基于生物信息學(xué)方法篩選EV71 感染的關(guān)鍵基因和通路＊

單志鳴，楊俊梅，孫紅啟，李鐵威，成怡冰

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）作為一種常見兒童感染性疾病，多累及2～5 歲兒童，主要表現(xiàn)為口腔黏膜潰瘍性皰疹及四肢末端水皰樣皮疹，主要病原為腸道病毒，常見為柯薩奇病毒 A 組 16 型（Coxsackie virus A16，CA16）和腸道病毒 71 型 （Enterovirus 71，EV71），EV71 不僅引起手足口病，而且可引起嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等［1］。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，通過分析篩選可以找到致病后差異表達(dá)的基因或蛋白，進(jìn)一步探索其在疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)制。筆者通過分析美國國立信息技術(shù)中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）下屬的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）［2］中 EV71 感染組和對照組的基因表達(dá)差異，探討EV71 在感染宿主細(xì)胞后差異表達(dá)的基因，并分析這些差異表達(dá)基因所參與的生物學(xué)過程，以及在EV71 感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的通路途徑，更好地揭示EV71 感染人體的分子機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源在GEO 數(shù)據(jù)庫中以“EV71”檢索，對檢索結(jié)果按照如下標(biāo)準(zhǔn)篩選：（1） 至少3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)；（2）研究設(shè)計(jì)有對照組。篩選后得到數(shù)據(jù)集GSE136668，其包含EV71 感染人扁桃體上皮細(xì)胞組和對照組共6 個(gè)樣本，使用HiSeq X Ten （Homo sapiens）平臺對提取的RNA 進(jìn)行高通量測序，下載基因矩陣文件后續(xù)分析。

1.2 篩選差異表達(dá)基因用在線分析網(wǎng)站NetworkAnalyst （https：//www.networkanalyst.ca/Network Analyst/）［3］基因表達(dá)矩陣分析模塊 edgeR1 對下載的基因矩陣文件進(jìn)行差異基因分析，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為：感染組與對照組相比差異倍數(shù)2 倍以上，P＜0.05（log|FC|＞1，P＜0.05）。

1.3 差異基因GO 分析和KEGG 分析對符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的差異基因在NetworkAnalyst 網(wǎng)站的基因列表分析模塊做功能富集分析，基因本體（gene ontology，GO）分析主要是對基因的生物學(xué)功能進(jìn)行注釋分析，主要包括分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）和生物學(xué)過程（biological process，BP）。京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析是將基因組信息與基因高級功能信息聯(lián)系起來，系統(tǒng)分析基因參與的生物學(xué)功能，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（protein-protein interaction，PPI）通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)能夠分析差異表達(dá)基因的蛋白互作關(guān)系和關(guān)鍵基因模塊。用差異表達(dá)基因?qū)?STRING 在線分析網(wǎng)站（http：//www.stringdb.org/）［4］，對基因所編碼蛋白之間的相互作用展示，篩選條件為：互作得分＞0.4；將互作文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件［5］，用 MCODE 插件篩選關(guān)鍵基因模塊，設(shè)置參數(shù) degree cut-off 值為 2，node score cutoff 值為 0.2，K score 值為 3，Max.Depth 值 為 100，Cytohubba 插件篩選MCC 等級前十的hub 基因。

2 結(jié) 果

2.1 感染組與對照組差異基因用NetworkAnalyst分析得到9443 個(gè)差異表達(dá)基因，4703 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，4740 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，以 log|FC|＞1，P＜0.05為條件篩選后得到251 個(gè)，其中173 個(gè)基因上調(diào)，78 個(gè)基因下調(diào)，上調(diào)和下調(diào)logFC 排序前10 見表1。

2.2 差異基因GO 分析和KEGG 分析結(jié)果GO分析結(jié)果顯示分子功能模塊主要富集在蛋白結(jié)合、DNA 結(jié)合、核染色質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞之間鈣調(diào)結(jié)合、連接酶活性、微管蛋白結(jié)合和調(diào)節(jié)復(fù)合物結(jié)合，細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)、核質(zhì)、核仁、中心體、蛋白復(fù)合體、細(xì)胞之間粘著結(jié)合、細(xì)胞骨架和微管，生物學(xué)進(jìn)程主要富集在DNA 模板轉(zhuǎn)錄、DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂、負(fù)相調(diào)節(jié)DNA 轉(zhuǎn)錄、凋亡進(jìn)程、有絲分裂細(xì)胞核分離、姐妹染色體結(jié)合、細(xì)胞對DNA 損傷應(yīng)激反應(yīng)和絲裂原激活蛋白激酶激活（表2）；KEGG 分析結(jié)果主要富集在沙門氏菌感染、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA 監(jiān)視通路、MAPK 信號通路、p53 信號通路、癌癥中轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路、EB 病毒感染、百日咳等通路途徑（表3）。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果通過STRING 在線分析，差異基因互作網(wǎng)絡(luò)有187 點(diǎn)，433 個(gè)連線（圖1），使用Cytoscape 軟件MCODE 插件分析得到核心互作模塊（圖2）以及cytohubba 插件篩選出MCC 等級前 10 的 hub 基因（圖3），分別為 CENPF、KNTC1、BRCA1、HELLS、KIF20B、CASC5、ECT2、KIF14、ASPM、CENPJ。

圖1～3 見封三。

2.4 關(guān)鍵基因BRCA1 調(diào)控靶基因分析對hub基因的功能和參與生物學(xué)途徑分析發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵基因參與病毒感染相關(guān)的免疫調(diào)控和細(xì)胞凋亡過程，此外BRCA1 編碼的轉(zhuǎn)錄因子既可以負(fù)向調(diào)節(jié)促炎反應(yīng)調(diào)控通路靶基因，也可正向調(diào)節(jié)表皮生長因子受體（EGFR）、胰島素樣生長因子（IGF-1）等促進(jìn)機(jī)體修復(fù)的靶基因表達(dá)，結(jié)果如圖4 所示。

表1 差異基因列表

表2 差異基因GO 分析結(jié)果

表3 差異基因KEGG 分析結(jié)果

圖4 BRCA1 調(diào)節(jié)靶基因結(jié)果

3 討 論

手足口病作為一種常見的兒童感染性疾病，EV71 是引起手足口病最常見的致病病毒之一，常引起重癥手足口患兒發(fā)生無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥［6］，嚴(yán)重威脅著兒童的身體健康，深入研究EV71 引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的分子機(jī)制對于疾病的診斷和治療具有重要意義。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，研究疾病中差異表達(dá)基因更加便捷。

利用公共數(shù)據(jù)庫中的測序數(shù)據(jù)，綜合分析EV71 感染組和正常對照組的差異表達(dá)基因，提示其可能參與EV71 感染人體的生理過程并發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。通過在線分析網(wǎng)站Network Analyst 對下載的基因矩陣文件進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換和標(biāo)準(zhǔn)化，分析感染組和對照組差異表達(dá)基因，按照2倍以上的變化和P＜0.05 為篩選條件，得到差異表達(dá)基因251 個(gè)，其中173 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，78 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步對251 個(gè)差異基因做基因的富集分析，預(yù)測了這些差異基因參與的生物功能和通路，GO 分析結(jié)果顯示這些差異基因可能通過影響蛋白質(zhì)DNA 結(jié)合、細(xì)胞之間鈣調(diào)結(jié)合和粘著以及微管蛋白結(jié)合參與感染的進(jìn)程，還可能通過調(diào)節(jié)DNA 轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂與凋亡進(jìn)程和細(xì)胞對DNA 損傷應(yīng)激反應(yīng)影響感染的過程。KEGG 通路富集結(jié)果顯示這些差異基因參與的調(diào)節(jié)通路有沙門氏菌感染和EB 病毒感染以及 MAPK 信號通路和p53 信號通路等，MAPK 信號通路廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過程，包括炎癥、應(yīng)激、細(xì)胞生長分化和凋亡。研究表明［7］EV71 感染人體后通過激活體內(nèi)的固有免疫系統(tǒng)促進(jìn)一系列炎性細(xì)胞因子的分泌，干擾病毒的復(fù)制和參與調(diào)節(jié)病毒的免疫逃逸機(jī)制并會激活 MAPK 信號通路。xie 等報(bào)道［8］EV71 感染后會激活p38、ERK1/2 和JNK1/2 信號通路，進(jìn)而促進(jìn)白介素6 和白介素8 等細(xì)胞因子的釋放，zhang 等的研究也表明體外實(shí)驗(yàn)中p38 抑制劑可以減弱EV71誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。還有兩項(xiàng)研究［9，10］結(jié)果發(fā)現(xiàn) EV71的非結(jié)構(gòu)蛋白3C 可以影響MAPK 下游信號分子結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，因此，MAPK 信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放和感染細(xì)胞的凋亡，在EV71 感染的過程中具有重要作用。進(jìn)一步對251個(gè)差異基因構(gòu)建了蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選感染相關(guān)的關(guān)鍵基因，Cytohubba 等級前十的基因分別為CENPF、KNTC1、BRCA1、HELLS、KIF20B、CASC5、ECT2、KIF14、ASPM、CENPJ，并且它們也存在于核心互作模塊，更進(jìn)一步表明這10 個(gè)基因可能作為關(guān)鍵基因參與EV71 感染的過程，對其功能注釋分析發(fā)現(xiàn)基因BRCA1 編碼蛋白為轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子作為重要的生命過程調(diào)節(jié)蛋白，可以通過與基因的啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)水平。通過JASPAR 網(wǎng)站［11］分析發(fā)現(xiàn)，BRCA1 編碼的轉(zhuǎn)錄因子負(fù)向調(diào)節(jié)的靶基因中 EGFR 依賴的信號通路是重要的促炎反應(yīng)調(diào)控通路，在病原體感染時(shí)EGFR 基因表達(dá)如果受到抑制，會導(dǎo)致抵抗病原體的能力下降。一項(xiàng)研究［12］就證明miR-27a 可以通過靶向下調(diào)EGFR 基因表達(dá)，從而抑制EV71 病毒的復(fù)制；另一個(gè)靶基因IRF3 可以促進(jìn)EV71 感染后促炎因子和干擾素的生成［13］，抑制這些基因的表達(dá)都有利于機(jī)體對病原的抵抗。此外，BRCA1 還可以正向調(diào)節(jié)靶基因SATA1/2 以及E2F6 等。在干擾素刺激后，作為調(diào)控因子SATA1/2 通過增加促進(jìn)炎癥因子生成來抵抗病毒復(fù)制［14］，同樣E2F6 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［15］。以上結(jié)果提示 BRCA1 作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子可能參與EV71 感染的重要過程。