貝萊斯芽胞桿菌BP-1篩選、鑒定及其對花生網(wǎng)斑病的田間防效評價

臧超群，趙 穎，謝瑾卉，林 英，裴 雪，劉曉舟，梁春浩*

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，沈陽 110161；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，沈陽 110161）

花生ArachishypogaeaL.作為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最主要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物之一，具有悠久的栽培歷史，在我國對外貿(mào)易中所占比重呈上升趨勢[1]。遼寧花生向來以口感好、品質(zhì)佳、且無黃曲霉毒素等諸多優(yōu)點(diǎn)著稱，在國內(nèi)外市場上均有很高盛譽(yù)[2]。近年來，隨著花生價格提高和供給側(cè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，遼寧省花生種植面積逐年加大，成為繼玉米和水稻之后的遼寧省第三大主栽作物[3]?；ㄉW(wǎng)斑病是花生生產(chǎn)中最重要的葉部病害之一，可導(dǎo)致花生大量落葉，一般可造成減產(chǎn)10%～20%，重茬嚴(yán)重地塊可達(dá)30%以上，不僅影響花生產(chǎn)量，而且對其品質(zhì)也產(chǎn)生很大影響[4]。目前，在各花生主產(chǎn)區(qū)，主要依靠化學(xué)藥劑防治該病害。長期使用化學(xué)農(nóng)藥引起的“3R”問題日益突出，利用生防菌制成的生防制劑，不僅能夠防治植物病害，減少產(chǎn)量損失，還可減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量及使用次數(shù)，對保護(hù)環(huán)境和食品安全意義重大。

目前，關(guān)于花生網(wǎng)斑病生物防治的相關(guān)報道較少，且研究不夠深入。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌對花生網(wǎng)斑病具有一定的防控效果，而且能夠促進(jìn)花生生長，在盆栽條件下對花生接種AM真菌摩西球囊霉Glomusmosseae，對網(wǎng)斑病防治效果為10.2%[5]。丁子香酚、申嗪霉素對花生褐斑、黑斑、網(wǎng)斑病菌菌絲生長均有明顯的抑制作用，其EC50值均小于1 mg/L，明顯低于生產(chǎn)上常用化學(xué)藥劑多菌靈的EC50值，具有防治花生葉斑病的潛力[6]。

本文采用稀釋涂布平板法從健康的花生葉片上分離細(xì)菌、真菌、放線菌，利用平板對峙法篩選對花生網(wǎng)斑病菌具有較強(qiáng)抑制效果的菌株，并明確其抑菌譜；根據(jù)形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)以及16S rDNA序列分析，明確其分類地位；根據(jù)農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則設(shè)計試驗，評價其田間防治效果，研究結(jié)果為花生網(wǎng)斑病生防制劑的研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生葉片：從阜新、沈陽、錦州等遼寧花生主產(chǎn)區(qū)采集到健康葉片60份。

供試菌株：辣椒疫霉Phytophthoracapsici、致病疫霉Phytophthorainfestans、灰葡萄孢Botrytiscinerea、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、圓刺盤孢Colletotrichumorbiculare、粉紅單端孢Trichotheciumroseurn、貝林格葡萄座腔菌Botryosphaeriaberengeriana、高粱彎孢菌Curvulariacaryopsida、禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、大斑突臍蠕孢Exserohilumturcicum和落花生尾孢Cercosporaarachidicola均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.2；孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，孟加拉紅0.033 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂15.0 g/L；高氏Ⅰ號培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，可溶性淀粉20.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH 7.2～7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉 15 g/L。

供試藥劑：430 g/L戊唑醇懸浮劑，拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司生產(chǎn)。

1.2 花生葉片微生物的分離與純化

微生物分離方法[7,8]：將采集的花生健康葉片用無菌水洗凈后，剪成2～3 cm 的小塊，無菌水漂洗3 次，置于燒杯中，分別加入200 mL 生理鹽水和0.25 mL吐溫-80，130 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。取沖洗液1 mL，均勻涂布于NA 培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高氏Ⅰ號培養(yǎng)基上，于27 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，待長出菌落后，挑取單菌落分離純化保存。

1.3 花生網(wǎng)斑病生防菌篩選

采用對峙培養(yǎng)法[9]進(jìn)行花生網(wǎng)斑病生防菌的篩選。將篩選獲得的微生物菌株與花生網(wǎng)斑病菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)試驗，先將病原菌轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上，27 ℃培養(yǎng)6 d，用打孔器（Φ=6 mm）在病原菌邊緣打取菌餅，用鑷子夾取菌餅接在PDA培養(yǎng)基平板一側(cè)，在距離菌餅3 cm處接種供試微生物菌株（細(xì)菌、放線菌劃線接種；真菌放置菌餅），27 ℃培養(yǎng)5～7 d，測量微生物與網(wǎng)斑病菌之間抑菌帶寬度，評價微生物對網(wǎng)斑病菌的抑制強(qiáng)弱，每個處理3次重復(fù)。

1.4 菌株BP-1鑒定

1.4.1 菌株BP-1形態(tài)及生理生化鑒定 將菌株BP-1在培養(yǎng)基NA上劃線，27 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色、生理生化鑒定方法均參照文獻(xiàn)[10]。

1.4.2 菌株BP-1 16S rDNA序列測定 參照文獻(xiàn)方法[11]提取菌株BP-1基因組DNA，用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增 16S rDNA 序列。引物 27f（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTA TCGTT ACGACTT-3′）。PCR 反應(yīng)體系 25 μL：基因組 DNA 1 μL，引物 27f 0.5 μL，1492R 0.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP 1 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 菌株BP-1抑菌譜測定

方法同1.3，測定菌株BP-1對其他主要植物病原真菌的抑制活性。

1.6 菌株BP-1對花生網(wǎng)斑病的田間防治評價

1.6.1 菌株BP-1發(fā)酵原液制備 將保存的BP-1菌種接入NA培養(yǎng)基平板上，28 ℃下恒溫活化培養(yǎng)48 h。將活化培養(yǎng)的菌株BP-1（1×109cfu/mL）1 mL接種到裝有90 mL NA培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中振蕩（28 ℃，180 r/min）培養(yǎng)96 h，得到菌株BP-1的發(fā)酵原液（濃度約1×109cfu/mL），備用。

1.6.2 菌株BP-1田間防效試驗 試驗選在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生試驗田進(jìn)行，花生品種為四粒紅，行距0.5 m，穴距15 cm。試驗按照農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所田間試驗準(zhǔn)則設(shè)計[12]，共6個處理（表 1）。每個小區(qū)20 m2，每個處理4 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，采用噴霧法施藥。7月16日（開花下針期）第一次施藥，整個試驗共施藥3次，每次間隔7～10 d。試驗期間花生只進(jìn)行常規(guī)栽培管理，即正常的施肥、澆灌等，不噴施其他化學(xué)藥劑。

表1 試驗處理Table 1 The experimental treatment

第3次施藥后10 d調(diào)查各處理病情指數(shù)，采用5點(diǎn)取樣法進(jìn)行調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查5株，根據(jù)葉片分級標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和防治效果。葉片分級方法參照呂賓等[13]：按照病斑面積占整個葉片面積的百分比分為5個等級，具體如下：0級，無病斑；1級，11 %以下的葉片發(fā)??；2級，11%～25%葉片發(fā)??；3級，26%～50%葉片發(fā)?。?級，50%以上的葉片發(fā)病。病情指數(shù)＝∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行均值數(shù)據(jù)的One-way ANOVA差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生葉片微生物分離與拮抗菌株篩選

從花生葉片上分離得到微生物563株，其中細(xì)菌435株，真菌98株，放線菌30株。將這些微生物與花生網(wǎng)斑病菌進(jìn)行對峙試驗結(jié)果表明，26 株細(xì)菌、3株真菌，5株放線菌對花生網(wǎng)斑病菌具有不同程度的抑制作用。其中細(xì)菌菌株BP-1對花生網(wǎng)斑病菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)27.0 mm（表2、圖1）。

表2 不同微生物對花生網(wǎng)斑病菌的抑制作用Table 2 The inhibitory effect of different isolates on P.arachidicola

圖1 菌株BP-1對花生網(wǎng)斑病菌的抑制作用（A：對照；B：處理）Fig.1 The control effect of strain BP-1 on P.arachidicola（A: CK; B: Treatment）

2.2 菌株BP-1抑菌譜測定

菌株BP-1對供試11種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌帶為5.6～22.8 mm，其中對辣椒疫霉病菌抑制活性最強(qiáng)，抑菌帶寬達(dá)22.8 mm；對高粱彎孢菌的抑菌帶最小，為5.6 mm（表3）。

表3 菌株BP-1抑菌譜測定Table 3 Inhibitory spectrum of strain BP-1 against pathogens

2.3 菌株BP-1鑒定

2.3.1 形態(tài)和生理生化特征 菌株BP-1在NA培養(yǎng)基上27 ℃培養(yǎng)24 h，菌落扁平，表面光滑，呈桿狀，無色，易挑起，不產(chǎn)色素，革蘭氏反應(yīng)陰性（圖2）。生理生化特征測定結(jié)果為氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、葡萄糖氧化發(fā)酵、V-P試驗、淀粉水解、明膠液化試驗、七葉苷水解試驗、硝酸鹽還原、吲哚試驗呈陽性，苯丙氨酸脫氫酶試驗、甲基紅（M.R.）試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗呈陰性（表4）。

表4 菌株BP-1生理生化特征Table 4 The physiological and biochemical characteristics of strain BP-1

2.3.2 16S rDNA 序列分析 測序結(jié)果表明，菌株BP-1的16S rDNA長度為1424 bp，GenBank登錄號為MW188646.1。在NCBI進(jìn)行Blast同源序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株BP-1與貝萊斯芽胞桿菌構(gòu)成一個分支，相似度99%（圖3）。綜合形態(tài)和生理生化特征及16S rDNA基因序列，最終鑒定細(xì)菌BP-1為貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis。

圖3 菌株BP-1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain BP-1 16S rDNA sequence

2.4 菌株BP-1田間防效評價

菌株BP-1發(fā)酵原液對花生網(wǎng)斑病具有較好防治效果，其防效與430 g/L戊唑醇4000倍液差異不顯著。菌株BP-1發(fā)酵原液稀釋200倍后，對花生網(wǎng)斑病的防治效果為60.65%（表5）。

表5 菌株BP-1對花生網(wǎng)斑病田間防治效果Table 5 The control effect of stain BP-1 against P.arachidicola in field

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌為芽胞桿菌屬，由Ruiz-García等[14]于2005年在西班牙南部馬赫拉加首次發(fā)現(xiàn)，2008年 Wang等[15]確定該菌為解淀粉芽胞桿菌的后期異型體，中文名為貝萊斯芽胞桿菌[16]。本研究中的菌株BP-1是從健康花生葉片上分離、篩選獲得一株對花生網(wǎng)斑病菌具有較強(qiáng)抑制活性的貝萊斯芽胞桿菌。其作為一種新型生防菌株，已開展了大量研究。

貝萊斯芽胞桿菌AH2對疫霉屬Phytophthoraspp.、腐霉屬Pythiumspp.、絲核菌屬Rhizoctoniaspp.、黑腐菌屬Thielaviopsisspp.等多種植物病原菌具有較強(qiáng)抑制作用[17]，貝萊斯芽胞桿菌L-1對梨灰霉和青霉病菌的活體抑制率分別為92.88%和77.47%，能引起病原菌菌絲膨大、畸形，并證實(shí)其含有合成surfactin、fengycin、bacillibactin、bacillaene、macolactin、difficidin、bacilysin等多種肽聚糖和聚酮糖類抗性化合物的基因簇，以及能夠降解病原菌細(xì)胞壁的β-1, 3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶相關(guān)的基因[18]。

貝萊斯芽胞桿菌的生防作用主要通過自身代謝產(chǎn)生抗生素和其他抗菌活性物質(zhì)、鐵離子螯合載體競爭鐵離子、促生長物質(zhì)以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR）來控制病蟲害[19]。貝萊斯芽胞桿菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生 iturin、fengycin、surfactin等環(huán)脂肽物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可以激發(fā)植物的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性[20,21]，Kurosawa等[22]證實(shí)，擬南芥經(jīng)iturin處理后，誘導(dǎo)了其系統(tǒng)抗性基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)了抗病性。貝萊斯芽胞桿菌基因組中存在合成鐵離子螯合載體的基因簇，可以分泌鐵離子螯合載體，從而與病原微生物競爭鐵離子，引起病原物的“鐵饑餓”，從而抑制病原微生物生長和發(fā)育[23-25]；貝萊斯芽胞桿菌 BAC03代謝過程中能夠產(chǎn)生吲哚-3-乙酸（IAA）和氨，且具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACCD）活性，這些活性物質(zhì)與促進(jìn)植物生長密切相關(guān)[26]。

本研究中的貝萊斯芽胞桿菌BP-1不僅在對峙試驗中對花生網(wǎng)斑病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制活性，其制成的發(fā)酵液稀釋200倍后對花生網(wǎng)斑病的防治效果可達(dá)60.65%，可見貝萊斯芽胞桿菌BP-1對防治花生網(wǎng)斑病具有巨大的生防潛力，關(guān)于該菌的抑菌機(jī)制以及劑型研制還需進(jìn)一步研究。