團(tuán)頭魴TYK2基因的克隆與表達(dá)分析

張建，王濟(jì)秀，吳曉麗，劉紅

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號(hào)通路是由多種細(xì)胞因子[1]、干擾素[2]、生長因子[3]和相關(guān)分子[4]介導(dǎo)的高度保守的信號(hào)通路，其廣泛參與免疫[5]、細(xì)胞增殖[6]、生長、分化、遷移和細(xì)胞凋亡[7]等過程。JAK/STAT信號(hào)通路由3個(gè)重要因子組成，包括細(xì)胞表面的受體、JAK家族成員和STAT家族成員[8]。JAK激酶是一種非受體型絡(luò)氨酸激酶，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、鳥類、昆蟲和魚類[9]，在哺乳動(dòng)物中，包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2等4個(gè)成員[10]。TYK2是JAK家族里第一個(gè)被鑒定的成員，被證明在細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用[11]。TYK2蛋白包含4個(gè)不同的蛋白結(jié)構(gòu)域：N端的B41、SH2、假激酶區(qū)和C末端的激酶區(qū)[12-13]。TYK2被證明對(duì)Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的通路應(yīng)答起著重要的作用[14]。在之前的小鼠模型的研究表明，除了Ⅰ型IFN和IL-12外，TYK2還對(duì)IL-6信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)也有重要的作用[15-16]。在缺失IFN的人類細(xì)胞系中，過表達(dá)IFN-a后，在細(xì)胞中鑒定出TYK2基因，表明TYK2是Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的關(guān)鍵成分[17]。

目前，關(guān)于TYK2的研究涉及的魚類比較少，在大西洋鮭(Salmosalar)中，過表達(dá)TYK2增強(qiáng)IFN誘導(dǎo)的Mx基因的轉(zhuǎn)錄水平[18]；在草魚(Ctenopharyngodonidellus)的CIK細(xì)胞中，過表達(dá)受體CRFB5能促進(jìn)TYK2蛋白的磷酸化[19]；用一定濃度的瘦素處理黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)肝臟細(xì)胞[20]和矛尾復(fù)虎蝦魚(Synechogobiushasta)[21]的肝臟細(xì)胞，都能上調(diào)細(xì)胞中TYK2基因的表達(dá)。但關(guān)于團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)TYK2的研究尚未見報(bào)道。團(tuán)頭魴是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。目前，由嗜水氣單胞菌感染引起的細(xì)菌性敗血癥是團(tuán)頭魴主要的病害。 筆者所在研究室在前期進(jìn)行的團(tuán)頭魴其他抗病基因[22-23]研究的基礎(chǔ)上，克隆團(tuán)頭魴的TYK2基因，檢測其在健康團(tuán)頭魴的組織分布情況和感染嗜水氣單胞菌后免疫相關(guān)組織中的表達(dá)情況，旨在為深入研究TYK2在團(tuán)頭魴抗嗜水氣單胞菌感染過程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚與樣品收集

本試驗(yàn)所用的團(tuán)頭魴均購自湖北百容水產(chǎn)良種有限公司。試驗(yàn)所用幼魚規(guī)格為45～55 g，健康成魚的規(guī)格為480～520 g。將魚運(yùn)回華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地暫養(yǎng)2周，待其適應(yīng)環(huán)境后，進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)隨機(jī)設(shè)置對(duì)照組和感染組2個(gè)處理，每一處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。為了確定團(tuán)頭魴TYK2基因的空間表達(dá)模式，分別采取健康團(tuán)頭魴成魚的心臟、肝臟、脾臟、中腎、頭腎、腦、血液、腸道、肌肉和鰓等10個(gè)組織。感染試驗(yàn)中，用濃度為6.7 ×106cfu/mL嗜水氣單胞菌對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行腹腔注射，每尾魚注射100 μL。對(duì)照組注射100 μL的磷酸鹽緩沖液。在感染注射后的0、4、12、24、72和120 h分別采集試驗(yàn)組和對(duì)照組的肝臟、脾臟、中腎和腸道組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)生物學(xué)重復(fù)取5尾魚。上述所取樣品立即放在液氮中凍存24 h，隨后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2 總RNA的提取及cDNA合成

利用Trizol法提取各組織的總RNA，具體步驟參考Trizol試劑(Invitrogen)說明書。用紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000，美國)測定所提取的RNA濃度，另外用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整度和純度。將所提取的RNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa，日本)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。

1.3 序列驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索獲得斑馬魚TYK2基因的cDNA序列，通過本地Blast從實(shí)驗(yàn)室已有的團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組中獲取團(tuán)頭魴TYK2基因的序列，用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析獲得其ORF序列。用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物TYK2-ORF-F/TYK2-ORF-R (表1)，以團(tuán)頭魴中腎cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增目的片段，利用DNA快速回收純化試劑盒回收DNA片段，之后將DNA片段和Pet-32a載體在37 ℃水浴中雙酶切過夜，再次利用DNA快速回收純化試劑盒，將上述目的片段和載體回收。取2 μL目的片段和1.5 μL的Pet-32a載體進(jìn)行過夜(12 h)連接，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入感受態(tài)DH5α中，菌液PCR驗(yàn)證后，送武漢擎科生物公司測序。

序列驗(yàn)證正確后，通過ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測其氨基酸序列，在線網(wǎng)站(web.expasy.org/protscale)分析其蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量，在線網(wǎng)站SMART(smart.embl-heidelberg.de/smart)預(yù)測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，用DNAMAN軟件進(jìn)行TYK2蛋白質(zhì)的多序列對(duì)比。最后，利用MEGA 6構(gòu)建多個(gè)物種的TYK2蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 熒光定量PCR

為了檢測TYK2基因在健康團(tuán)頭魴成魚中的組織分布情況和嗜水氣單胞菌感染后在免疫相關(guān)組織中的表達(dá)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，選擇18S rRNA為內(nèi)參基因，所用引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR混合試劑10 μL、ddH2O 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA模板1 μL。qRT-PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。

表1 本研究所用的引物信息Table 1 Primers used in this study

1.5 數(shù)據(jù)分析

研究中的所有數(shù)據(jù)均表示為3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，并使用SPSS Statistics 17.0和GraphPad 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及做圖。采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)來檢測數(shù)據(jù)的顯著性，將P<0.05描述為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P<0.01描述為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 團(tuán)頭魴TYK2的序列分析

經(jīng)克隆、測序驗(yàn)證，獲得團(tuán)頭魴TYK2基因的ORF全長3 489 bp，編碼1 162 個(gè)氨基酸，在線網(wǎng)站預(yù)測其理論分子質(zhì)量為131.7 ku，理論等電點(diǎn)為6.86。將團(tuán)頭魴和斑馬魚、大西洋鮭及人等其他脊椎動(dòng)物的TYK2的ORF序列與其基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，所對(duì)比物種均具有23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，且相對(duì)應(yīng)的外顯子長度相似，內(nèi)含子大小則差別較大(圖1)。TYK2蛋白的氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示，團(tuán)頭魴和鯉(Cyprinuscarpio)相似性最高(85.89%)，其次是草魚(81.85%)和斑馬魚(78.71%)，最低的是小鼠(47.82%)；所有物種TYK2蛋白的磷酸化位點(diǎn)一致，說明其高度保守。TYK2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析如圖3，魚類的TYK2聚為一支，其中團(tuán)頭魴的TYK2和草魚的親緣性最近，其次是鯉、斑馬魚和斑點(diǎn)叉尾鮰，與大黃魚的親緣性最遠(yuǎn)；另外，哺乳動(dòng)物則聚為另外一支。

豎線段表示外顯子，豎線段之間的橫線段表示內(nèi)含子，豎線段的寬度和橫線段的長度表示核苷酸的長度。The vertical lines represent exons,the horizontal lines between them represent introns,and the width and length of the vertical and horizontal lines represent the length of the nucleotide,respectively.圖1 脊椎動(dòng)物TYK2基因結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of TYK2 genes in vertebrates

2.2 TYK2在健康團(tuán)頭魴各組織中的表達(dá)

通過qRT-PCR檢測TYK2基因在健康團(tuán)頭魴成魚不同組織中的分布情況，結(jié)果如圖4所示。TYK2在中腎中的表達(dá)量最高，其次是血液、脾臟和頭腎，在腸道、腦、鰓、心臟、肌肉和肝臟中的表達(dá)量較低。

2.3 感染嗜水氣單胞菌后團(tuán)頭魴TYK2的表達(dá)

感染嗜水氣單胞菌后，在團(tuán)頭魴脾臟中，TYK2的表達(dá)在感染后4 h極顯著下調(diào)，并達(dá)到最小值(0.46倍，P<0.01)；在12 h極顯著上調(diào)，并達(dá)到最大值(1.78倍，P<0.01)；之后顯著下調(diào)。在中腎中，TYK2在感染后24 h極顯著上調(diào)，并達(dá)到最大值(2.22倍，P<0.01)；在72 h顯著下調(diào)并達(dá)到最小值(0.26倍，P<0.01)。在腸道中，TYK2在感染后4 h極顯著下調(diào)表達(dá)，并達(dá)到最小值(0.42倍，P<0.01)；在12 h顯著上調(diào)，并達(dá)到最大值(1.39倍，P<0.05)；在72 h和120 h極顯著下調(diào)。TYK2在免疫相關(guān)組織中的表達(dá)變化表明，它可能在團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后的免疫過程中發(fā)揮著一定的作用。

*間隙用短線表示。所有的氨基酸一致用灰色表示，75%一致用淺灰色表示。方框表示磷酸化位點(diǎn)。*Gaps are indicated by dashes. Identical amion acids are shaded in gray,and the light gray represent 75% similarity.The square marks the phosphorylation site.物種登錄號(hào)：草魚 Ctenopharyngodon idella (AMK47892.1)；斑馬魚 Danio rerio (XP_009298018.1)；大西洋鮭 Salmo salar (AGS07436.1)；半滑舌鰨 Cynoglossus semilaevis (XP_024920336.1)；黃顙魚 Tachysurus fulvidraco (ALJ92431.1)；牙鲆Paralichthys olivaceus (XP_019950262.1)；斑點(diǎn)叉尾鮰 Ictalurus punctatus (XP_017310696.1)；大黃魚 Larimichthys crocea (XP_019130882.1)；非洲爪蟾Xenopus laevis (NP_001085663.1)；原雞 Gallus gallus (XP_025001512.1)；小鼠 Mus musculus (AAD49423.1 )；人 Homo sapiens (NP_003322.3 ).圖2 團(tuán)頭魴和其他脊椎動(dòng)物TYK2氨基酸多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of TYK2 from blunt snout bream and other vertebrate species

物種名：草魚 Ctenopharyngodon idella，鯉 Cyprinus carpio，斑馬魚 Danio rerio,斑點(diǎn)叉尾鮰 Ictalurus punctatus，大西洋鮭 Salmo salar，青鳉 Oryzias latipes，大黃魚 Larimichthys crocea，半滑舌鰨 Cynoglossus semilaevis，非洲爪蟾Xenopus laevis，原雞 Gallus gallus，人 Homo sapiens，小鼠 Mus musculus.圖3 脊椎動(dòng)物TYK2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TYK2 in vertebrates

MK：中腎 Mid-kidney； BL：血液 Blood； S：脾臟 Spleen； HK：頭腎 Head-kidney； I：腸 Intestine； B：腦 Brain； G：鰓 Gill； H：心臟 Heart； M：肌肉 Muscle； L：肝臟 Liver．柱上不同的字母表示顯著性差異(P<0.05)。Different letters above pillar indicate statistically significance (P<0.05).圖4 團(tuán)頭魴TYK2在健康成魚組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of TYK2 gene in different tissues of healthy adult blunt snout bream

3 討 論

基因結(jié)構(gòu)分析顯示團(tuán)頭魴TYK2基因由23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子組成，與其他幾種魚類及人等脊椎動(dòng)物物種的比較發(fā)現(xiàn)，不同物種該基因的外顯子和內(nèi)含子數(shù)目相同，對(duì)應(yīng)外顯子的核酸數(shù)目也基本一致，但是內(nèi)含子大小差異顯著，說明TYK2基因在進(jìn)化中高度保守[24]。該基因編碼1 162個(gè)氨基酸，含有4個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，B41結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域、假激酶結(jié)構(gòu)域和絡(luò)氨酸激酶結(jié)構(gòu)域[25]。經(jīng)過氨基酸多序列比對(duì)分析，這些蛋白結(jié)構(gòu)域在不同物種中具有高度的保守性。已有研究發(fā)現(xiàn)，JAK家族蛋白被細(xì)胞膜上的受體激活，使JAK家族蛋白位于激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)被激活，進(jìn)而激活下游蛋白[26]。在系統(tǒng)進(jìn)化分析中，團(tuán)頭魴首先與草魚聚在一起，然后與其他魚類聚為一支，其他脊椎動(dòng)物物種則聚為另一支，與其分類地位一致。

健康團(tuán)頭魴的組織表達(dá)結(jié)果顯示，TYK2在中腎中的表達(dá)量最高，在其他免疫相關(guān)組織(脾臟和頭腎)以及血液中表達(dá)較高，在其他組織中的表達(dá)量比較低。類似的，在其他魚類中，鱖的TYK2在心臟、血液和免疫相關(guān)組織(鰓、脾臟、腸、中腎和頭腎)中的表達(dá)量較高[26]；在大西洋鮭中，TYK2在脾臟、頭腎和肌肉中高表達(dá)[18]；在黃顙魚中，TYK2在中腎、頭腎、脾臟和腸中高表達(dá)，而在肌肉中的表達(dá)較低[20]；在矛尾復(fù)蝦虎魚中，TYK2在腦、心臟和免疫組織(鰓、腸和中腎)中高表達(dá)，在肌肉中低表達(dá)[21]；有趣的是，鯉TYK2在皮膚中表達(dá)最高，其次是腸和血液，在其他免疫相關(guān)組織(脾臟、中腎和頭腎)的表達(dá)較低，這種表達(dá)的差異性可能受魚體自身及其養(yǎng)殖環(huán)境的影響[27]。在哺乳動(dòng)物中，人的TYK2基因在淋巴組織和免疫細(xì)胞中大量表達(dá)[28]；在鴨的研究中，TYK2在組織中廣泛表達(dá)，在心臟和肝臟的表達(dá)量較高，在肌肉和胃中的表達(dá)量較低[25]。在哺乳動(dòng)物和魚類中，TYK2均在免疫相關(guān)組織中高表達(dá)，表明其功能和自身的免疫過程可能有一定的關(guān)聯(lián)。

*顯著性差異(P<0.05) ； **極顯著性差異(P<0.01)。*Statistical difference (P< 0.05) ； **Extremely statistical difference (P<0.01).圖5 團(tuán)頭魴TYK2基因在嗜水氣單胞菌感染后的脾臟、中腎和腸道中的表達(dá)Fig.5 Relative expression of TYK2 in spleen,mid-kidney and intestine after infection of A. hydrophila in blunt snout bream

TYK2是一種非受體型絡(luò)氨酸激酶，不直接參與物種的免疫過程。在物種免疫過程中，細(xì)胞因子和細(xì)胞受體結(jié)合形成三聚體將TYK2磷酸化，TYK2將下游的基因磷酸化，進(jìn)而作用于免疫相關(guān)的基因[9]。

本研究中團(tuán)頭魴TYK2基因在中腎、脾臟、頭腎和腸的表達(dá)量較高，但感染嗜水氣單胞菌后，TYK2在頭腎中的表達(dá)沒有顯著性變化，這可能與頭腎的組織特異性或者受到實(shí)驗(yàn)環(huán)境影響有關(guān)。感染嗜水氣單胞菌后，相對(duì)于對(duì)照組，團(tuán)頭魴TYK2基因在脾臟和腸道中均在4 h顯著下降并達(dá)最小值，在12 h顯著性上升并達(dá)最大值。在中腎中，團(tuán)頭魴TYK2基因在24 h極顯著性上調(diào)并達(dá)最大值，在72 h極顯著性下調(diào)并達(dá)最小值。這說明TYK2在團(tuán)頭魴抵抗嗜水氣單胞菌的過程中起著重要的作用。在脾臟中，TYK2在24、72和120 h相對(duì)于對(duì)照組顯著降低，表達(dá)恢復(fù)穩(wěn)定。在中腎和腸中，相對(duì)于對(duì)照組，TYK2達(dá)到最大值后，表達(dá)仍在變化，說明TYK2可能在腸和中腎的作用時(shí)間較長。團(tuán)頭魴TYK2基因在中腎中的基因表達(dá)量最大值的時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于在脾臟和腸的時(shí)間點(diǎn)晚一些，說明中腎可能在團(tuán)頭魴抗嗜水氣單胞菌的過程中，作用時(shí)間稍晚。另外，團(tuán)頭魴TYK2在腸道中的表達(dá)趨勢與TYK2在斑點(diǎn)叉尾鮰的腸道中的表達(dá)趨勢相似，表達(dá)相對(duì)于對(duì)照降低[29]。TYK2基因在細(xì)胞層面的研究較多，例如在缺失IFN的人類細(xì)胞系中，過表達(dá)IFN-a后，在細(xì)胞中鑒定出TYK2基因，表明TYK2是I型干擾素信號(hào)通路的關(guān)鍵成分[17-18]。在草魚CIK細(xì)胞中，過表達(dá)受體CRFB5能促進(jìn)TYK2蛋白的磷酸化[20]。

綜上，本研究克隆獲得團(tuán)頭魴TYK2基因，其在進(jìn)化上有較高的保守性。在健康團(tuán)頭魴中，TYK2在免疫相關(guān)組織(中腎、脾臟和頭腎)和血液中的表達(dá)量較高；感染嗜水氣單胞菌后，在免疫相關(guān)組織(中腎、脾臟和腸)中均有顯著變化。這些結(jié)果均說明團(tuán)頭魴TYK2基因可能在團(tuán)頭魴抗細(xì)菌感染的免疫過程中發(fā)揮著重要的作用。