槲皮素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的抗氧化作用及其機(jī)制

王冬艷，彭建明，季 琰，羅惠媛，葉記林

視網(wǎng)膜病變包括黃斑水腫、玻璃體腔出血和視網(wǎng)膜新生血管性青光眼，嚴(yán)重影響患者的視力，糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，也是患者失明的主要原因之一［1］。長期高血糖導(dǎo)致蛋白激酶C、糖化血紅蛋白和多元醇代謝物增加，影響視網(wǎng)膜生理功能，引發(fā)氧化應(yīng)激損傷［2］。高糖培養(yǎng)的糖尿病大鼠模型和人視網(wǎng)膜色素上皮均顯示視網(wǎng)膜脂質(zhì)過氧化物明顯增加，抗氧化酶降低。有研究表明通過抗氧化和抗炎作用可以減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷［3］。

槲皮素（Quercetin，QUE）是黃酮類化合物，在許多中藥如菟絲子和毛丹皮中常見，具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗炎、清除自由基等多種藥理活性，目前，QUE 對糖尿病患者和糖尿病動物模型的糖脂代謝調(diào)節(jié)和抗氧化作用已受到廣泛關(guān)注［4］。該研究建立糖尿病大鼠模型，觀察QUE 對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料QUE （成都必特生物科技有限公司，批號 110878-201611，純度≥98%）；4%多聚甲醛和2.5%戊二醛 （北京索拉比奧生命科學(xué)技術(shù)有限公司）；1%骨微酸（上海哈林生物科技有限公司）；枸櫞酸鉛和2%醋酸鈾酰 （上海榮創(chuàng)生物科技有限公司）；手術(shù)顯微鏡（德國萊卡，型號：M525F40）；微體（德國萊卡，型號：EMUC7）；倒置生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠，型號：37X F）；電泳儀（北京劉毅生物科技有限公司。模型：DYCZ-40D）；蘇木精-伊紅染色（武漢博希德生物工程有限公司）；BCA 蛋白檢測試劑盒、裂解液、PVD F 膜和化學(xué)發(fā)光試劑、Bcl-2、Bax 和P53 抗體（上海貝約時(shí)間生物技術(shù)）。

1.2 方 法

1.2.1 動物造模及給藥 取40 只清潔雄性SD 大鼠（來自南京醫(yī)科大學(xué)動物中心），體重（160±20）g。隨機(jī)分為正常對照組（Normal）、糖尿病組（Model）、低劑量 QUE 組（QUE-L）和高劑量 QUE 組（QUEH），每組 10 只。所有大鼠自適應(yīng)喂養(yǎng) 1 周。糖尿病組、QUE 低劑量組和高劑量組大鼠禁食12 h 后腹腔注射60 mg/kg 鏈脲佐菌素，建立糖尿病模型。正常對照組大鼠注射等量生理鹽水，在72 h 后，用自動血糖分析儀測量尾靜脈血糖，并將＞16.7 mmol/L 的作為成功的糖尿病模型。造模成功后第2 天開始，QUE 組每天腹腔注射QUE，低劑量組10 mg/kg，高劑量組50 mg/kg。正常對照組和糖尿病組大鼠不接受治療，持續(xù)12 周。

1.2.2 視網(wǎng)膜病變的取材及觀察 末次給藥后，給大鼠服用過量的麻醉劑。在立體顯微鏡下無菌摘除右眼球，分離視網(wǎng)膜組織，HE 染色：4%多聚甲醛固定24 h，染色蘇木精5～10 min，用蒸餾水沖洗后，用伊紅染色5～10 min，用蒸餾水再次沖洗玻片，用梯度乙醇溶液脫水后，觀察視網(wǎng)膜病理變化。

1.2.3 視網(wǎng)膜組織SOD 和MDA 水平 分別取每組視網(wǎng)膜組織50 μg，研磨成組織勻漿，低速離心（2000 r/min），再取上清液。按試劑盒說明書加入樣品，混勻。用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD 和MDA 水平。

1.2.4 Western Blot（WB）對 Bcl-2、Bax 和 P53 蛋白表達(dá)水平的影響 取視網(wǎng)膜組織50 μg，在冰上加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液400 μl，研磨30 min提取總蛋白，在10000 r/min 下離心10 min 取上清液，進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；跨膜后，用5%脫脂奶粉在4 ℃下阻滯2 h，加入一次抗體（稀釋比 1∶1000），過夜保存。將二次抗體（稀釋 1∶2000）室溫孵育1 h。利用ECL 化學(xué)發(fā)光進(jìn)行自我開發(fā)，獲取圖像。通過樣品靶蛋白的光密度與內(nèi)參帶光密度的比值，比較不同樣品的相對表達(dá)率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示。組間比較采用單向方差分析。具有方差齊性的2 組比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化正常對照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)外核層細(xì)胞排列規(guī)則； 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織層分辨率差，神經(jīng)纖維層水腫，內(nèi)外核層排列松散； 低劑量組視網(wǎng)膜細(xì)胞基本分層，細(xì)胞排列良好，內(nèi)外核層輕度紊亂；高劑量組與低劑量組相比，大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改善。如圖1 所示。

圖1 見封三。

2.2 大鼠視網(wǎng)膜組織SOD 和MDA 水平糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）。低劑量 QUE 組和高劑量 QUE 組SOD 水平顯著升高，MDA 水平顯著降低 （P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡蛋白表達(dá)水平糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低，Bax和 P53 明顯升高（P＜0.05）。低劑量和高劑量 QUE 組Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著增加，高劑量QUE 組Bax 和P53 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD 和MDA 水平（±s）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD 和MDA 水平（±s）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 QUEL 組比較，＆P＜0.05。

組別Normal Model QUE-L QUE-H F 值P 值n 10 10 10 10--SOD（U/mg） MDA（mmol/mg）564.33±40.57 7.06±1.43 344.51±19.87＊ 24.16±2.46＊442.81±23.51# 17.15±1.29#493.72±38.49#＆ 12.56±1.18#＆77.42 150.76＜0.05 ＜0.05

圖2 見封三。

3 討 論

糖尿病微血管并發(fā)癥主要包括DR 和糖尿病腎病。根據(jù)視網(wǎng)膜是否形成新生血管分為非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變（NPDR）和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變 （PDR）。NPDR 有微血管損傷，出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張和滲漏、棉絮斑、硬性滲等視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常病變［5］。若未予治療，可演變?yōu)樵鲋称?，形成新生血管、玻璃體積血或前視網(wǎng)膜出血，造成患者視力嚴(yán)重下降，增加失明風(fēng)險(xiǎn)。對于DR 的發(fā)生現(xiàn)普遍認(rèn)為高血糖、胰島素抵抗、遺傳因素是主要致病主要因素。葡萄糖的過度轉(zhuǎn)運(yùn)改變視網(wǎng)膜細(xì)胞的生理作用，糖代謝障礙引起毛細(xì)血管基底膜增厚、內(nèi)皮細(xì)胞增生以及視網(wǎng)膜血流量的自我調(diào)節(jié)機(jī)制受損傷。高血糖時(shí)，自由基產(chǎn)生過多，抗氧化系統(tǒng)負(fù)荷過重，從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞、引起血管滲出、刺激新生血管生成等［6］。

視網(wǎng)膜由視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮和視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）組成，任何原因引起的RPE 損傷都會對視覺功能產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的影響。糖尿病患者視網(wǎng)膜組織中的氧化應(yīng)激水平增加，影響視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮和RPE 層的正常生理功能，視網(wǎng)膜對氧化應(yīng)激高度敏感［7］。高糖時(shí)神經(jīng)細(xì)胞增殖活性受抑制，研究表明，QUE 可提高被抑制的神經(jīng)上皮細(xì)胞的增殖活性，減少氧化應(yīng)激損傷［8］。QUE 亦可通過去除體內(nèi)和體外模型的 ROS 來抑制炎癥小體的激活［9］。該研究結(jié)果表明，QUE 干預(yù)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)于糖尿病大鼠。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織層分辨率差，神經(jīng)纖維層水腫，內(nèi)叢狀層、內(nèi)外核層排列疏松。經(jīng)過QUE 干預(yù)后，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列更加規(guī)則。

SOD 和MDA 是人體主要的抗氧化酶，SOD 與自由基清除呈正相關(guān)，MDA 含量可反映自由基水平。該研究證實(shí)，QUE 干預(yù)糖尿病大鼠可提高SOD水平，降低MDA 含量，從而減少病理?xiàng)l件下組織氧化損傷。

細(xì)胞凋亡為細(xì)胞死亡的特殊類型，是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。研究表明Bax/Bcl-2 和P53 蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)中，Bcl-2 起著重要的作用，是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的重要分子，具有潛在的抗凋亡作用。而Bax和P53 的表達(dá)水平直接反映了細(xì)胞凋亡的程度。糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 蛋白減少，Bax 和P53 蛋白增加，表明鏈脲佐菌素可誘導(dǎo)組織凋亡。在QUE 干預(yù)后，Bcl-2 表達(dá)增加，Bax 和 P53 表達(dá)降低，進(jìn)一步證實(shí)QUE 可抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織凋亡。