不同碳氮源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB-1產(chǎn)抗菌脂肽的影響

張曉云，郭慶港，王培培，蘇振賀，鹿秀云，趙衛(wèi)松，曲遠(yuǎn)航，董麗紅，叢 蓉，李社增，馬 平

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000）

芽胞桿菌Bacillus是目前研究較為廣泛的一類生防菌資源，具有抑菌譜廣、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，并且無毒、無污染，不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，目前已有多種芽胞桿菌應(yīng)用于微生物殺菌劑研發(fā)中（http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml）。芽胞桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，包括脂肽類、肽類、細(xì)菌素等。其中脂肽類物質(zhì)一般包括豐產(chǎn)素家族fengycin、伊枯草菌素家族iturin和表面活性素家族surfactin三大類。Fengycin具有較強(qiáng)的抗絲狀真菌作用及低溶血活性[1]，在農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景[2,3]。Iturin對(duì)病原真菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)細(xì)菌及病毒的抑制作用較弱[4]。Surfactin具有優(yōu)異的表面活性及溶血功能，能夠通過影響生物膜的形成從而影響細(xì)菌的定殖能力和生防效果[5]；Surfactin與iturin A協(xié)同作用能夠顯著增強(qiáng)iturin A的抑真菌活性[6]，與fengycin共同作用則能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）[7]。

脂肽類物質(zhì)是通過非核糖體途徑合成的，除受調(diào)控因子調(diào)控外[8]，還受多種環(huán)境條件如培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件（溫度、時(shí)間、溶氧）等的影響，其中培養(yǎng)基組分是影響抗菌脂肽合成的主要因素[9]。為了提高芽胞桿菌抗菌脂肽的產(chǎn)量，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究工作。Yi等[10]利用響應(yīng)曲面法對(duì)枯草芽胞桿菌N7產(chǎn)抗菌脂肽的發(fā)酵培養(yǎng)基各成分用量進(jìn)行了優(yōu)化，抗菌脂肽的產(chǎn)量達(dá)到706.57 mg/L；Liu等[11]通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化了解淀粉芽胞桿菌MB199產(chǎn)surfactin的發(fā)酵培養(yǎng)基組分比例，surfactin的產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了1.52倍。這些研究大都集中在發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化上，而針對(duì)影響抗菌脂肽合成的碳、氮源的篩選，尤其是關(guān)于糖、氨基酸影響抗菌脂肽合成的研究報(bào)道相對(duì)較少。

枯草芽胞桿菌B.subtilisBAB-1是本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的一株生防細(xì)菌，能夠有效地防治番茄灰霉病、瓜類白粉病等氣傳病害[12,13]，現(xiàn)已成功開發(fā)成環(huán)保、高效的微生物殺菌劑“80億CFU/mL枯草芽胞桿菌懸浮劑”（登記證號(hào)：PD20150190）。前期研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌BAB-1能夠產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)fengycin與surfactin，fengycin對(duì)番茄灰霉菌具有較強(qiáng)的抑菌作用[14]；而surfactin能夠加速細(xì)菌的表面運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)菌群擴(kuò)展[15]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用快速蛋白液相色譜（FPLC）分析不同碳、氮源對(duì)菌株BAB-1抗菌脂肽產(chǎn)量的影響，并進(jìn)一步采用溶血圈試驗(yàn)及排油圈法測定粗脂肽的性質(zhì)，為指導(dǎo)抗菌脂肽的合成與調(diào)控提供理論依據(jù)，從而進(jìn)一步為以獲取脂肽類物質(zhì)為目的的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽胞桿菌BAB-1（GenBank登錄號(hào)：CP004405.1）由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、H2O 1000 mL；LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g、H2O 1000 mL；Landy培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、L-谷氨酸鈉5 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41 g、FeSO40.15 mg、MnSO45 mg、CuSO40.16 mg、H2O 1000 mL；改良水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂1.5 g、H2O 1000 mL；血瓊脂培養(yǎng)基：在水瓊脂培養(yǎng)基中添加5%的無菌脫纖維綿羊全血。

1.2 脂肽類物質(zhì)的提取及檢測

將活化的菌株BAB-1單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h得到菌株BAB-1種子液，將種子液以2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，首先測定發(fā)酵液的OD600值，再將發(fā)酵液于4 ℃、8000 r/min離心20 min收集上清，在上清中緩慢加入6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，4 ℃過夜沉淀。8000 r/min離心20 min收集沉淀，待沉淀干燥后加入原培養(yǎng)液體積的1/10甲醇抽提2次，每次2 h，合并抽提物并用直徑0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾即得到脂肽粗提物。

采用快速蛋白液相色譜（FPLC）梯度洗脫分離脂肽化合物。FPLC分析系統(tǒng)為AKTA Purifier 10液相分析系統(tǒng)，色譜柱為SOURCE 5RPC ST 4.6/150柱。流動(dòng)相A為含0.065%三氟乙酸和2%乙腈的水溶液，流動(dòng)相B為含0.05%三氟乙酸的80%乙腈溶液。檢測波長為215 nm，流速為1 mL/min。梯度洗脫過程為49.86 min內(nèi)流動(dòng)相A由100%到0[14]。

1.3 不同碳氮源對(duì)菌株BAB-1抗菌脂肽產(chǎn)量的影響

1.3.1 不同碳源對(duì)菌株BAB-1抗菌脂肽產(chǎn)量的影響 以Landy培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的葡萄糖、D-木糖、D-核糖、L-阿拉伯糖與熊果苷作為碳源，L-谷氨酸鈉作為氮源，配制不同碳源的培養(yǎng)基。按1.2的方法培養(yǎng)、提取脂肽，并進(jìn)行FPLC分析。根據(jù)不同培養(yǎng)基脂肽的峰面積/發(fā)酵液OD600的比值比較不同碳源對(duì)菌株BAB-1脂肽產(chǎn)量的影響，每處理3次重復(fù)。

1.3.2 不同氮源對(duì)菌株BAB-1抗菌脂肽產(chǎn)量的影響 以Landy培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量的L-谷氨酸鈉、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸與L-天冬酰胺作為氮源，葡萄糖作為碳源，配制不同氮源的培養(yǎng)基，按1.2的方法培養(yǎng)、提取脂肽，并進(jìn)行FPLC分析。根據(jù)不同培養(yǎng)基脂肽的峰面積/發(fā)酵液OD600的比值比較不同氮源對(duì)菌株BAB-1脂肽產(chǎn)量的影響，每處理3次重復(fù)。

1.4 不同碳氮源對(duì)菌株BAB-1粗脂肽溶血活性的影響

將配制好的血瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中（φ=9 cm），待其凝固后在血平板上放置無菌牛津杯，每牛津杯注入200 μL從不同碳、氮源培養(yǎng)基中提取的菌株BAB-1的脂肽粗提物，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察并測量溶血圈直徑大小。以甲醇作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

1.5 不同碳氮源對(duì)菌株BAB-1粗脂肽排油能力的影響

在無菌培養(yǎng)皿（φ=9 cm）中加入15 mL無菌水，滴加10 μL從不同碳氮源培養(yǎng)基中提取的菌株BAB-1脂肽粗提物，待整個(gè)培養(yǎng)皿表面形成一層薄膜后，在各培養(yǎng)皿中央滴加10 μL礦物油，觀察并測量礦物油的擴(kuò)散直徑，礦物油的擴(kuò)散直徑越小說明脂肽粗提物的排油能力越強(qiáng)。以甲醇作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

1.6 RT-PCR分析不同碳源條件下菌株BAB-1中srfAA基因差異表達(dá)

將菌株BAB-1種子液以2%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL不同碳源的Landy培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，分別取2 mL不同碳源的培養(yǎng)液，利用細(xì)菌總RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取RNA后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后將合成的cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR分析，測定srfAA基因的表達(dá)情況。srfAA基因引物序列為：SrfAA-F（5′-GTCCGCAACAACAGATGACA-3′），SrfAA-R （5′-AAGAACAGCATTGAGGCGAC-3′）。擴(kuò)增反應(yīng)體系為 20 μL，其中 2×Trans Start Tip Green qPCR Super mix 10 μL，引物（10 μmol/L）各 0.4 μL、50×Passive Reference Dye 0.4 μL、cDNA 模板 2 μL、ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s、40 個(gè)循環(huán)；設(shè)gyrB基因?yàn)閮?nèi)參基因，gyrB基因引物序列為 GyrB-F （5′-GAAGCACGGACAATCACC-3′）和 GyrB-R（5′-TCCAAAGCACTCTTACGG-3′）。利用公式2-ΔΔCT計(jì)算目標(biāo)基因在不同處理之間的相對(duì)變化倍數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件進(jìn)行整理，采用IBM SPSS Statistics19.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮源對(duì)菌株BAB-1脂肽產(chǎn)量的影響

2.1.1 不同碳源對(duì)菌株BAB-1脂肽產(chǎn)量的影響 以熊果苷作為碳源時(shí)，菌株BAB-1的surfactin產(chǎn)量顯著高于葡萄糖、D-木糖、D-核糖及L-阿拉伯糖作為碳源產(chǎn)量surfactin，分別是這4種碳源的2.95、7.01、4.26和5.60倍；而fengycin產(chǎn)量與葡萄糖作為碳源時(shí)無顯著差異，但顯著高于D-木糖、D-核糖及L-阿拉伯糖作為碳源的產(chǎn)量（圖1）。

圖1 不同碳源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB-1 脂肽產(chǎn)量的影響Fig.1 Influence of different carbon sources on lipopeptide production from B.subtilis BAB-1

2.1.2 不同氮源對(duì)菌株BAB-1脂肽產(chǎn)量的影響 以L-天冬酰胺為氮源時(shí)菌株BAB-1 surfactin及fengycin的產(chǎn)量與 L-谷氨酸鈉為氮源時(shí)的產(chǎn)量無顯著差異，但顯著高于 L-半胱氨酸、L-脯氨酸及 L-谷氨酰胺為氮源的產(chǎn)量，L-半胱氨酸及L-谷氨酰胺極顯著降低菌株BAB-1 fengycin的產(chǎn)量（圖2）。

圖2 不同氮源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB-1脂肽產(chǎn)量的影響Fig.2 Influence of different nitrogen substrates on lipopeptide production from B.subtilis BAB-1

2.2 不同碳源對(duì)BAB-1菌株粗脂肽溶血活性及排油能力的影響

以熊果苷作為碳源時(shí)，菌株BAB-1粗脂肽的溶血活性最強(qiáng)，其溶血圈直徑達(dá)到3.53 cm，顯著高于葡萄糖、D-木糖、D-核糖及 L-阿拉伯糖作碳源時(shí)該菌株粗脂肽的溶血活性；以葡萄糖與 L-阿拉伯糖為碳源時(shí)，菌株BAB-1粗脂肽的溶血活性無顯著差異，溶血圈直徑分別為1.63和1.60 cm；以D-核糖為碳源時(shí)，該菌株粗脂肽的溶血活性最低，溶血圈直徑僅為0.63 cm（圖3）。

以熊果苷作為碳源時(shí)，菌株BAB-1粗脂肽的排油能力最強(qiáng)，油滴擴(kuò)散直徑僅為0.27 cm，顯著優(yōu)于其他4種碳源的排油能力；以葡萄糖與D-木糖為碳源時(shí)，該菌株粗脂肽的排油能力無顯著差異，擴(kuò)散直徑分別為0.57與0.53 cm；以D-核糖為碳源時(shí)，菌株BAB-1所產(chǎn)脂肽排油能力最低，滴入礦物油后立即散開，擴(kuò)散直徑達(dá)到5.30 cm（圖3）。

圖3 不同碳源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB-1粗脂肽溶血活性及排油能力的影響Fig.3 Influence of different carbon sources on hemolysis and oil discharge capacity of crude lipopeptide from B.subtilis BAB-1

2.3 不同氮源對(duì)菌株BAB-1粗脂肽溶血活性及排油能力的影響

以L-天冬酰胺為氮源時(shí)，菌株BAB-1粗脂肽的溶血活性與L-谷氨酸鈉作為氮源時(shí)無顯著差異，溶血圈直徑分別為1.43與1.30 cm，且顯著高于以L-脯氨酸、L-半胱氨酸及L-谷氨酰胺作氮源時(shí)溶血活性（溶血圈直徑均為0.60 cm）（圖4）。

以L-天冬酰胺為氮源時(shí)，菌株BAB-1粗脂肽具有較好的排油能力，油滴擴(kuò)散直徑為0.43 cm，與L-谷氨酸鈉的0.47 cm無顯著差異，但顯著優(yōu)于以L-脯氨酸、L-半胱氨酸及L-谷氨酰胺為氮源時(shí)該菌株粗脂肽的排油能力（油滴擴(kuò)散直徑分別為5.38、5.43和5.23 cm）（圖4）。

圖4 不同氮源對(duì)枯草芽胞桿菌BAB-1粗脂肽溶血活性及排油能力的影響Fig.4 Influence of different nitrogen sources on hemolysis and oil discharge capacity of crude lipopeptide from B.subtilis BAB-1

2.4 不同碳源條件下srfAA基因差異表達(dá)分析

與葡萄糖為碳源相比，菌株BAB-1中srfAA基因的表達(dá)量在以熊果苷為碳源時(shí)提高了2.9倍，與FPLC分析的結(jié)果一致；但以D-木糖、D-核糖與L-阿拉伯糖為碳源時(shí)，srfAA基因的表達(dá)量分別降低了1.4、2.6和1.1倍（表1）。

表1 不同碳源條件下srfAA基因的相對(duì)表達(dá)情況Table 1 Comparsion of expression of srfAA gene in B.subtilis BAB-1 in different carbon sources using RT-qPCR

3 討論

枯草芽胞桿菌通過與病原菌進(jìn)行營養(yǎng)和空間競爭、分泌多種次生代謝產(chǎn)物抑制或殺死病原菌及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等途徑達(dá)到其防治植物病害的目的。脂肽類抑菌物質(zhì)如surfactin、iturin和fengycin等是芽胞桿菌抑制病原真菌生長的主要抑菌物質(zhì)[16]，其中 fengycin與 iturin能夠抑制多種病原真菌的生長[17,18]，surfactin具有較強(qiáng)的表面活性，能夠促進(jìn)芽胞桿菌在植物體表的定殖能力進(jìn)而影響其防治效果[5]，同時(shí)fengycin與 surfactin還可以作為誘導(dǎo)因子引起植物的誘導(dǎo)抗病性[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，fengycin與surfactin是枯草芽胞桿菌BAB-1發(fā)揮防病作用的主要物質(zhì)[14,15]，因此，提高芽胞桿菌脂肽類抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量對(duì)提高其防效具有重要意義。

通過明確不同營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生防芽胞桿菌產(chǎn)抗菌脂肽的影響，對(duì)于其定向發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。碳源與氮源是脂肽類抗菌物質(zhì)產(chǎn)生所必需的營養(yǎng)成分，對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響較大[19-21]。葡萄糖是芽胞桿菌的優(yōu)選碳源[22,23]，國內(nèi)外學(xué)者圍繞葡萄糖對(duì)芽胞桿菌脂肽類物質(zhì)產(chǎn)生的影響開展了一定研究。Sandrin等[24]發(fā)現(xiàn)葡萄糖是產(chǎn)生surfactin和iturin的良好碳源；Nihorimbere等[25]報(bào)道葡萄糖有利于fengycin和iturin的積累；Roongawang等[26]研究表明葡萄糖是surfactin、bacillomycin L和plipastatin的有效碳源。除葡萄糖之外，本研究選擇了 D-木糖、D-核糖、L-阿拉伯糖及熊果苷作為碳源，這 4種糖是通過表型芯片技術(shù)（phenotype microarray，PM）篩選出的能夠明顯促進(jìn)菌株BAB-1生長的物質(zhì)[27]。通過FPLC分析發(fā)現(xiàn)，熊果苷能夠顯著提高surfactin的產(chǎn)量，是葡萄糖作碳源時(shí)surfactin產(chǎn)量的2.95倍，這就說明不同菌株合成特定抗菌脂肽所需的碳源種類是不同的，同時(shí)也證明了PM技術(shù)能夠應(yīng)用于芽胞桿菌脂肽類物質(zhì)發(fā)酵工藝營養(yǎng)物質(zhì)的篩選中。Nakano等[28]報(bào)道，葡萄糖能夠連續(xù)增加surfactin合成酶基因srfA的表達(dá)水平從而提高surfactin的產(chǎn)量，因此本研究檢測了熊果苷對(duì)srfAA基因表達(dá)水平的影響發(fā)現(xiàn)，熊果苷可以顯著提高該基因的表達(dá)水平，相比葡萄糖提高了2.9倍。

脂肽類化合物一般是由1個(gè)β-羥基脂肪酸與7～10個(gè)氨基酸以酰胺鍵形式連接而形成的環(huán)肽[29]。關(guān)于抗菌脂肽的組成成分氨基酸是否影響其合成的研究報(bào)道較少。Peypoux等[30]報(bào)道，L-纈氨酸與 L-異亮氨酸能夠促進(jìn)surfactin合成；Doekel等[31]報(bào)道，L-谷氨酸和L-天冬氨酸能夠顯著提高抗菌脂肽lichenysin-A的產(chǎn)量；孫力軍等[32]研究表明，L-谷氨酸和L-天冬酰胺是抗菌脂肽fengycin與surfactin產(chǎn)生的良好氮源，能夠促進(jìn)抗菌脂肽的產(chǎn)生。本研究選擇了能夠明顯促進(jìn)菌株BAB-1生長的4種物質(zhì)L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺及 L-天冬酰胺[27]以及 L-谷氨酸鈉作為氮源結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-天冬酰胺及 L-谷氨酸鈉利于fengycin與surfactin的產(chǎn)生，這與孫力軍等[32]的研究結(jié)果一致。但在fengycin與surfactin的肽鏈結(jié)構(gòu)中，并沒有天冬酰胺殘基，天冬酰胺對(duì)這2種物質(zhì)的促產(chǎn)作用，可能是由于天冬酰胺在菌體內(nèi)的代謝途徑影響了2種物質(zhì)的合成，具體原因還需進(jìn)一步研究。

據(jù)報(bào)道，surfactin是枯草芽胞桿菌在植物根際產(chǎn)生的主要脂肽類物質(zhì)[25,33]，能夠促進(jìn)生防菌在根部的定殖進(jìn)而提高防病效果。Surfactin可以通過溶血圈法結(jié)合排油圈法進(jìn)行定性檢測[34]，并利用FPLC進(jìn)行定量檢測[35]。本研究通過FPLC分析發(fā)現(xiàn)，熊果苷能夠顯著提高菌株BAB-1的surfactin產(chǎn)量，進(jìn)一步采用溶血圈法與排油圈法驗(yàn)證了熊果苷作為碳源時(shí)該菌株粗脂肽的溶血活性與排油能力最強(qiáng)，與FPLC結(jié)果一致。Li等[36]報(bào)道，枯草芽胞桿菌突變株Bs-H74 surfactin產(chǎn)生能力比野生型菌株提高3倍，同時(shí)對(duì)水稻紋枯病的防效也提高了14.6%。在本研究中熊果苷促進(jìn)surfactin產(chǎn)量增加，是否能夠提高菌株BAB-1在植物體表的定殖能力與防病效果還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然熊果苷作為碳源、L-谷氨酸鈉作為氮源能夠顯著提高菌株BAB-1的surfactin產(chǎn)量，但fengycin產(chǎn)量與葡萄糖作為碳源時(shí)沒有顯著差異；綜合成本因素考慮，葡萄糖與L-谷氨酸鈉是BAB-1菌株產(chǎn)脂肽最適宜的碳、氮源。但可以尋找熊果苷廉價(jià)的替代品，有效降低發(fā)酵成本，為進(jìn)一步中試放大及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。