• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光猝滅法測定梨小食心蟲性誘劑含量以及田間應用

    2021-04-21 08:35:50杜少芳荊小院馬瑞燕劉金龍
    中國生物防治學報 2021年2期
    關鍵詞:食心蟲緩沖溶液中性

    竇 蕊,杜少芳,王 洋,荊小院,馬瑞燕,劉金龍*

    (1.山西農業(yè)大學基礎部/化學生態(tài)研究所,太谷 030801;2.山西農業(yè)大學植物保護學院,太谷 030801)

    隨著我國農業(yè)產業(yè)結構調整,果樹的種植品種增多,數量增加,果園作為新型產業(yè)逐漸興起,與此同時,果園害蟲的侵害情況也日趨嚴重,其中為害最為嚴重的是梨小食心蟲。梨小食心蟲GrapholithamolestaBusck又名梨小蛀果蛾、東方果蠹蛾、桃折梢蟲等,簡稱“梨小”,屬鱗翅目Lepidoptera 卷葉蛾科 Tortricidae,是一種世界性的果樹害蟲,主要以幼蟲蛀食梨、桃、蘋果、油桃、櫻桃等多種仁果類和核果類果樹的果實或新梢[1,2]。近年來,利用昆蟲性引誘劑來防治害蟲的方法受到廣泛推崇[3-5]。昆蟲性引誘劑可以用來監(jiān)測、誘殺和干擾交配等[6-8],具有高效、無毒、無污染、不傷害天敵昆蟲等優(yōu)點[9-13],昆蟲性信息素的相關研究和應用倍受國內外學者重視[14]。

    在利用性引誘劑防治梨小食心蟲的工作中[15-17],使用較多的是載有性引誘劑的反口橡皮塞誘芯。誘芯中的主要活性成分是順-8-十二碳烯醇乙酸酯(Z8-12:Ac),該化合物易揮發(fā)且不易溶于水[18],其揮發(fā)量易受風速、溫度、天氣狀況等外界條件的影響。性引誘劑的揮發(fā)量會直接影響到誘蟲量[19,20],影響誘捕效果。為了獲得較好的誘捕效果和精確的監(jiān)測信息,必須要了解性誘芯在實際應用中活性成分的殘留量與釋放速率。目前對誘芯中性引誘劑含量的測定主要依靠氣相色譜法[21,22],少有文獻報道其他有效的分析方法。

    本文試圖建立一種新方法,可用于測定梨小誘芯中Z8-12:Ac的含量。因為在堿性條件下,熒光物質中性紅(NR)與β-環(huán)糊精(β-CD)形成包合物[23],使得中性紅的熒光強度增強,又因為在相同條件下,β-CD也可與Z8-12:Ac形成包合物[24],而且預試驗證明β-CD與Z8-12:Ac的包合能力強于其與NR的包合能力,所以會產生競爭包合作用而導致熒光猝滅現象?;谝陨习细偁幵恚疚脑?NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中首先形成β-CD-NR包合物,接著加入一定量的Z8-12:Ac溶液,測定熒光猝滅程度。根據熒光猝滅程度和Z8-12:Ac濃度間的關系,利用熒光猝滅法來測定Z8-12:Ac的含量,并將其應用于田間誘芯活性成分的測定。本文可為蟲情監(jiān)測預報的精確性以及性誘芯的誘殺效果提供技術手段,避免因活性成分衰減而導致測報信息出現偏差。

    1 材料與方法

    1.1 儀器試劑

    RF5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司);PHS-3C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠);SK5200H超聲波清洗器(上??茖С晝x器有限公司);AR224CN型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

    β-環(huán)糊精(β-CD,上海金穗生物科技有限公司),經沸水重結晶兩次;中性紅(NR,上海金穗生物科技有限公司);梨小食心蟲性誘劑 Z8-12:Ac(本實驗室自主合成,色譜檢驗質量分數為 92%[25]);乙醇(體積分數95%);梨小食心蟲誘芯(中國科學院動物研究所研制生產,含96個單體的橡膠板,單個約重0.300~0.5000 g),其他試劑均為分析純。

    1.2 熒光測定方法

    依次準確移取7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.4)、1.0 mL 1.0×10-3mol/L中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液于25.0 mL容量瓶中,搖勻靜置10 min后,加入一定量的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac溶液,或5.0 mL待測試液,雙蒸水定容,搖勻,在超聲波清洗器中超聲反應20 min,然后放置于冰箱中冷卻到4 ℃,待上機測定。

    在激發(fā)波長為460 nm,發(fā)射波長為580 nm,在此條件下分別測定各試液的熒光強度F,以及Z8-12:Ac空白熒光強度F0,經ΔF=F0—F計算出熒光猝滅值。激發(fā)和發(fā)射光譜通帶寬度均為5.0 nm。

    1.3 誘芯樣品液的制備

    分別取未使用的和在室外放置14 d的梨小食心蟲誘芯各7個,用刀片把每個誘芯切成厚度約1 mm的碎片,并分別轉移到具塞三角瓶內,加入30.0 mL乙醇(95%,分析純),搖勻后在30 ℃水浴中放置2 h,使誘芯中的Z8-12:Ac盡可能溶解到溶劑中[26]。提取完畢后,移液管抽取上層清液,經0.45 μm微孔濾膜過濾轉移入樣品瓶中,標記為樣品液1和樣品液2,旋緊瓶蓋避光保存待測。

    1.4 加標回收試驗方法

    按1.2的方法分別配制β-CD-NR體系溶液于兩個容量瓶中,均加入5.0 mL的樣品液1,向其中一份加入5.0 mL 1×10-4mol/L的Z8-12:Ac標準溶液,均定容至25.0 mL,分別測定其熒光強度猝滅值ΔF,由線性關系計算濃度。根據下式計算加標回收率。樣品液2用同樣的方法處理。加標回收率=(加標試樣測定值—試樣測定值)/加標量×100%

    1.5 田間試驗

    田間誘蛾試驗地點選在山西省太谷縣西山底村的桃園。試驗樹種為桃樹,樹齡 20~25年生,株行距為 4 m×4.5 m。誘捕器為三角形誘捕器(24 cm×18 cm×18 cm)[27]。在誘捕器內部底面平鋪一塊長方形(23 cm×17 cm)粘蟲板,將梨小食心蟲誘芯以細鐵絲固定后懸掛于粘蟲板上方。誘捕時,將誘捕器由鐵絲從上棱穿入,懸掛于樹枝遮蔽處,距離地面高度約為1.5 m,誘捕器間隔20 m 以上。根據地形和桃樹分布情況,劃分試驗小區(qū)。1個試驗小區(qū)共放置6個誘捕器,選擇其中1個誘捕器為對照(每次記錄后需替換未釋放的新誘芯),其余5個為持續(xù)釋放試驗。設置3個小區(qū)為重復。每天定時記錄誘蟲量并更換粘蟲板。設置釋放時間分別為0、7、14、21、28 d,每天統(tǒng)計各個水平處理的誘蛾量,收集各處理水平的試驗誘芯,密封保存,待測。

    分別取3個同一處理水平的待測誘芯,按本文1.3的方法制備樣品液。

    1.6 數據統(tǒng)計與分析

    用 SPSS 16.0軟件進行數據處理與分析;各處理的平均值采用Duncan氏多重比較法檢驗差異顯著性。

    2 結果與分析

    2.1 Z8-12:Ac對β-CD-NR體系熒光強度的影響

    從圖1激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜(b)可以看出,在堿性緩沖溶液中,中性紅(NR)水溶液的熒光強度較弱,其最大激發(fā)波長為556 nm、最大發(fā)射波長為605 nm;當加入適量的β-CD后,熒光強度明顯增大,其最大激發(fā)波長藍移至460 nm,最大發(fā)射波長顯著藍移至580 nm,說明β-CD對體系有熒光增敏作用;在NR與β-CD的包合物溶液中加入Z8-12:Ac后,熒光強度降低,其中發(fā)射熒光強度降低幅度較大。并且Z8-12:Ac的加入量越大,體系熒光猝滅程度越明顯。故本試驗根據Z8-12:Ac的濃度與發(fā)射熒光強度的猝滅值ΔF之間的相關性,使用工作曲線法測定Z8-12:Ac的含量。

    圖1 激發(fā)光譜(a)與發(fā)射光譜(b)(pH 7.4)Fig.1 Excitation spectra (a) and emission spectra (b) (pH 7.4)

    2.2 測定條件的優(yōu)化

    2.2.1 緩沖溶液的選擇 因為在酸性緩沖溶液中β-CD不與質子態(tài)的中性紅形成包合物,故按上述試驗方法主要考察了弱堿緩沖溶液下的Tris-HCl緩沖溶液、KH2PO4-NaOH緩沖溶液、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液和Britton-Robinson廣泛緩沖溶液對體系熒光猝滅強度的影響,每個緩沖溶液做3個重復,測定結果見圖2。NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中體系的ΔF比其他3種緩沖溶液的ΔF大且差異顯著,故選擇NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液作為體系介質。

    圖2 不同的緩沖溶液對應的體系的ΔF值Fig.2 ΔF values of corresponding systems for different buffer media

    2.2.2 pH及緩沖溶液體積的影響 分別選用了pH為7.0~8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液進行試驗。隨pH的增大,體系的ΔF增大。在pH為7.4時,ΔF有最大值29.035±0.28;之后隨著緩沖液pH的增大,體系的ΔF逐漸減小,因此選定pH為7.4(圖3)。

    圖3 不同的pH對應體系的ΔF值Fig.3 ΔF values of corresponding systems for different pH

    試驗分別選擇了1.0~9.0 mL不同體積的pH 7.4的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液,按上述步驟進行試驗。隨緩沖溶液用量的增加,體系的ΔF逐漸增大,在加入7.0 mL時,ΔF達到最大26.835±0.425,繼續(xù)增大體積后,ΔF反而有所減小,因此選定緩沖溶液用量為7.0 mL(圖4)。

    圖4 緩沖溶液的不同體積對應體系的ΔF值Fig.4 ΔF values of corresponding systems with different volumes of buffer solution

    2.2.3β-CD用量的影響 取7個25.0 mL容量瓶,分別加入1.0~7.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液,1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液,每個體積做3次重復。隨著β-CD加入量的增大,其熒光猝滅作用增強。當β-CD的用量為5.0 mL時,體系有最大ΔF值為53.825±0.56,β-CD的用量繼續(xù)增加時ΔF值反而減小,故選擇β-CD溶液的用量為5.0 mL 1.0×10-2mol/L(圖5)。

    圖5 不同用量的β-CD對應體系的ΔF值Fig.5 ΔF values of β-CD with different dosage

    2.2.4 中性紅用量的影響 取7個25.0 mL容量瓶,分別加入0.20~1.40 mL的1.0×10-3mol/L NR溶液,1.0 mL 5.0×10-3mol/L的Z8-12:Ac乙醇溶液,再加入其他試劑,雙蒸餾水加至刻度線定容,按試驗方法充分反應后測定熒光強度,每個劑量做3次重復。隨著中性紅用量的增加,其ΔF逐漸增大,當中性紅的用量為1.0 mL時,體系的ΔF值最大,為30.016±0.563。繼續(xù)加入中性紅其ΔF又逐漸減小,故選擇中性紅用量為1.0 mL 1.0×10-3mol/L(圖6)。

    圖6 不同用量的NR對應體系的ΔF值Fig.6 ΔF values of NR with different dosage

    2.2.5 超聲時間的影響 按上述試驗步驟進行試驗,探究不同超聲時間對體系ΔF的影響。超聲反應20 min,ΔF值最大為29.53±0.238,而且體系穩(wěn)定,故選擇超聲時間為20 min(圖7)。

    圖7 不同反應時間對應體系的ΔF值Fig.7 ΔF values of corresponding systems with different reaction time

    2.2.6 體系的穩(wěn)定時間 超聲反應結束后會出現體系變渾濁的現象,不利于光度法測定。因此,將體系置于4 ℃冰箱中,并分別設計了10、20、30、40、50、60 min的冷卻時間,每個時間設置3個重復,分別測定其熒光猝滅值,可以看出在4 ℃冷卻時,體系熒光猝滅值ΔF在20 min左右變化達到最大,為60.071±0.318,并且體系在60 min內保持穩(wěn)定(圖8)。

    圖8 不同穩(wěn)定時間對應體系的ΔF值(4 ℃)Fig.8 ΔF value of corresponding systems with different stability time(4 ℃)

    經過以上條件優(yōu)化試驗,熒光猝滅法測定Z8-12:AC的最佳條件為:7.0 mL 0.2 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH 7.4)、1.0 mL 1.0×10-3mol/L的中性紅溶液、5.0 mL 1.0×10-2mol/L的β-CD溶液于25.0 mL容量瓶中,搖勻靜置10 min后,加入一定量的Z8-12:Ac溶液或待測液,定容,搖勻,在超聲波清洗器中超聲反應20 min,然后放置到4 ℃下冷卻20 min,上機測定。

    2.3 方法學檢驗

    2.3.1 線性范圍及檢出限 在7個25.0 mL容量瓶中按上述方法要求分別加入相應反應液后,依次準確加入0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL的5.0×10-3mol/L Z8-12:Ac標準溶液,定容至25.0 mL,使體系中 Z8-12:Ac 的含量依次為 1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4、3.0×10-4、3.5×10-4、4.0×10-4mol/L。按照上述優(yōu)化條件處理后,分別測定其熒光強度,并計算出相應的熒光猝滅值ΔF。通過線性回歸方程計算,表明體系的熒光猝滅值ΔF與Z8-12:Ac含量在1.0×10-4~4.0×10-4mol/L濃度范圍內,呈現良好的線性關系,其線性方程為ΔF=28.3c-16.8,R2=0.9978(圖9)。

    圖9 Z8-12:Ac的標準曲線Fig.9 Standard curve of Z8-12:Ac

    對2.0×10-4mol/L的Z8-12:Ac標準溶液進行11次平行測定,得出其檢出限為1.25×10-5mol/L(S/N=3)。相對標準偏差 RSD為±1.5%,表明方法的靈敏度和精密度良好。

    2.3.2 干擾物質的影響 當Z8-12:Ac的濃度為2×10-4mol/L時,相對誤差不超過±5%的條件下,按本試驗方法考察了以下各干擾物質的允許量(以倍數計),分別是:K+(50)、Na+(50)、Ca2+(50)、Mg2+(50)、NH4+(50)、NO3-(50)、果糖(25)、葡萄糖(50)、甘油(50)。

    2.3.3 加標回收率 準確移取兩個樣品待測液5.0 mL,按試驗方法測定Z8-12:Ac的含量,并按照方法1.4進行加標回收試驗。可以看出兩個樣品的加標回收率分別為 98%和 103.0%,均在誤差允許范圍內,說明測定方法準確度較好(表1)。

    表1 樣品中Z8-12:Ac含量的測定結果(n=3)Table 1 Determination results of Z8-12:Ac in samples (n=3)

    2.4 田間試驗結果

    不同處理水平下,梨小食心蟲誘芯在田間的誘蟲量統(tǒng)計分析和Z8-12:Ac含量的測定結果見表2??梢钥闯觯囼灲M單個誘芯中Z8-12:Ac平均含量,在不同天數處理下差異顯著,說明誘芯在使用中其活性成分含量持續(xù)衰減,符合性誘劑的理化特性。對照組單個誘芯7 d誘蛾總量在各個處理間差異顯著,在整個田間試驗(28 d)出現先增后減的趨勢,符合梨小食心蟲成蟲期的消長規(guī)律,而且羽化高峰期出現在第14~21 d。試驗組單個誘芯7 d誘蛾總量在處理3和處理4之間差異不顯著,與其他處理差異顯著,整個田間試驗期間(28 d)也出現先增后減的趨勢,雖符合梨小食心蟲成蟲期的消長規(guī)律,但沒有精確反映出高峰期。由于對照組使用的是Z8-12:Ac足量的新誘芯,而試驗組因持續(xù)揮發(fā)使得誘芯中Z8-12:Ac含量衰減,所以導致高峰期測報模糊。說明熒光猝滅法測定誘芯中性誘劑含量可用于考查田間誘芯含量的變化情況,以便校正測報信息。

    表2 田間試驗結果(n=3)Table 2 Determination results in the field (n=3)

    3 討論

    梨小食心蟲性誘劑的主要成分為Z8-12:Ac,本文基于熒光猝滅法對誘芯中Z8-12:Ac的含量進行了測定。β-CD-NR體系中加入 Z8-12:Ac后,熒光強度降低,推測原因可能是因為在β-CD-NR包合物體系中加入Z8-12:Ac后,致使中性紅從β-CD的疏水空腔擠出,導致體系的熒光強度降低;而且隨著Z8-12:Ac加入量的增大,置換出的中性紅越來越多,則生成的β-CD與Z8-12:Ac的包合物越多,體系熒光猝滅程度越大。利用Z8-12:Ac濃度與熒光猝滅值之間的線性關系來測定Z8-12:Ac含量,檢出限為1.25×10-5mol/L,建立了一種新型測定 Z8-12:Ac的方法,本方法具有熒光體系穩(wěn)定、分析成本低、操作簡便的特點。梨小性誘芯中Z8-12:Ac的含量可用氣相色譜法測定[22],但由于氣相色譜法屬于痕量分析,進樣量較小,使得測定結果精密度不好,而本試驗方法學驗證相對標準偏差RSD為±1.5%,表明方法靈敏度和精密度好。目前關于Z8-12:Ac的測定檢出限尚未見報道,本試驗得出其檢出限為 1.25×10-5mol/L(S/N=3),可滿足誘芯中含量的測定。誘芯中活性成分的含量與田間監(jiān)測、蟲情預報和誘殺效果有關,所以在實際應用中對誘芯含量的測定十分重要。

    使用昆蟲性信息素來防治害蟲,既環(huán)保又有好的防治效果,會在以后大量推廣。本試驗方法可為其他種類的性信息素測定提供思路。但尚有很多問題需要解決:1、提取方法和溶劑還需要改進和完善;2、采用熒光猝滅法定量分析Z8-12:Ac時,雖然穩(wěn)定性比氣相色譜好,但還是達不到氣相色譜法或氣相色譜-質譜法的靈敏度[21,22],因此下一步工作可以嘗試使用其他β-CD的衍生物或者使用其他熒光試劑進行熒光猝滅試驗,來提高熒光猝滅法測定的靈敏度,為性誘芯的實際測定提供更準確靈敏的方法依據;3、雖然此方法可以進行含量測定,但所建立的工作曲線的線性范圍還較小,在濃度太高(5.0×10-4~1.0×10-3mol/mL)或者太低(1.0×10-5~7.0×10-5mol/mL)時,熒光猝滅值ΔF和Z8-12:Ac的濃度c有線性關系但其線性相關性較差,回歸系數僅為0.9233和0.9125,不滿足分析方法的要求,因此關于工作曲線的線性范圍還需要進一步的深入研究。

    猜你喜歡
    食心蟲緩沖溶液中性
    桃小食心蟲對桃樹的危害及無公害防治
    河北果樹(2020年2期)2020-05-25 06:58:28
    幾種緩沖溶液簡介及應用*
    化學與粘合(2020年6期)2020-03-08 09:06:30
    英文的中性TA
    基礎化學緩沖溶液教學難點總結
    科技視界(2017年25期)2017-12-11 20:30:32
    高橋愛中性風格小配飾讓自然相連
    FREAKISH WATCH極簡中性腕表設計
    梨小食心蟲性信息素在測報和防治上的應用
    浙江柑橘(2016年2期)2016-03-11 20:12:46
    一株中性內切纖維素酶產生菌的分離及鑒定
    性誘劑在梨小食心蟲和蘋果蠹蛾測報中的應用
    迷向法防治梨小食心蟲效果研究
    99国产精品一区二区蜜桃av| 91成人精品电影| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美丝袜亚洲另类 | 天堂动漫精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成+人综合+亚洲专区| 少妇的丰满在线观看| 欧美在线一区亚洲| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 色播在线永久视频| 免费看日本二区| 日韩有码中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 国产国语露脸激情在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| 久9热在线精品视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产又色又爽无遮挡免费看| 精品一区二区三区av网在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 热re99久久国产66热| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日本一区二区免费在线视频| 最近最新免费中文字幕在线| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产在线观看jvid| 老汉色∧v一级毛片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 91老司机精品| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 日本 欧美在线| 久久久精品欧美日韩精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线视频色国产色| 日韩欧美 国产精品| 少妇 在线观看| 成人精品一区二区免费| 久久伊人香网站| 免费看日本二区| 操出白浆在线播放| 一区二区三区精品91| 日本a在线网址| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产av在哪里看| 在线观看免费视频日本深夜| 国产成+人综合+亚洲专区| 男女那种视频在线观看| 校园春色视频在线观看| 成人国语在线视频| bbb黄色大片| 精品欧美国产一区二区三| 91国产中文字幕| 99riav亚洲国产免费| 精品久久久久久久末码| 夜夜爽天天搞| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久中文字幕一级| av有码第一页| www.999成人在线观看| 88av欧美| 亚洲av成人av| 99在线人妻在线中文字幕| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 丁香欧美五月| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 嫩草影视91久久| 成人av一区二区三区在线看| 国产成人欧美| 日韩欧美 国产精品| 不卡一级毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 日本免费一区二区三区高清不卡| 精品国产亚洲在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 婷婷亚洲欧美| 又黄又爽又免费观看的视频| 9191精品国产免费久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲午夜理论影院| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜日韩欧美国产| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久青草综合色| 午夜免费鲁丝| 午夜免费鲁丝| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日日夜夜操网爽| 观看免费一级毛片| 午夜久久久久精精品| 精品久久久久久久久久久久久 | netflix在线观看网站| 99国产精品99久久久久| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产熟女xx| 欧美日本视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产免费男女视频| 成人永久免费在线观看视频| 久久伊人香网站| 国产精品永久免费网站| 黄色丝袜av网址大全| 怎么达到女性高潮| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲avbb在线观看| av视频在线观看入口| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久狼人影院| 在线永久观看黄色视频| 美女高潮到喷水免费观看| 色综合站精品国产| videosex国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美日韩乱码在线| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久久久大精品| 91成年电影在线观看| 91成年电影在线观看| av视频在线观看入口| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜精品在线福利| 欧美乱妇无乱码| 99在线视频只有这里精品首页| 精品熟女少妇八av免费久了| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线看三级毛片| 国内精品久久久久久久电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| xxxwww97欧美| 国产亚洲欧美98| 色综合欧美亚洲国产小说| www.熟女人妻精品国产| 国产精品野战在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产亚洲av高清不卡| 国产午夜福利久久久久久| 免费在线观看影片大全网站| 最好的美女福利视频网| www.自偷自拍.com| 在线视频色国产色| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费高清在线观看日韩| av视频在线观看入口| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 伦理电影免费视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品野战在线观看| 国产亚洲精品av在线| 亚洲一区中文字幕在线| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 一a级毛片在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 黄色女人牲交| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 成人免费观看视频高清| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日日干狠狠操夜夜爽| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 好男人在线观看高清免费视频 | 在线观看66精品国产| 精品国产亚洲在线| 亚洲真实伦在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲av第一区精品v没综合| 99久久精品国产亚洲精品| 1024香蕉在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲久久久国产精品| АⅤ资源中文在线天堂| 久久久久久久午夜电影| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品 国内视频| 可以在线观看的亚洲视频| 校园春色视频在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 国产精品免费一区二区三区在线| 91av网站免费观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 日本黄色视频三级网站网址| 精品电影一区二区在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩乱码在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 搞女人的毛片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 日韩三级视频一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 叶爱在线成人免费视频播放| 69av精品久久久久久| 欧美乱妇无乱码| 亚洲avbb在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲成人精品中文字幕电影| 啦啦啦 在线观看视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久香蕉国产精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 青草久久国产| av片东京热男人的天堂| 久久久久精品国产欧美久久久| 可以在线观看毛片的网站| 女性被躁到高潮视频| 成人av一区二区三区在线看| 免费av毛片视频| 久久中文字幕人妻熟女| 两性夫妻黄色片| 婷婷丁香在线五月| 欧美久久黑人一区二区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲精品色激情综合| 亚洲中文av在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美成狂野欧美在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 91老司机精品| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲av成人av| 18禁美女被吸乳视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 黄片播放在线免费| 欧美性长视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品美女久久av网站| 香蕉av资源在线| 亚洲中文av在线| 国产成人影院久久av| 欧美一级毛片孕妇| 99精品在免费线老司机午夜| 老司机在亚洲福利影院| 91成人精品电影| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费人成视频x8x8入口观看| x7x7x7水蜜桃| 亚洲人成网站高清观看| 国产精品国产高清国产av| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品免费一区二区三区在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 淫妇啪啪啪对白视频| 激情在线观看视频在线高清| 最好的美女福利视频网| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩大码丰满熟妇| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美乱码精品一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 亚洲熟妇熟女久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 91麻豆av在线| 国产熟女xx| 午夜福利高清视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久国内视频| 特大巨黑吊av在线直播 | 久久精品国产清高在天天线| 免费观看人在逋| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | www.熟女人妻精品国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲人成电影免费在线| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 一夜夜www| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 美女免费视频网站| 欧美zozozo另类| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品在线美女| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久香蕉激情| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲五月色婷婷综合| www.999成人在线观看| 国产真实乱freesex| 精品卡一卡二卡四卡免费| www.自偷自拍.com| 国产一区二区激情短视频| 亚洲人成电影免费在线| 99精品在免费线老司机午夜| 男人舔女人的私密视频| 免费观看人在逋| 精品久久蜜臀av无| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久天堂一区二区三区四区| 青草久久国产| 黄色毛片三级朝国网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 极品教师在线免费播放| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本一区二区免费在线视频| 国产熟女xx| 男女下面进入的视频免费午夜 | 免费看日本二区| 国产视频一区二区在线看| 99精品欧美一区二区三区四区| 一级作爱视频免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一区二区三区高清视频在线| 欧美激情高清一区二区三区| 成人三级做爰电影| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久精品人妻少妇| 99在线人妻在线中文字幕| 国产97色在线日韩免费| 成年版毛片免费区| 久久久久久久久久黄片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 老司机深夜福利视频在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 两性夫妻黄色片| 精品高清国产在线一区| 午夜免费成人在线视频| 国产伦人伦偷精品视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久久久亚洲av毛片大全| 色播亚洲综合网| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 老司机在亚洲福利影院| 哪里可以看免费的av片| 欧美一级毛片孕妇| 日本黄色视频三级网站网址| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色av中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| av视频在线观看入口| 黄色a级毛片大全视频| 村上凉子中文字幕在线| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产精品日韩av在线免费观看| 老司机福利观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 丁香六月欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 一区二区三区精品91| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | www国产在线视频色| 久久国产精品影院| 在线天堂中文资源库| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品不卡国产一区二区三区| 天天添夜夜摸| 女人被狂操c到高潮| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久香蕉激情| 热re99久久国产66热| 国产主播在线观看一区二区| 欧美色视频一区免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 在线观看一区二区三区| 黄频高清免费视频| 欧美大码av| 免费看a级黄色片| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产在线精品亚洲第一网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 成人午夜高清在线视频 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一本久久中文字幕| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久亚洲精品不卡| av福利片在线| 9191精品国产免费久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美日韩黄片免| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品午夜福利视频在线观看一区| 丝袜在线中文字幕| 啦啦啦 在线观看视频| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品91蜜桃| 国产黄色小视频在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜影院日韩av| 国产精华一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品野战在线观看| 久久人人精品亚洲av| 日韩av在线大香蕉| 99久久综合精品五月天人人| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲性夜色夜夜综合| www.熟女人妻精品国产| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一本精品99久久精品77| 精品国产亚洲在线| 日韩欧美免费精品| 人人澡人人妻人| 国产真人三级小视频在线观看| 国产真实乱freesex| 久久国产精品影院| 日韩欧美免费精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 波多野结衣av一区二区av| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 一级作爱视频免费观看| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| svipshipincom国产片| 搡老岳熟女国产| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费在线观看影片大全网站| 中亚洲国语对白在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久热这里只有精品99| aaaaa片日本免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 69av精品久久久久久| 久久 成人 亚洲| 黄色女人牲交| 精品日产1卡2卡| 无遮挡黄片免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美成人性av电影在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品乱码久久久久久99久播| 色尼玛亚洲综合影院| 波多野结衣高清无吗| 一本久久中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 特大巨黑吊av在线直播 | 欧美日韩一级在线毛片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲av熟女| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品av久久久久免费| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产主播在线观看一区二区| 在线av久久热| 久久久久久人人人人人| 精品欧美国产一区二区三| 黄色成人免费大全| 丝袜美腿诱惑在线| 人人妻人人看人人澡| 国产精品九九99| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲精品在线观看二区| 精品欧美国产一区二区三| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美在线一区亚洲| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产免费男女视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美黄色淫秽网站| 日本五十路高清| 欧美日韩一级在线毛片| 此物有八面人人有两片| 性欧美人与动物交配| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产久久久一区二区三区| 宅男免费午夜| 久久青草综合色| 久久99热这里只有精品18| 成人亚洲精品av一区二区| 精品人妻1区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲av熟女| 欧美精品啪啪一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 一夜夜www| 欧美激情久久久久久爽电影| 色播亚洲综合网| 超碰成人久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色播在线永久视频| 美女高潮到喷水免费观看| 日本一本二区三区精品| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美国产日韩亚洲一区| 两个人免费观看高清视频| 国产亚洲欧美精品永久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产区一区二久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 好男人电影高清在线观看| 操出白浆在线播放| 悠悠久久av| av福利片在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜老司机福利片| 大型黄色视频在线免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久久久久九九精品二区国产 | 成年人黄色毛片网站| 久久国产精品影院| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 99国产精品一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 丝袜美腿诱惑在线| 99国产精品一区二区三区| 日韩高清综合在线| 国产精品1区2区在线观看.| 久久亚洲真实| 激情在线观看视频在线高清| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美不卡视频在线免费观看 | 丝袜美腿诱惑在线| 国产免费男女视频| cao死你这个sao货| 搡老熟女国产l中国老女人| 丰满的人妻完整版| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜影院日韩av| 大香蕉久久成人网| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲一码二码三码区别大吗| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精华国产精华精| 久久国产精品影院| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 麻豆成人av在线观看| 久久性视频一级片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品欧美国产一区二区三| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人欧美在线观看| 丁香欧美五月| 日韩欧美在线二视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 我的亚洲天堂| 久久久久久大精品| 超碰成人久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 黄色成人免费大全| 一区二区三区精品91| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产一卡二卡三卡精品| xxx96com| 国产精品日韩av在线免费观看|