傷精室,進一步致使精子活力下降。因此,弱精子癥不僅有脾腎不足的“本虛”,也有血瘀和毒素積聚過多的“標實”[12-13]。二仙解毒方是由張景岳“贊育丹”化裁所成,在原方基礎上加入活血之牡丹皮、丹參,祛濕之茯苓、車前子、萆薢,白花蛇舌草、蒲公英清熱解毒。全方不僅補腎之陰陽,而且兼顧瘀血、毒邪。研究表明,淫羊藿、巴戟天可以調節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸,菟絲子配伍枸杞子可以改善雷公藤多苷導致的精子異常[14-15]。丹參水提物能促進小鼠睪丸生精功能的恢復,減少精子DNA損傷[16],是治療弱精子癥的有效藥物。通過實驗研究也已證明,健脾益腎活血解毒法可以增加睪丸組織清除活性氧、抵抗氧化損傷的能力,提升精子生存狀態(tài),促使精子運動力上升[17-19]。據(jù)了解,世界人口約15%受不育癥的影響[20],其中超過25%的男性不孕癥病例是特發(fā)性的,沒有可識別的原因[21]。氧化應激(OS)和活性氧物種(ROS)被認為對精子有害,占不孕癥病例的30%~80%[22]。OS對男性群體的生育力和精子功能造成了較大的傷害。Nrf2可以維持細胞內的氧化平衡,降低細胞對死亡信號的敏感性,在細胞抵抗外源性或內源性氧化應激的機制中起重要作用。在Nrf2缺乏的小鼠中,精子濃度和運動能力將受到損害[23]。此外,有證據(jù)表明,與受孕男性精子中的Nrf2表達相比,男性不育者精子的Nrf2表達水平較低[24]。因此,Nrf2作為一種抗氧化基因,通過抑制氧化應激來維持精子動物的運動性非常重要[25]。
本實驗研究結果表明,二仙解毒方能顯著提高精子活動力,能改變氧化應激指標MDA、GSH-Px、SOD、ROS,改善弱精子癥大鼠氧化應激狀態(tài),有助于恢復氧化與抗氧化的“動態(tài)平衡”。二仙解毒方能增加大鼠睪丸和附睪中Nrf2基因的表達。服用二仙解毒方后,大鼠睪丸、附睪組織中Nrf2蛋白表達顯著提高,提示二仙解毒方改善精子活力可能與Nrf2通路激活有關。
此外,本實驗觀察到,二仙解毒方高劑量組在改善氧化應激狀態(tài)及提高Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白表達效果顯著,多數(shù)指標恢復到空白組大鼠水平,表明二仙解毒方確有提高精子活動力、改善精子微環(huán)境的作用,使之有恢復至正常水平的可能性。二仙解毒方可以減少甚至逆轉奧硝唑誘導睪丸和附睪的病理損傷;二仙解毒方高劑量組療效優(yōu)于左卡尼汀,體現(xiàn)出中醫(yī)藥治療疾病的優(yōu)勢之處,但由于少弱精子癥病理機制較為復雜,二仙解毒方是否可通過調控其他蛋白及通路來改善精子微環(huán)境功能,尚有待于進一步研究。