• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光猝滅法測定梨小食心蟲性誘劑含量以及田間應用

    2021-04-21 08:35:50杜少芳荊小院馬瑞燕劉金龍
    中國生物防治學報 2021年2期
    關鍵詞:食心蟲緩沖溶液中性

    竇 蕊,杜少芳,王 洋,荊小院,馬瑞燕,劉金龍*

    (1.山西農業(yè)大學基礎部/化學生態(tài)研究所,太谷 030801;2.山西農業(yè)大學植物保護學院,太谷 030801)

    隨著我國農業(yè)產業(yè)結構調整,果樹的種植品種增多,數量增加,果園作為新型產業(yè)逐漸興起,與此同時,果園害蟲的侵害情況也日趨嚴重,其中為害最為嚴重的是梨小食心蟲。梨小食心蟲GrapholithamolestaBusck又名梨小蛀果蛾、東方果蠹蛾、桃折梢蟲等,簡稱“梨小”,屬鱗翅目Lepidoptera 卷葉蛾科 Tortricidae,是一種世界性的果樹害蟲,主要以幼蟲蛀食梨、桃、蘋果、油桃、櫻桃等多種仁果類和核果類果樹的果實或新梢[1,2]。近年來,利用昆蟲性引誘劑來防治害蟲的方法受到廣泛推崇[3-5]。昆蟲性引誘劑可以用來監(jiān)測、誘殺和干擾交配等[6-8],具有高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲等優(yōu)點[9-13],昆蟲性信息素的相關研究和應用倍受國內外學者重視[14]。

    在利用性引誘劑防治梨小食心蟲的工作中[15-17],使用較多的是載有性引誘劑的反口橡皮塞誘芯。誘芯中的主要活性成分是順-8-十二碳烯醇乙酸酯(Z8-12:Ac),該化合物易揮發(fā)且不易溶于水[18],其揮發(fā)量易受風速、溫度、天氣狀況等外界條件的影響。性引誘劑的揮發(fā)量會直接影響到誘蟲量[19,20],影響誘捕效果。為了獲得較好的誘捕效果和精確的監(jiān)測信息,必須要了解性誘芯在實際應用中活性成分的殘留量與釋放速率。目前對誘芯中性引誘劑含量的測定主要依靠氣相色譜法[21,22],少有文獻報道其他有效的分析方法。

    本文試圖建立一種新方法,可用于測定梨小誘芯中Z8-12:Ac的含量。因為在堿性條件下,熒光物質中性紅(NR)與β-環(huán)糊精(β-CD)形成包合物[23],使得中性紅的熒光強度增強,又因為在相同條件下,β-CD也可與Z8-12:Ac形成包合物[24],而且預試驗證明β-CD與Z8-12:Ac的包合能力強于其與NR的包合能力,所以會產生競爭包合作用而導致熒光猝滅現象?;谝陨习细偁幵恚疚脑?NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中首先形成β-CD-NR包合物,接著加入一定量的Z8-12:Ac溶液,測定熒光猝滅程度。根據熒光猝滅程度和Z8-12:Ac濃度間的關系,利用熒光猝滅法來測定Z8-12:Ac的含量,并將其應用于田間誘芯活性成分的測定。本文可為蟲情監(jiān)測預報的精確性以及性誘芯的誘殺效果提供技術手段,避免因活性成分衰減而導致測報信息出現偏差。

    1 材料與方法

    1.1 儀器試劑

    RF5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司);PHS-3C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠);SK5200H超聲波清洗器(上??茖С晝x器有限公司);AR224CN型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

    β-環(huán)糊精(β-CD,上海金穗生物科技有限公司),經沸水重結晶兩次;中性紅(NR,上海金穗生物科技有限公司);梨小食心蟲性誘劑 Z8-12:Ac(本實驗室自主合成,色譜檢驗質量分數為 92%[25]);乙醇(體積分數95%);梨小食心蟲誘芯(中國科學院動物研究所研制生產,含96個單體的橡膠板,單個約重0.300~0.5000 g),其他試劑均為分析純。

    1.2 熒光測定方法

    依次準確移取7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.4)、1.0 mL 1.0×10-3mol/L中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液于25.0 mL容量瓶中,搖勻靜置10 min后,加入一定量的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac溶液,或5.0 mL待測試液,雙蒸水定容,搖勻,在超聲波清洗器中超聲反應20 min,然后放置于冰箱中冷卻到4 ℃,待上機測定。

    在激發(fā)波長為460 nm,發(fā)射波長為580 nm,在此條件下分別測定各試液的熒光強度F,以及Z8-12:Ac空白熒光強度F0,經ΔF=F0—F計算出熒光猝滅值。激發(fā)和發(fā)射光譜通帶寬度均為5.0 nm。

    1.3 誘芯樣品液的制備

    分別取未使用的和在室外放置14 d的梨小食心蟲誘芯各7個,用刀片把每個誘芯切成厚度約1 mm的碎片,并分別轉移到具塞三角瓶內,加入30.0 mL乙醇(95%,分析純),搖勻后在30 ℃水浴中放置2 h,使誘芯中的Z8-12:Ac盡可能溶解到溶劑中[26]。提取完畢后,移液管抽取上層清液,經0.45 μm微孔濾膜過濾轉移入樣品瓶中,標記為樣品液1和樣品液2,旋緊瓶蓋避光保存待測。

    1.4 加標回收試驗方法

    按1.2的方法分別配制β-CD-NR體系溶液于兩個容量瓶中,均加入5.0 mL的樣品液1,向其中一份加入5.0 mL 1×10-4mol/L的Z8-12:Ac標準溶液,均定容至25.0 mL,分別測定其熒光強度猝滅值ΔF,由線性關系計算濃度。根據下式計算加標回收率。樣品液2用同樣的方法處理。加標回收率=(加標試樣測定值—試樣測定值)/加標量×100%

    1.5 田間試驗

    田間誘蛾試驗地點選在山西省太谷縣西山底村的桃園。試驗樹種為桃樹,樹齡 20~25年生,株行距為 4 m×4.5 m。誘捕器為三角形誘捕器(24 cm×18 cm×18 cm)[27]。在誘捕器內部底面平鋪一塊長方形(23 cm×17 cm)粘蟲板,將梨小食心蟲誘芯以細鐵絲固定后懸掛于粘蟲板上方。誘捕時,將誘捕器由鐵絲從上棱穿入,懸掛于樹枝遮蔽處,距離地面高度約為1.5 m,誘捕器間隔20 m 以上。根據地形和桃樹分布情況,劃分試驗小區(qū)。1個試驗小區(qū)共放置6個誘捕器,選擇其中1個誘捕器為對照(每次記錄后需替換未釋放的新誘芯),其余5個為持續(xù)釋放試驗。設置3個小區(qū)為重復。每天定時記錄誘蟲量并更換粘蟲板。設置釋放時間分別為0、7、14、21、28 d,每天統(tǒng)計各個水平處理的誘蛾量,收集各處理水平的試驗誘芯,密封保存,待測。

    分別取3個同一處理水平的待測誘芯,按本文1.3的方法制備樣品液。

    1.6 數據統(tǒng)計與分析

    用 SPSS 16.0軟件進行數據處理與分析;各處理的平均值采用Duncan氏多重比較法檢驗差異顯著性。

    2 結果與分析

    2.1 Z8-12:Ac對β-CD-NR體系熒光強度的影響

    從圖1激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜(b)可以看出,在堿性緩沖溶液中,中性紅(NR)水溶液的熒光強度較弱,其最大激發(fā)波長為556 nm、最大發(fā)射波長為605 nm;當加入適量的β-CD后,熒光強度明顯增大,其最大激發(fā)波長藍移至460 nm,最大發(fā)射波長顯著藍移至580 nm,說明β-CD對體系有熒光增敏作用;在NR與β-CD的包合物溶液中加入Z8-12:Ac后,熒光強度降低,其中發(fā)射熒光強度降低幅度較大。并且Z8-12:Ac的加入量越大,體系熒光猝滅程度越明顯。故本試驗根據Z8-12:Ac的濃度與發(fā)射熒光強度的猝滅值ΔF之間的相關性,使用工作曲線法測定Z8-12:Ac的含量。

    圖1 激發(fā)光譜(a)與發(fā)射光譜(b)(pH 7.4)Fig.1 Excitation spectra (a) and emission spectra (b) (pH 7.4)

    2.2 測定條件的優(yōu)化

    2.2.1 緩沖溶液的選擇 因為在酸性緩沖溶液中β-CD不與質子態(tài)的中性紅形成包合物,故按上述試驗方法主要考察了弱堿緩沖溶液下的Tris-HCl緩沖溶液、KH2PO4-NaOH緩沖溶液、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液和Britton-Robinson廣泛緩沖溶液對體系熒光猝滅強度的影響,每個緩沖溶液做3個重復,測定結果見圖2。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中體系的ΔF比其他3種緩沖溶液的ΔF大且差異顯著,故選擇NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液作為體系介質。

    圖2 不同的緩沖溶液對應的體系的ΔF值Fig.2 ΔF values of corresponding systems for different buffer media

    2.2.2 pH及緩沖溶液體積的影響 分別選用了pH為7.0~8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液進行試驗。隨pH的增大,體系的ΔF增大。在pH為7.4時,ΔF有最大值29.035±0.28;之后隨著緩沖液pH的增大,體系的ΔF逐漸減小,因此選定pH為7.4(圖3)。

    圖3 不同的pH對應體系的ΔF值Fig.3 ΔF values of corresponding systems for different pH

    試驗分別選擇了1.0~9.0 mL不同體積的pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液,按上述步驟進行試驗。隨緩沖溶液用量的增加,體系的ΔF逐漸增大,在加入7.0 mL時,ΔF達到最大26.835±0.425,繼續(xù)增大體積后,ΔF反而有所減小,因此選定緩沖溶液用量為7.0 mL(圖4)。

    圖4 緩沖溶液的不同體積對應體系的ΔF值Fig.4 ΔF values of corresponding systems with different volumes of buffer solution

    2.2.3β-CD用量的影響 取7個25.0 mL容量瓶,分別加入1.0~7.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液,1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液,每個體積做3次重復。隨著β-CD加入量的增大,其熒光猝滅作用增強。當β-CD的用量為5.0 mL時,體系有最大ΔF值為53.825±0.56,β-CD的用量繼續(xù)增加時ΔF值反而減小,故選擇β-CD溶液的用量為5.0 mL 1.0×10-2mol/L(圖5)。

    圖5 不同用量的β-CD對應體系的ΔF值Fig.5 ΔF values of β-CD with different dosage

    2.2.4 中性紅用量的影響 取7個25.0 mL容量瓶,分別加入0.20~1.40 mL的1.0×10-3mol/L NR溶液,1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液,再加入其他試劑,雙蒸餾水加至刻度線定容,按試驗方法充分反應后測定熒光強度,每個劑量做3次重復。隨著中性紅用量的增加,其ΔF逐漸增大,當中性紅的用量為1.0 mL時,體系的ΔF值最大,為30.016±0.563。繼續(xù)加入中性紅其ΔF又逐漸減小,故選擇中性紅用量為1.0 mL 1.0×10-3mol/L(圖6)。

    圖6 不同用量的NR對應體系的ΔF值Fig.6 ΔF values of NR with different dosage

    2.2.5 超聲時間的影響 按上述試驗步驟進行試驗,探究不同超聲時間對體系ΔF的影響。超聲反應20 min,ΔF值最大為29.53±0.238,而且體系穩(wěn)定,故選擇超聲時間為20 min(圖7)。

    圖7 不同反應時間對應體系的ΔF值Fig.7 ΔF values of corresponding systems with different reaction time

    2.2.6 體系的穩(wěn)定時間 超聲反應結束后會出現體系變渾濁的現象,不利于光度法測定。因此,將體系置于4 ℃冰箱中,并分別設計了10、20、30、40、50、60 min的冷卻時間,每個時間設置3個重復,分別測定其熒光猝滅值,可以看出在4 ℃冷卻時,體系熒光猝滅值ΔF在20 min左右變化達到最大,為60.071±0.318,并且體系在60 min內保持穩(wěn)定(圖8)。

    圖8 不同穩(wěn)定時間對應體系的ΔF值(4 ℃)Fig.8 ΔF value of corresponding systems with different stability time(4 ℃)

    經過以上條件優(yōu)化試驗,熒光猝滅法測定Z8-12:AC的最佳條件為:7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.4)、1.0 mL 1.0×10-3mol/L的中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液于25.0 mL容量瓶中,搖勻靜置10 min后,加入一定量的Z8-12:Ac溶液或待測液,定容,搖勻,在超聲波清洗器中超聲反應20 min,然后放置到4 ℃下冷卻20 min,上機測定。

    2.3 方法學檢驗

    2.3.1 線性范圍及檢出限 在7個25.0 mL容量瓶中按上述方法要求分別加入相應反應液后,依次準確加入0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac標準溶液,定容至25.0 mL,使體系中 Z8-12:Ac 的含量依次為 1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4、3.0×10-4、3.5×10-4、4.0×10-4mol/L。按照上述優(yōu)化條件處理后,分別測定其熒光強度,并計算出相應的熒光猝滅值ΔF。通過線性回歸方程計算,表明體系的熒光猝滅值ΔF與Z8-12:Ac含量在1.0×10-4~4.0×10-4mol/L濃度范圍內,呈現良好的線性關系,其線性方程為ΔF=28.3c-16.8,R2=0.9978(圖9)。

    圖9 Z8-12:Ac的標準曲線Fig.9 Standard curve of Z8-12:Ac

    對2.0×10-4mol/L的Z8-12:Ac標準溶液進行11次平行測定,得出其檢出限為1.25×10-5mol/L(S/N=3)。相對標準偏差 RSD為±1.5%,表明方法的靈敏度和精密度良好。

    2.3.2 干擾物質的影響 當Z8-12:Ac的濃度為2×10-4mol/L時,相對誤差不超過±5%的條件下,按本試驗方法考察了以下各干擾物質的允許量(以倍數計),分別是:K+(50)、Na+(50)、Ca2+(50)、Mg2+(50)、NH4+(50)、NO3-(50)、果糖(25)、葡萄糖(50)、甘油(50)。

    2.3.3 加標回收率 準確移取兩個樣品待測液5.0 mL,按試驗方法測定Z8-12:Ac的含量,并按照方法1.4進行加標回收試驗。可以看出兩個樣品的加標回收率分別為 98%和 103.0%,均在誤差允許范圍內,說明測定方法準確度較好(表1)。

    表1 樣品中Z8-12:Ac含量的測定結果(n=3)Table 1 Determination results of Z8-12:Ac in samples (n=3)

    2.4 田間試驗結果

    不同處理水平下,梨小食心蟲誘芯在田間的誘蟲量統(tǒng)計分析和Z8-12:Ac含量的測定結果見表2??梢钥闯觯囼灲M單個誘芯中Z8-12:Ac平均含量,在不同天數處理下差異顯著,說明誘芯在使用中其活性成分含量持續(xù)衰減,符合性誘劑的理化特性。對照組單個誘芯7 d誘蛾總量在各個處理間差異顯著,在整個田間試驗(28 d)出現先增后減的趨勢,符合梨小食心蟲成蟲期的消長規(guī)律,而且羽化高峰期出現在第14~21 d。試驗組單個誘芯7 d誘蛾總量在處理3和處理4之間差異不顯著,與其他處理差異顯著,整個田間試驗期間(28 d)也出現先增后減的趨勢,雖符合梨小食心蟲成蟲期的消長規(guī)律,但沒有精確反映出高峰期。由于對照組使用的是Z8-12:Ac足量的新誘芯,而試驗組因持續(xù)揮發(fā)使得誘芯中Z8-12:Ac含量衰減,所以導致高峰期測報模糊。說明熒光猝滅法測定誘芯中性誘劑含量可用于考查田間誘芯含量的變化情況,以便校正測報信息。

    表2 田間試驗結果(n=3)Table 2 Determination results in the field (n=3)

    3 討論

    梨小食心蟲性誘劑的主要成分為Z8-12:Ac,本文基于熒光猝滅法對誘芯中Z8-12:Ac的含量進行了測定。β-CD-NR體系中加入 Z8-12:Ac后,熒光強度降低,推測原因可能是因為在β-CD-NR包合物體系中加入Z8-12:Ac后,致使中性紅從β-CD的疏水空腔擠出,導致體系的熒光強度降低;而且隨著Z8-12:Ac加入量的增大,置換出的中性紅越來越多,則生成的β-CD與Z8-12:Ac的包合物越多,體系熒光猝滅程度越大。利用Z8-12:Ac濃度與熒光猝滅值之間的線性關系來測定Z8-12:Ac含量,檢出限為1.25×10-5mol/L,建立了一種新型測定 Z8-12:Ac的方法,本方法具有熒光體系穩(wěn)定、分析成本低、操作簡便的特點。梨小性誘芯中Z8-12:Ac的含量可用氣相色譜法測定[22],但由于氣相色譜法屬于痕量分析,進樣量較小,使得測定結果精密度不好,而本試驗方法學驗證相對標準偏差RSD為±1.5%,表明方法靈敏度和精密度好。目前關于Z8-12:Ac的測定檢出限尚未見報道,本試驗得出其檢出限為 1.25×10-5mol/L(S/N=3),可滿足誘芯中含量的測定。誘芯中活性成分的含量與田間監(jiān)測、蟲情預報和誘殺效果有關,所以在實際應用中對誘芯含量的測定十分重要。

    使用昆蟲性信息素來防治害蟲,既環(huán)保又有好的防治效果,會在以后大量推廣。本試驗方法可為其他種類的性信息素測定提供思路。但尚有很多問題需要解決:1、提取方法和溶劑還需要改進和完善;2、采用熒光猝滅法定量分析Z8-12:Ac時,雖然穩(wěn)定性比氣相色譜好,但還是達不到氣相色譜法或氣相色譜-質譜法的靈敏度[21,22],因此下一步工作可以嘗試使用其他β-CD的衍生物或者使用其他熒光試劑進行熒光猝滅試驗,來提高熒光猝滅法測定的靈敏度,為性誘芯的實際測定提供更準確靈敏的方法依據;3、雖然此方法可以進行含量測定,但所建立的工作曲線的線性范圍還較小,在濃度太高(5.0×10-4~1.0×10-3mol/mL)或者太低(1.0×10-5~7.0×10-5mol/mL)時,熒光猝滅值ΔF和Z8-12:Ac的濃度c有線性關系但其線性相關性較差,回歸系數僅為0.9233和0.9125,不滿足分析方法的要求,因此關于工作曲線的線性范圍還需要進一步的深入研究。

    猜你喜歡
    食心蟲緩沖溶液中性
    桃小食心蟲對桃樹的危害及無公害防治
    河北果樹(2020年2期)2020-05-25 06:58:28
    幾種緩沖溶液簡介及應用*
    化學與粘合(2020年6期)2020-03-08 09:06:30
    英文的中性TA
    基礎化學緩沖溶液教學難點總結
    科技視界(2017年25期)2017-12-11 20:30:32
    高橋愛中性風格小配飾讓自然相連
    FREAKISH WATCH極簡中性腕表設計
    梨小食心蟲性信息素在測報和防治上的應用
    浙江柑橘(2016年2期)2016-03-11 20:12:46
    一株中性內切纖維素酶產生菌的分離及鑒定
    性誘劑在梨小食心蟲和蘋果蠹蛾測報中的應用
    迷向法防治梨小食心蟲效果研究
    黑人高潮一二区| 成人性生交大片免费视频hd| 99久国产av精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 舔av片在线| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 联通29元200g的流量卡| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 搞女人的毛片| 欧美97在线视频| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品女同一区二区软件| 日韩亚洲欧美综合| 国产单亲对白刺激| 久久久久国产网址| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 级片在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产成人freesex在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| 三级国产精品片| 国产精品野战在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产亚洲91精品色在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 简卡轻食公司| 亚洲国产成人一精品久久久| 国内精品一区二区在线观看| 中文欧美无线码| 91久久精品国产一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 麻豆成人av视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久草成人影院| 男人狂女人下面高潮的视频| 成人亚洲精品av一区二区| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 好男人在线观看高清免费视频| av国产久精品久网站免费入址| 一级毛片久久久久久久久女| 国产精品日韩av在线免费观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本一本二区三区精品| 亚洲中文字幕日韩| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 国产伦精品一区二区三区四那| 国产色爽女视频免费观看| 人妻系列 视频| 亚洲国产色片| 免费搜索国产男女视频| 精品久久久久久成人av| 中文字幕久久专区| 国产伦精品一区二区三区四那| 成人午夜精彩视频在线观看| 99热精品在线国产| 国产色婷婷99| 欧美bdsm另类| 国内精品宾馆在线| 久久久色成人| 晚上一个人看的免费电影| 1000部很黄的大片| 亚洲av.av天堂| 91久久精品电影网| 九九热线精品视视频播放| 禁无遮挡网站| 欧美高清性xxxxhd video| 99热精品在线国产| 日韩成人伦理影院| 夜夜爽夜夜爽视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 寂寞人妻少妇视频99o| 国产乱人视频| 国产高潮美女av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人午夜高清在线视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产乱人视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 99热这里只有是精品50| 蜜臀久久99精品久久宅男| 综合色丁香网| 1024手机看黄色片| 亚洲精品456在线播放app| 国产中年淑女户外野战色| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久性生活片| 女人被狂操c到高潮| 99热这里只有精品一区| 国产精品国产高清国产av| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产成人精品久久久久久| 亚洲av福利一区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品野战在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 欧美三级亚洲精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 久久鲁丝午夜福利片| 日韩欧美精品v在线| 成人午夜高清在线视频| 亚洲在线自拍视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99热网站在线观看| 欧美bdsm另类| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品伦人一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲怡红院男人天堂| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲在线自拍视频| 男人舔奶头视频| 一级毛片电影观看 | 国内精品宾馆在线| 国产人妻一区二区三区在| 国产精品伦人一区二区| 欧美人与善性xxx| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产色片| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费观看性生交大片5| 久久久国产成人免费| 亚洲人与动物交配视频| 欧美成人午夜免费资源| 国产成人freesex在线| 热99在线观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| av在线亚洲专区| 日韩中字成人| 国产片特级美女逼逼视频| 97超碰精品成人国产| av国产免费在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久人人爽人人片av| 国产91av在线免费观看| 国内精品美女久久久久久| 色哟哟·www| 国产亚洲一区二区精品| 免费观看在线日韩| 一级毛片久久久久久久久女| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩av不卡免费在线播放| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 国产美女午夜福利| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久久久久久久中文| 亚洲人成网站在线观看播放| 男人舔奶头视频| 免费搜索国产男女视频| 在线播放无遮挡| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美色视频一区免费| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产精品av视频在线免费观看| 能在线免费看毛片的网站| 久久久久性生活片| 亚洲精品456在线播放app| 国产乱人偷精品视频| 国产成人精品一,二区| 在线a可以看的网站| 高清av免费在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 1000部很黄的大片| 久久午夜福利片| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 午夜精品在线福利| 国产探花极品一区二区| 国产色婷婷99| 国产高清不卡午夜福利| 日本午夜av视频| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久久久久中文| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧洲国产日韩| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久人人爽人人片av| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产高清在线一区二区三| av在线天堂中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 日本色播在线视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 最近的中文字幕免费完整| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品国产三级专区第一集| or卡值多少钱| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 精品人妻熟女av久视频| 人体艺术视频欧美日本| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲无线观看免费| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 干丝袜人妻中文字幕| 国产午夜精品一二区理论片| 日日啪夜夜撸| 美女内射精品一级片tv| 看片在线看免费视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 久久久a久久爽久久v久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲欧美清纯卡通| 99久久九九国产精品国产免费| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 成人鲁丝片一二三区免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| av视频在线观看入口| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 好男人视频免费观看在线| 在线播放国产精品三级| 欧美区成人在线视频| 日日撸夜夜添| 嫩草影院入口| 国产乱人偷精品视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本一二三区视频观看| av福利片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成人精品婷婷| 午夜久久久久精精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本色播在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产69精品久久久久777片| 亚洲经典国产精华液单| 免费大片18禁| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产色爽女视频免费观看| 精品久久久久久久久亚洲| 热99re8久久精品国产| 高清午夜精品一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 成人综合一区亚洲| 欧美精品一区二区大全| 色吧在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 麻豆av噜噜一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 看片在线看免费视频| 禁无遮挡网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产亚洲精品av在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 男女视频在线观看网站免费| 午夜福利成人在线免费观看| 岛国毛片在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产乱人偷精品视频| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美性感艳星| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产亚洲91精品色在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久久久久久久成人| 亚洲伊人久久精品综合 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 一区二区三区高清视频在线| www.色视频.com| 久久久久网色| 免费人成在线观看视频色| 免费看a级黄色片| 国产在视频线精品| 国产精品一二三区在线看| 久久99热6这里只有精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 永久免费av网站大全| 亚洲欧洲日产国产| 国产单亲对白刺激| 欧美一区二区精品小视频在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产男人的电影天堂91| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲av中文av极速乱| 国产精华一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 天堂影院成人在线观看| 美女大奶头视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩综合久久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 最新中文字幕久久久久| 乱系列少妇在线播放| 国产探花极品一区二区| 国产男人的电影天堂91| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久久久九九精品影院| 成人欧美大片| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲综合精品二区| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 三级国产精品欧美在线观看| 高清av免费在线| 国产精品蜜桃在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日韩成人av中文字幕在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 最后的刺客免费高清国语| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品久久久久久久电影| or卡值多少钱| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产午夜福利久久久久久| 国产在线一区二区三区精 | 精品熟女少妇av免费看| 免费看a级黄色片| 成人无遮挡网站| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本五十路高清| 秋霞在线观看毛片| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品,欧美精品| 国产乱来视频区| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧洲日产国产| 直男gayav资源| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚州av有码| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲成av人片在线播放无| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久韩国三级中文字幕| a级一级毛片免费在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产视频内射| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产91av在线免费观看| 亚洲综合色惰| 久久久精品大字幕| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品野战在线观看| 亚州av有码| 亚洲不卡免费看| 午夜日本视频在线| av卡一久久| 国产午夜精品论理片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 水蜜桃什么品种好| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| av在线亚洲专区| 观看美女的网站| 特级一级黄色大片| 狠狠狠狠99中文字幕| 女人久久www免费人成看片 | 看十八女毛片水多多多| 国产在视频线精品| 永久免费av网站大全| 午夜精品在线福利| 网址你懂的国产日韩在线| 嫩草影院精品99| 免费看日本二区| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品,欧美精品| 少妇熟女欧美另类| 国产 一区精品| 如何舔出高潮| 精品一区二区免费观看| 男女那种视频在线观看| 97在线视频观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲最大成人中文| 六月丁香七月| 一个人看的www免费观看视频| 国产视频首页在线观看| 日韩一区二区三区影片| 欧美+日韩+精品| 99热网站在线观看| 午夜激情欧美在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 性色avwww在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 只有这里有精品99| 一级黄片播放器| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久草成人影院| 欧美bdsm另类| 秋霞在线观看毛片| 91av网一区二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 1000部很黄的大片| 欧美性感艳星| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久人妻av系列| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美激情在线99| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲乱码一区二区免费版| 99久久精品国产国产毛片| 国产淫语在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 麻豆乱淫一区二区| 久久久亚洲精品成人影院| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久欧美国产精品| 99热网站在线观看| 直男gayav资源| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 欧美精品国产亚洲| 精品久久久噜噜| 国产精品三级大全| 天天一区二区日本电影三级| 久久久久九九精品影院| 亚洲精品自拍成人| 欧美极品一区二区三区四区| 美女黄网站色视频| 成人一区二区视频在线观看| or卡值多少钱| 黄色配什么色好看| 午夜免费激情av| 中文天堂在线官网| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 免费在线观看成人毛片| 欧美精品一区二区大全| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品一区二区性色av| 在现免费观看毛片| av在线蜜桃| 成人无遮挡网站| 黄色日韩在线| 变态另类丝袜制服| 久久久久久久久久久丰满| 男女下面进入的视频免费午夜| 韩国av在线不卡| 91久久精品电影网| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 91精品一卡2卡3卡4卡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 色视频www国产| 国产伦精品一区二区三区视频9| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美一区二区亚洲| 在线a可以看的网站| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品成人久久久久久| 成年免费大片在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产极品天堂在线| 久久久色成人| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产亚洲av嫩草精品影院| 身体一侧抽搐| 春色校园在线视频观看| 最近中文字幕2019免费版| 97热精品久久久久久| 搞女人的毛片| 色综合站精品国产| 成人欧美大片| 国产精品人妻久久久影院| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲av男天堂| 欧美日本视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 永久网站在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品熟女少妇av免费看| 最近手机中文字幕大全| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲精品乱久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美激情久久久久久爽电影| 99国产精品一区二区蜜桃av| 大话2 男鬼变身卡| 99热这里只有是精品在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 少妇的逼水好多| 亚洲精品影视一区二区三区av| 成人毛片60女人毛片免费| 久热久热在线精品观看| 国产精品人妻久久久影院| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 禁无遮挡网站| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 99久久精品热视频| 国产色爽女视频免费观看| 久久久久久久久久黄片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人三级黄色视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 精品久久久久久成人av| 精品久久久久久久久av| 国产毛片a区久久久久| 日本欧美国产在线视频| 免费观看a级毛片全部| 久久人妻av系列| 免费大片18禁| 身体一侧抽搐| 又爽又黄无遮挡网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一二三四中文在线观看免费高清| av.在线天堂| 久久精品夜色国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲欧美日韩高清专用| 97超碰精品成人国产| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 综合色av麻豆| 国产精品不卡视频一区二区| 一夜夜www| 日韩欧美在线乱码| 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人福利小说| 免费av不卡在线播放| 三级国产精品片| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久久久久久成人| 99在线视频只有这里精品首页| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产在线男女| 最后的刺客免费高清国语| 国产成人精品久久久久久| 51国产日韩欧美| 美女大奶头视频| 国产精品永久免费网站| 日韩欧美 国产精品| 亚洲av熟女| 大香蕉久久网| av在线播放精品| 精品国产露脸久久av麻豆 | 男女国产视频网站| 色网站视频免费| 色视频www国产| 长腿黑丝高跟| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 午夜激情福利司机影院| 国产精品一及| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲国产精品成人久久小说| 色噜噜av男人的天堂激情| 赤兔流量卡办理| 美女cb高潮喷水在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲最大成人手机在线| 日韩人妻高清精品专区| 51国产日韩欧美| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品伦人一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 丝袜喷水一区| 国国产精品蜜臀av免费| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲高清免费不卡视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 老司机福利观看| 色哟哟·www| 日本免费在线观看一区| 一级av片app| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美人与善性xxx|