洋蔥伯克霍爾德氏菌JX-1防治番茄青枯病機理的初步分析

許萌杏，李鳳芳，袁高慶，黎起秦，吳小剛

（廣西大學農學院，南寧 530004）

由茄科雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum引起的番茄青枯病是一種毀滅性的土傳病害，該病原菌寄主范圍廣泛，可引起番茄、煙草和花生等50多個科的200多種植物發(fā)病[1]。前期研究結果表明，茄科雷爾氏菌主要通過傷口進入寄主根部后，快速入侵木質部，并通過導管組織擴散到寄主其他部位[2]。番茄青枯病典型的萎蔫癥狀是由病原菌在導管中產生過量胞外多糖（EPS），從而阻塞植物中水分的自由運輸造成的。分子生物學和遺傳學已鑒定出許多與該病害發(fā)生相關的必需基因，如Phc系統（phenotype conversion）可調控EPS的生成和一些胞外酶的產生，缺失該系統核心基因—phcA基因可嚴重影響青枯菌的致病性[3]。除病原菌分泌的EPS外，三型分泌系統（Type III secretion system）在病原菌-寄主互作過程中發(fā)揮至關重要的作用。茄科雷爾氏菌可利用該系統分泌效應蛋白到寄主植物體內，干擾寄主的抗病性，因此該系統的功能缺失可導致病原菌無法產生典型的萎蔫癥狀[4]。由于茄科雷爾氏菌可通過多種方式影響寄主植物正常功能及其抗病性，且該病原菌最適宜的生長溫度為30 ℃～35 ℃，因此位于亞熱帶地區(qū)的廣西尤其適合番茄青枯病的發(fā)生和危害。雖然前期在抗病育種、化學藥劑防治和農業(yè)防治等方面進行了大量工作，但至今仍然沒有防治番茄青枯病的有效方法[5]。

近年來，隨著人們對綠色農產品需求的不斷增加，植物病害生物防治作為綜合防治植物病害體系中的方法之一，也受到人們廣泛的重視。我國在 60年代已經開始研究青枯病的生物防治，并篩選獲得了許多有益微生物，如芽胞桿菌Bacillussp.、假單胞菌Pseudomonassp.和鏈霉菌Streptomycessp.等[6,7]。另外，利用伯克氏菌Burkholderiasp.防治植物土傳病害也已成為國內外生物防治研究的熱點之一。伯克氏菌是廣泛分布于土壤、水和植物根圍等環(huán)境中的一種革蘭氏陰性細菌。該屬中的一些菌株具有解磷、解鉀、固氮和促進植物生長的作用[8]。這類細菌還可降解除草劑或殺蟲劑中的氯化芳香族化合物，減少農藥對環(huán)境的污染[9]。研究還發(fā)現伯克氏菌可產生多種次生代謝產物，如硝吡咯菌素（Pyrrolnitrin，Prn）、藤黃綠膿菌素（Pyoluteorin，Plt）、嗜鐵素（Siderophore）、蛋白酶（Proteinase）等，而這些次生代謝產物是許多優(yōu)良生防細菌抑制植物病害的決定因子[10]。

本研究從廣西各地作物根圍土壤分離細菌，利用平板拮抗和溫室盆栽防效測定，評價其對番茄青枯病的防治效果。同時利用生理生化和遺傳學手段對候選菌株JX-1進行種屬鑒定，并對其生防機制進行了初步分析，這些結果為該菌株將來的大田試驗提供了技術支持，同時也為遺傳改造該菌株提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

本試驗所用尖孢鐮刀菌苦瓜專化型Fusariumoxysporumf.sp.momordiicae、簇生長蠕孢菌Helminthosporiumtorulosum、高粱莖點霉菌Phomasorghina、瓜果腐霉Pythiumaphanidermatum、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、齊整小核菌Sclerotiumrolfsii、柑橘擬莖點霉菌Phomopsiscitri、茄科雷爾氏菌R.solanacearum、丁香假單胞菌番茄致病變種P.syringaepv.tomato和胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum病原細菌培養(yǎng)于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。用于分子克隆所需的EscherichiacoliDH5α和雙親雜交所需的S17-1 (pUT-Km)培養(yǎng)于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱[11,12]?？股厥褂脻舛葹椋喊逼S青霉素（Ap）50 μg/mL，卡那霉素（Km）50 μg/mL，氯霉素（Cm）50 μg/mL。用于重組質粒篩選的5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）終濃度為50 μg/mL。拮抗菌株的分離和培養(yǎng)及病原細菌的培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基（蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂粉10 g、pH 7.0，定容至1000 mL），液體培養(yǎng)基NB（蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、NaCl 5 g、pH 7.0，定容至1000 mL），病原真菌的培養(yǎng)及平板對峙使用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉10 g、pH 7.0，定容至1000 mL），雙親雜交試驗使用LB培養(yǎng)基（tryptone 10 g，yeast extract 5 g，氯化鈉5 g，瓊脂10 g，pH 7.0，定容至1000 mL），氫氰酸檢測使用KB培養(yǎng)基（蛋白胨29 g，甘油8 mL，K2HPO41.73 g，MgSO4·7H2O 1 g，定容至1000 mL）。

1.2 土壤根圍細菌的分離純化及篩選

從廣西南寧、桂林、百色等地采集不同作物根圍的土樣，采用梯度稀釋法分離拮抗細菌[13]。稱取土壤10 g，溶于90 mL無菌水中，28 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)30 min，使其充分混勻，按照10-1～10-5進行梯度稀釋，分別吸取100 μL涂布于NA平板上，每個梯度重復3次，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取形態(tài)不同的細菌經平板劃線純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

采用平板對峙法篩選抑制茄科雷爾氏菌生長的拮抗細菌[14]。以茄科雷爾氏菌作為靶標菌，將其活化后接種于NB培養(yǎng)基，置于28 ℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至OD600為1.0（108cfu/mL）的菌懸液，吸取2 mL菌懸液加入100 mL冷卻至50 ℃的NA培養(yǎng)基中，制成含致病菌平板，將待測菌液接種于致病菌平板，每個平板點接9個待測菌液，吹干后倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，并記錄試驗結果。

1.3 候選生防菌株溫室盆栽防效試驗

將番茄種子播種在育苗盤中，生長至3～4片真葉期后移栽。移栽時，將番茄幼苗在108cfu/mL候選菌液中浸根30 min（加入0.1%羥甲基纖維素提高菌株JX-1在植物根圍的附著能力）。以生防菌株、清水和20%噻菌銅300倍液作為處理，移栽番茄植株后每隔一周分別灌根20 mL的108cfu/mL生防菌、清水和20%噻菌銅300倍液，一共施用2次。第3周接種20 mL 108cfu/mL茄科雷爾氏菌。每個處理設置3個重復，每個重復15株番茄。接種病原菌10 d后調查病情指數、計算防效。病情指數分級標準參考文獻[13]。

1.4 生防細菌鑒定

1.4.1 形態(tài)觀察和生理特性鑒定 通過拮抗菌株的篩選試驗得到一株對番茄青枯病防治效果最好的菌株JX-1，將菌株劃線于LB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h觀察菌株的菌落形態(tài)。依據《常見細菌系統鑒定手冊》[14]，28 ℃培養(yǎng)24～48 h后對生理生化特征進行鑒定。

1.4.2 分子鑒定 通過細菌16S rDNA和gyrB基因的克隆與分析，明確候選生防細菌的分類地位。以菌株JX-1基因組 DNA為模板，530F/1494R和 63F/1387R[15]兩對引物擴增候選細菌 16S rDNA序列，gyrBF/gyrB-R引物擴增菌株JX-1的gyrB基因相關序列[16]。將回收得到的序列送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序，用ClustalX進行序列對比，MEGA 6.0軟件中鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統發(fā)育樹。

1.5 菌株JX-1抑菌譜測定

采用平板對峙法[17]進行抑菌譜測定。在PDA平板中央接種病原真菌菌餅（直徑9 mm），在病原真菌菌餅四周接種5 μL菌株JX-1菌懸液（距菌餅30 mm），于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d。每處理設置3個重復，設清水對照，待對照平板菌落長滿時測量拮抗帶寬。

1.6 菌株JX-1安全性及致病性測定

以菌株JX-1基因組為模板，利用BCESM1/BCESM2引物擴增洋蔥伯克氏菌致病因子(BCESM)特異性序列[18]，檢測菌株JX-1是否含有BCESM毒力基因。

選取健康的洋蔥球莖，采用針刺方法對洋蔥進行接種試驗[18]，菌株JX-1接種濃度為108cfu/mL，以同樣方法接種無菌水作為對照，設置3個重復，觀察發(fā)病情況。

1.7 生防細菌JX-1生防相關性狀檢測

1.7.1 抗生素合成相關基因檢測 利用表1特異性引物Phl2a/Phl2b、prnCF/prnCR以及pltcf/pltcr進行PCR擴增抗生素2,4-二乙?；g苯三酚（2,4-diacetylphloroglucinol, 2,4-DAPG）、Prn和Plt合成相關基因phlD、prnC及pltC[19]，以熒光假單胞菌P.protegensPf-5[20]基因組作為phlD、prnC及pltC基因陽性對照，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 本文所用菌株、質粒和引物Table 1 Strains, plasmids and primers and used in this study

1.7.2 氫氰酸（HCN）的檢測 依據文獻[21]所述方法，將新鮮的待測菌穿刺接種于KB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基上方懸掛HCN檢測試紙，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果，試紙變藍代表產生HCN。本試驗以產生HCN的熒光假單胞菌2P24[22]為陽性對照。

1.7.3 嗜鐵素的檢測 配制新鮮的CAS平板，接種5 μL過夜培養(yǎng)的待測菌液到CAS平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果，產生黃色暈圈代表產生嗜鐵素。具體方法參考文獻[23]。

1.7.4 蛋白酶的檢測 蛋白酶通過脫脂牛奶平板檢測[24]。取待測菌懸液接種5 μL于脫脂牛奶平板上，吹干后于28 ℃培養(yǎng)24 h觀察結果。

1.8 DNA操作

質粒DNA的提取、限制性酶切、瓊脂糖電泳、感受態(tài)制備、連接和轉化等分子生物學操作方法參考文獻[11]。

1.9 突變菌株的篩選及Tn5的定位

為篩選影響菌株JX-1拮抗能力的遺傳因子，本研究以JX-1為受體菌，利用雙親雜交的方法將攜帶有Tn5轉座子的pUT-Km[25]轉入菌株JX-1中，對該菌株進行隨機突變，獲得突變體庫。通過平板對峙[14]的方法篩選影響菌株JX-1對茄科雷爾氏菌拮抗作用發(fā)生變化的突變體。利用鳥槍法將Tn5及其兩側側翼序列克隆到質粒pMD18（TaKaRa）上并測序，以確定Tn5的插入位置。

1.10 互補菌株的構建

設計引物gntR-F/gntR-R擴增gntR基因完整的編碼序列。PCR產物回收純化酶切后，與相應限制性內切酶酶切的質粒載體 pBBR1MCS-1進行連接[26]，獲得互補質粒 pBBR-gntR。將互補質粒 pBBR-gntR電擊轉入突變菌株M645及野生型菌株JX-1中，同時以轉入質粒載體pBBR1MCS-1的突變菌株M645和野生型菌株JX-1作為對照，測定其平板抑菌活性。

1.11 數據統計與分析

試驗數據采用Excel和DPS軟件進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的篩選及其對番茄青枯病的盆栽試驗防治效果

本研究從廣西各地采集不同作物根圍土樣，利用梯度稀釋法分離獲得 2929株菌落形態(tài)各異的根圍細菌。以茄科雷爾氏菌為供試植物病原菌，共篩選得到可抑制茄科雷爾氏菌生長的菌株146株，占總菌株數的4.38%。進一步復篩試驗得到了7株拮抗效果表現穩(wěn)定的候選菌株，這些候選菌株的抑菌圈直徑范圍在29.50～17.33 mm（圖1）。

圖1 拮抗菌株對茄科雷爾氏菌的抑菌活性Fig.1 Inhibitory ability of rhizobacteria against R.solanacearum

溫室盆栽試驗結果表明，上述7株候選菌株均對番茄青枯病有一定防病效果。其中，菌株JX-1對番茄青枯病的防治效果最好，為80.89%，與化學藥劑噻菌銅的防治效果具有顯著差異（圖2）。

圖2 拮抗菌株對番茄青枯病的盆栽防治效果Fig.2 Control efficacy of rhizobacteria against tomato bacterial wilt under greenhouse conditions

2.2 菌株JX-1的抑菌譜測定

采用平板對峙法對菌株JX-1的抑菌譜進行檢測。結果表明菌株JX-1對尖孢鐮刀菌苦瓜專化型、簇生長蠕孢菌、高粱莖點霉和立枯絲核菌等病原真菌具有不同程度的抑制作用，對柑橘擬點霉的拮抗能力最強，其抑菌直徑為11.50 mm，但菌株JX-1對病原細菌丁香假單胞番茄致病變種和胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種無抑菌效果（表2）。這些結果表明菌株JX-1對不同病原真菌具有較廣的抑菌作用。

表2 菌株JX-1抑菌譜測定Table 2 The inhibitory activity of strain JX-1 on plant pathogens

2.3 菌株JX-1的分類鑒定

對菌株 JX-1進行常規(guī)形態(tài)學和生物學觀察發(fā)現，該菌株為革蘭氏陰性菌，細胞桿狀、單個。在 NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌株JX-1可形成直徑為1～2 mm菌落，菌落圓形、乳白色、表面光滑、有光澤、邊緣整齊、不透明，不產熒光，氧化酶、明膠液化和檸檬酸鹽反應為陽性，反硝化反應、淀粉水解、精氨酸水解、甲基紅反應、V-P測定為陰性，不能利用鼠李糖，可利用麥芽糖和2,3-丁二醇，與文獻[27]中伯克氏菌屬細菌的生理生化特征相一致（表3）。

表3 生防菌JX-1生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain JX-1

以菌株JX-1基因組為模板，分別以530F/1494R和63F/1387R為引物，PCR擴增得到兩條DNA片段，這兩個片段經測序合并得到菌株JX-1的16S rDNA全序列。將獲得序列進行BLAST對比，結果發(fā)現菌株JX-1與伯克氏菌屬細菌16S rDNA序列一致性均為99%（圖3）。進一步利用gyrB基因序列分析，將菌株JX-1鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌Burkholderiacepacia（圖4）。

圖3 菌株JX-1的16S rDNA序列的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA sequence of strain JX-1

圖4 菌株JX-1的gyrB序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree derived from the gyrB sequence of strain JX-1

2.4 菌株JX-1安全性測定

本研究利用PCR方法未檢測到菌株JX-1含有BCESM毒力基因。洋蔥接種試驗表明，菌株JX-1為對洋蔥產生致病性（圖5），這些結果表明菌株JX-1沒有潛在的致病風險。

2.5 菌株JX-1生防相關因子的檢測

前期研究表明，伯克氏菌可產生多種抑菌次生代謝產物[28]。本研究利用抗生素Prn、Plt和2,4-DAPG合成基因特異性引物對菌株JX-1基因組進行PCR擴增結果表明，菌株JX-1基因組中含有prnC基因和pltC基因，但沒有phlD基因（圖5）。這些結果表明菌株JX-1可能產生抗生素Prn和Plt。

圖5 菌株JX-1致病性測定Fig.5 Pathogenicity of strain JX-1

圖5 菌株JX-1抗生素相關合成基因PCR檢測Fig.5 PCR amplification of antibiotics the specific genes within the biosynthetic loci using JX-1 genome as template

檢測了HCN、嗜鐵素和蛋白酶結果表明，氫氰酸檢測試紙未變成藍色，說明菌株JX-1不產生氫氰酸（圖6A）；而蛋白酶檢測平板上菌株JX-1周圍可產生明顯的透明圈，表明菌株JX-1可產生蛋白酶（圖6B）；CAS平板上菌株JX-1也能產生明顯的黃色暈圈，表明菌株JX-1可產生嗜鐵素（圖6C）。

圖6 菌株JX-1產生代謝分泌物鑒定Fig.6 Identification of antifungal compounds produced by strain JX-1

2.6 影響菌株JX-1生防性狀相關突變體的篩選

Tn5轉座子對菌株JX-1進行隨機突變獲得24000株突變體，平板對峙法篩選得到2株影響菌株JX-1拮抗活性的突變菌株。與野生菌株JX-1相比，突變體M645可明顯提高其對茄科雷爾氏菌的拮抗活性，而突變體M1710則完全喪失對茄科雷爾氏菌的拮抗活性（圖7A）。Tn5側翼序列分析表明，突變體M1710中Tn5破壞了t1pks/nrps基因；而突變體M645中Tn5破壞了gntR基因。前期研究表明，t1pks/nrps基因編碼產物參與合成非核糖體寡肽類物質；而gntR基因編碼的GntR轉錄調控因子廣泛存在于細菌中，參與調控細菌重要的生物學功能。

溫室盆栽試驗表明，突變t1pks/nrps基因后，菌株JX-1生防效果明顯下降；而缺失gntR基因其生防能力則顯著提高（圖7B）。互補試驗進一步表明，將互補質粒pBBR-gntR轉入突變體M645后，可恢復其對茄科雷爾氏菌的拮抗能力；而在野生型菌株中過量表達gntR基因則可導致菌株JX-1完全喪失拮抗能力。這些結果表明gntR基因負調控菌株JX-1中拮抗物質的產生（圖7C）。

3 討論

生防菌株可通過多種機制如作物根圍的定殖、誘導植物產生抗病性以及產生抗生素等機制防治植物病害。許多優(yōu)良的生防菌株通?？僧a生2種以上的抗生素，如熒光假單胞菌CHA0產生2,4-DAPG、Plt和HCN等抗菌物質，對煙草根黑腐病、小麥全蝕病和黃瓜猝倒病等土傳病害具有較好防效[29]。本研究從廣西各地作物根圍土壤分離細菌，利用平板對峙法結合溫室盆栽試驗，獲得了7株潛在生防菌株。雖然菌株DH-9對番茄青枯病菌的拮抗能力最強，但溫室盆栽試驗中生防效果最好的為菌株 JX-1（溫室防治達80.89%）。研究發(fā)現菌株JX-1除可能產生Plt和Prn兩種抗生素，并能產生蛋白酶和嗜鐵素。推測菌株JX-1在番茄根圍具有較強的定殖能力，可通過多種生防相關性狀表達，從而表現出較好的溫室生防效果。雖然菌株JX-1屬于伯克氏菌屬，但形態(tài)學、生理生化、16S rDNA和gyrB序列對比表明該菌株為洋蔥伯克霍爾德氏菌。同時致病相關基因檢測和洋蔥致病性試驗進一步表明，菌株JX-1沒有潛在的致病風險，因此具備研發(fā)為生防制劑的潛力（圖5）。

除了上述化學結構式相對簡單的抗菌物質外，最近研究發(fā)現許多生防菌株還產生非核糖體寡肽類抗生素，這類抗生素由聚酮合成酶或非核糖體寡肽合成酶合成，具有抗真菌、植物毒素以及抗腫瘤的功能。有研究發(fā)現，熒光假單胞桿菌Pf-5除產生兩類嗜鐵素、HCN和幾種抗生素（Prn、2,4-DAPG和Plt）外，還可產生根霉素（rhizoxin），該物質對由鐮刀菌屬Fusariumspp.引起的黃萎病具有較強防治作用[30]。分離自格陵蘭島土壤的熒光假單胞菌In5則主要通過產生非核糖體寡肽類抗生素nunamycin和nunapeptin抑制立枯絲核菌，從而防治猝倒病[31]。但非核糖體寡肽類次生代謝物抑菌譜差異性較大。如假單胞菌11K1中，缺失非核糖體寡肽合成相關基因可明顯降低其抗真菌活性，但對水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzae則沒有影響[32]。而分離自玫瑰孢鏈霉菌S.roseosporus的非核糖體寡肽類次生代謝物daptomycin則可抑制多種細菌生長，但不影響病原真菌的生長[33]。本研究發(fā)現，菌株JX-1中缺失tlpks/nrps基因可影響其對番茄青枯病菌的抑制效果，并影響其溫室防病效果（圖 7），因此菌株 JX-1產生的非核糖體寡肽類次生代謝物僅對番茄青枯病菌和病原真菌有抑制作用，而對丁香假單胞菌番茄致病變種和胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種沒有抑制作用（表2）。

圖7 影響菌株JX-1抑菌活性的突變體的篩選及其生防作用分析Fig.7 Control efficacy of strain JX-1 and its derivatives

除獲得降低菌株 JX-1抑菌活性的突變體外，本研究還篩選得到一株抑菌活性明顯增強的突變體M645，該突變體中Tn5破壞的基因為gntR，遺傳學研究表明該基因負調控菌株JX-1生防相關性狀的表達，野生型菌株中過量表達該基因，可導致菌株JX-1喪失對番茄青枯病菌的拮抗作用（圖7）。GntR轉錄調控因子廣泛存在多種細菌中，參與細菌多種生物學功能，如戊二酸代謝、磷酸轉運和抗生素產生等[34]。銅綠假單胞菌P.aeruginosa中轉錄調控因子GntR抑制葡萄糖酸鹽相關基因gntK和gntP的轉錄表達，從而影響葡萄糖和葡萄糖酸鹽的代謝[35]。天藍色鏈霉菌S.coelicolorA3(2)中，GntR轉錄調控因子SCO6256負調控放線素和抗生素的產生[36]。另外，缺失GntR家族調控因子YgrA可提高鏈霉菌OUC6819對多重藥耐藥病菌的拮抗效果，表明ygrA基因對具有抗MDRB活性的次級代謝產物的產生具有負調控作用[37]。因此，轉錄調控因子GntR主要作為抑制子參與調控細菌相關生物學性狀的表達。但目前轉錄調控因子GntR作用機制的研究工作尚處于起步階段，因此菌株JX-1中gntR基因是否直接調控非核糖體寡肽的合成還有待進一步研究。由于t1pks/nrps基因參與合成非核糖體寡肽類抗生素，因此下一步的研究工作將對該未知的非核糖體寡肽進行分離鑒定；同時也將重點研究GntR轉錄調控因子如何參與調控非核糖體寡肽及其作用機理。對菌株JX-1抗生素合成基因的鑒定及相關調控因子的篩選，將為該菌株的遺傳改造提供理論依據，為生物防治番茄青枯病提供新的可靠方法。