基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益氣涼血生肌方預(yù)防冠心病PCI術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛機(jī)制*

魯婷婷，龍 佳，汪吳嬌，楊志飛，林 謙，萬(wàn) 潔

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是一種嚴(yán)重影響居民健康，甚至引起死亡的疾病。全球每年約有740萬(wàn)患者死于CHD[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）因能夠快速有效地開(kāi)通血管恢復(fù)血運(yùn)而降低冠心病病死率，被廣泛地運(yùn)用于臨床。但隨著PCI術(shù)的普及，其導(dǎo)致的不良影響也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。臨床發(fā)現(xiàn)PCI術(shù)后患者靶血管常出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞受損、炎癥反應(yīng)及血栓形成等病理變化，進(jìn)而引發(fā)復(fù)發(fā)心絞痛等術(shù)后不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE）[2-3]。盡管患者在術(shù)后接受規(guī)律口服藥物治療，其復(fù)發(fā)心絞痛的概率仍可高達(dá)30%，而至于那些對(duì)口服藥物存在不可耐受的副作用以及嚴(yán)格禁忌證的患者，再發(fā)心絞痛概率可能會(huì)更高[3-4]。

基于對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)理論的認(rèn)識(shí)，針對(duì)PCI術(shù)后患者病理變化特點(diǎn)，首都國(guó)醫(yī)名師廖家楨教授創(chuàng)立了益氣涼血生肌方（YQLXSJF）用于PCI術(shù)后 MACE的臨床防治。課題組前期臨床研究表明PCI術(shù)后早期口服中藥YQLXSJF能夠有效減少心絞痛的復(fù)發(fā)[5]。本研究結(jié)合課題組前期成果，進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，擬通過(guò)篩選心絞痛與益氣涼血生肌方的共同靶基因，找到Y(jié)QLXSJF防治CHD PCI術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛的可能機(jī)制，為YQLXSJF對(duì)PCI術(shù)后患者的臨床應(yīng)用以及后續(xù)科學(xué)研究提供一定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 藥物靶點(diǎn)篩選 YQLXSJF各味藥成分及相應(yīng)靶點(diǎn)通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)[6]（TCMSP）檢索，并限定兩個(gè)ADME屬性值：類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 與口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[7-8]。并在 Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）獲取標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 藥物活性成分與靶點(diǎn)圖構(gòu)建 通過(guò)cytoscape 3.7.1做出YQLXSJF“活性成分-靶點(diǎn)”圖，并在圖中用“節(jié)點(diǎn)”對(duì)二者進(jìn)行表示，用“邊”表示二者關(guān)系，并通過(guò)“Network Analyzer”統(tǒng)計(jì)分析自由度（degree）等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，對(duì)二者之間的關(guān)系進(jìn)行描述。

1.3 心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“angina”為關(guān)鍵詞，在 GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//mirror.omim.org）中挖掘調(diào)治心絞痛的靶點(diǎn)，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中轉(zhuǎn)化成標(biāo)準(zhǔn)的基因名，合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后建立疾病的靶標(biāo)庫(kù)。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中，可根據(jù)Score＞中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選疾病靶點(diǎn)[9]，刪除重復(fù)值后得到心絞痛相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 藥物和疾病共同靶點(diǎn)篩選 通過(guò)微生信在線平臺(tái)（http：//www.Bioinforma-tics.com.cn/）將 YQLXSJF化學(xué)成分靶點(diǎn)和心絞痛相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，繪制Venn圖，獲得交集靶點(diǎn)。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選運(yùn)用 STRING11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org/）把將交集靶點(diǎn)提交至形成PPI網(wǎng)絡(luò)[10-11]，設(shè)置最小相互作用閾值為“highest confidence（0.700）”，選擇人類(lèi)并對(duì)斷開(kāi)的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行隱藏，將下載的tsv導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行PPI作圖。采用CytoNCA插件，根據(jù)接近（Closeness Centrality，CC）、介數(shù)（Betweenness Centrality，BC）中心性以及自由度（Degree，DC）3 個(gè)主要參數(shù)進(jìn)行拓?fù)浜Y選[12]，得到其核心靶點(diǎn)。

1.6 生物學(xué)功能和通路分析 使用Metoscape平臺(tái)[13]對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本體（GO）分析，并通過(guò)微生信在線平臺(tái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路圖構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，得出YQLXSJF防治心絞痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分、靶點(diǎn)的篩選以及圖形構(gòu)建 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出該方119種化學(xué)成分，其中黃芪20種，丹參65種，丹皮11種，金銀花23種；去除未查到靶點(diǎn)的成分，去重后共得到44種候選藥效成分（表1）。得到2 116個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，去重后有252個(gè)。各味藥物的成分與各成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)圖中共包括節(jié)點(diǎn)285個(gè)和相互關(guān)系735個(gè)（圖1）。

表1 YQLXSJF成分信息

續(xù)表1

圖1 YQLXSJF活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 心絞痛靶點(diǎn)的獲取及交集靶點(diǎn)PPI構(gòu)建GeneCards與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到的心絞痛靶點(diǎn)取并集，得到疾病靶點(diǎn)1 740個(gè)。疾病與藥物靶點(diǎn)取交集獲得166個(gè)共同作用靶點(diǎn)，此即YQLXSJF預(yù)防心絞痛有重要意義的靶點(diǎn)（圖2）。在STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)輸入166個(gè)共同靶點(diǎn)，設(shè)置完成后下載Tsv文件，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.1中得到一個(gè)由161個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 415條邊組成的網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。以DC、BC和CC中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，取同時(shí)大于以上3個(gè)指標(biāo)中位數(shù)的靶點(diǎn)作為第1次篩選結(jié)果，圖中共有節(jié)點(diǎn)55個(gè)和相互關(guān)系677個(gè)（圖3B）；第2次以大于2倍DC的中位數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選，得到257個(gè)相互作用和26個(gè)節(jié)點(diǎn)，將這些靶標(biāo)作為YQLXSJF作用于心絞痛的核心靶點(diǎn)（圖3C）。26個(gè)核心靶點(diǎn)依次為：AKT1、TP53、MAPK8、IL6、MAPK1、TNF、VEGFA、JUN、STAT3、EGF、EGFR、CXCL8、MYC、MMP9、IL1B、CASP3、RELA、CCND1、FOS、PTGS2、APP、CCL2、ESR1、MAPK14、ICAM1、IL10（表2）。

圖2 心絞痛疾病靶點(diǎn)與YQLXSJF活性成分靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 YQLXSJF預(yù)防心絞痛核心靶點(diǎn)

2.3 核心靶點(diǎn)GO分析 在Metoscape數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)藥物活性成分與疾病的26個(gè)共同核心靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析，得到分子功能（Molecular Function，MF）、生物過(guò)程（Biological Process，BP）以及細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）的富集結(jié)果，如圖4所示BP方面，共同作用靶點(diǎn)在炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)（regulation of DNA-binding transcription factor activity）等較多；在CC方面，主要富集在膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）、膜筏（membrane raft）等；在 MF 方面，主要富集在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、信號(hào)受體激活因子的活性（signaling receptor activator activity）等。

圖4 富集GO term BP，CC，MF三合一柱狀圖

2.4 KEGG通路富集分析 在Metoscape數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)藥物活性成分與疾病的26個(gè)共同靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路富集分析，選取Pvalue排名前20的通路進(jìn)行可視化分析，得到KEGG通路富集分析圖（圖5）。共同靶點(diǎn)集中在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF（TNF signaling pathway）、IL-17 （IL-17 signaling pathway）以及流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）等，提示 YQLXSJF 作用于以上多條通路來(lái)預(yù)防PCI術(shù)后心絞痛的發(fā)生。

圖5 KEGG通路富集分析圖

2.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在KEGG分析中，將核心基因集中較多的通路和這些基因進(jìn)行可視化分析（圖6）?；蛴谜叫伪硎荆盘?hào)通路v形表示。共41個(gè)節(jié)點(diǎn)，221個(gè)相互關(guān)系。并進(jìn)行特征分析，Degree值大小通過(guò)圖形大小表示。結(jié)果表明Degree值最大的為 RELA；其他如 MAPK14、MAPK1、MAPK8、TNF、IL1B、FOS、AKT1、IL6 等基因也具有較大的Degree值。這些靶基因可能是YQLXSJF預(yù)防心絞痛的核心靶標(biāo)。

圖6 核心靶點(diǎn)-通路圖

3 討論

PCI是一把雙刃劍，一方面在緩解臨床癥狀的同時(shí)，另一方面也會(huì)引起血管損傷，短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞快速增生遷移以及血栓形成，進(jìn)而導(dǎo)致術(shù)后心絞痛等MACE的出現(xiàn)[14]。因此，在血管內(nèi)膜創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)，維持冠狀動(dòng)脈血管穩(wěn)態(tài)，對(duì)減少PCI術(shù)后再發(fā)心絞痛等MACE的發(fā)生具有重大意義。首都國(guó)醫(yī)名師廖家楨教授在中醫(yī)創(chuàng)傷修復(fù)理論的基礎(chǔ)之上結(jié)合臨床實(shí)踐，擬定益氣涼血生肌方Y(jié)QLXSJF（黃芪、丹皮、丹參、金銀花）用于臨床，該方已獲得國(guó)家專(zhuān)利（ZL200810240175.4）。方中黃芪益氣托毒生肌，丹皮、丹參合用涼血活血、祛瘀生新，金銀花涼血祛瘀，重視補(bǔ)益正氣兼顧清除熱瘀之邪。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)YQLXSJF降低PCI術(shù)后患者再狹窄率的趨勢(shì)、減少術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛等MACE的發(fā)生率[5]，改善遠(yuǎn)期預(yù)后[15-16]。進(jìn)一步在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)YQLXSJF對(duì)球囊損傷術(shù)后兔頸動(dòng)脈具有促進(jìn)修復(fù)的作用，對(duì)VEC的增殖具有促進(jìn)作用，同時(shí)能抑制VSMC的增殖和遷移，使血管內(nèi)皮功能得以改善[17]。但PCI術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛的單獨(dú)作用機(jī)理缺乏整體闡述。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法整體分析YQLXSJF抗心絞痛的主要作用機(jī)制。

本研究通過(guò)在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選出候選藥效成分及靶點(diǎn)，再進(jìn)一步借助軟件對(duì)YQLXSJF成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，從網(wǎng)絡(luò)圖中得到關(guān)鍵的藥效成分，其中山柰酚、槲皮素與木犀草素等黃酮類(lèi)化合物Degree值排名靠前。YQLXSJF中大多數(shù)化合物會(huì)影響多個(gè)靶標(biāo)。根據(jù)Degree值排名靠前的有山柰酚、槲皮素以及木犀草素等，這3種化合物率屬于黃酮類(lèi)化合物，大量研究表明黃酮類(lèi)化合物能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基并拮抗血小板活化因子，從而抑制VSMC增殖以及血管壁增厚[18]。一項(xiàng)大樣本臨床研究表明食用富含山柰酚、槲皮素以及木犀草素能夠明顯降低冠心病心絞痛的發(fā)生以及冠心病致死率[19]。山柰酚、槲皮素以及木犀草素調(diào)節(jié)了與心絞痛疾病相關(guān)的大多數(shù)靶標(biāo)，均具有抑制VSMC增殖，且OB較高，因此，推測(cè)它們可能為YQLXSJF的代表性化合物。

YQLXSJF與心絞痛蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，該方防治心絞痛的靶點(diǎn)主要集中在AKT1、TP53、MAPK8、IL6、MAPK1、TNF、VEGFA、JUN以及FOS等。AKT1主要是參與調(diào)節(jié)機(jī)的體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及新陳代謝等過(guò)程，為冠心病患者的重要的生物標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)[20]。MAPK1與MAPK8能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及炎癥等多種細(xì)胞反應(yīng)[21]。JUN與FOS屬于兩種原癌基因，能夠調(diào)控IL-6、IL-1β的表達(dá)以及機(jī)體的炎癥反應(yīng)。此外，研究表明Jun-Fos核蛋白復(fù)合物在心肌缺血、心肌梗死以及PCI術(shù)后管腔再狹窄等心血管疾病病理過(guò)程中起到重要作用[22]。學(xué)者劉婧瑋等研究發(fā)現(xiàn)IL6與TNF在冠心病血瘀證患者中存在高表達(dá)，這也佐證了YQLXSJF能夠用于冠心病PCI術(shù)后證型為血瘀的患者[23]。因此，推測(cè)這些靶點(diǎn)基因主要能夠通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫、新陳代謝來(lái)預(yù)防冠心病心絞痛。

為進(jìn)一步探討YQLXSJF潛在作用機(jī)制，KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)的多條潛在信號(hào)通路中，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化，TNF、IL-17以及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路相關(guān)性大。剪切應(yīng)力是血流在血管壁內(nèi)皮表面產(chǎn)生的摩擦力，在血管生物學(xué)中起著核心作用，并有助于心絞痛的發(fā)展。擾動(dòng)的血流和相關(guān)的往復(fù)運(yùn)動(dòng)以及低剪切應(yīng)力通常會(huì)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)動(dòng)脈壁的氧化和炎癥狀態(tài)，促進(jìn)硬化斑塊的化生，最后發(fā)生心絞痛[24]。AGERAGE信號(hào)傳導(dǎo)涉及MAPKs以及蛋白激酶C的多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活，然后影響NF-κB活性[25]。NF-κB可促進(jìn)促炎因子（如IL-6和TNF-α）以及與心絞痛相關(guān)的基因VEGF表達(dá)。而VEGF能加快血管形成[26]。推測(cè)YQLXSJF可能通過(guò)以上等通路發(fā)揮防治PCI術(shù)后心絞痛的作用，前期對(duì)PCI術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛機(jī)制的研究與本研究結(jié)果基本一致[27-29]。除此之外，富集分析結(jié)果顯示YQLXSJF作用于心絞痛與炎癥反應(yīng)、膜筏、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等生物過(guò)程相關(guān)。未來(lái)可以從PCI術(shù)后剪切應(yīng)力和炎癥反應(yīng)等通路方面對(duì)涼血生肌方預(yù)防冠心病PCI術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛機(jī)制進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探究YQLXSJF預(yù)防冠心病PCI術(shù)后再發(fā)心絞痛的潛在作用機(jī)制，為YQLXSJF防治PCI術(shù)后復(fù)發(fā)心絞痛的臨床應(yīng)用以及后續(xù)科學(xué)研究提供一定理論基礎(chǔ)。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究熱點(diǎn)的傾向性和數(shù)據(jù)庫(kù)信息完整性和準(zhǔn)確性的限制，且藥物成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)量有限，不能完全闡述中藥復(fù)方的藥理作用，且中藥從口服到代謝過(guò)程中，要經(jīng)歷復(fù)雜的過(guò)程，故需后續(xù)代謝組學(xué)研究明確入血成分。為明確該方作用于心絞痛的主要靶點(diǎn)，仍需進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。